2 复方中药对成骨细胞增殖及骨密度的影响   2.1 复方中药促进成骨细胞增殖分化中的作用 随着中医药研究的不断深入，运用中药诱导成骨细胞增殖的成果获得了肯定，不少学者在细胞分子水平的药理作用方面开展实验研究，分析中药在细胞分子层面上药物具体的作用机制，为中药治疗骨质疏松提供了分子生物学理论依据。 2003年，张荣华等[17]进行了复方中药对成骨细胞影响的实验研究，采用二次酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞进行培养，取第3代成骨细胞为实验模型，将其分为4组，在各组中分别加入双蒸馏水(对照组)，低(20 mg/L)、中(40 mg/L)、高(80 mg/L)浓度的复方中药提取液。用MTT法(波长570 nm处A值表示)测定细胞增殖功能，用对硝基苯基磷酸二钠法测定碱性磷酸酶活性，用放免分析方法测定细胞培养液中的骨钙素含量，用茜素红染色法，在40倍光镜下作矿化结节计数。结果显示复方中药中、高浓度组的A值在24，48，72 h时明显高于对照组(P < 0.01)，且与药物浓度呈剂量依赖性，低浓度组的A值在72 h时明显高于对照组(P < 0.05)，在24，48 h时与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，不同浓度给药组培养48，72，96 h后，碱性磷酸酶(除低浓度组培养48 h外)、骨钙素均呈不同程度增加(P < 0.01)，在中、高浓度组矿化结节数量/视野，显著多于对照组(P < 0.01)，低浓度组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。因此，复方中药具有促进体外培养的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化及矿化作用，这种作用呈剂量相关性。  近年来学者配伍出许多新的方剂用于骨质疏松的治疗，大部分方剂以补肾活血药为主。姚新苗等[18]用补骨脂、骨碎补、生地黄、仙灵脾、怀山药、丹参等组成复方中药，分为高、中、低剂量组，a-D3对照组及生理盐水空白对照组，制备复方中药含药血清备用。成骨细胞建立采用新生SD乳鼠5只(24 h内颅盖骨)进行体外细胞传代培养，新生鼠的颅骨富含成骨细胞，体外培养细胞生物学特性改变小[19]。已有学者证实体外分离培养的大鼠成骨细胞的成骨过程与体内骨生成过程相同[20]。观察复方中药含药血清对体外培养的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化情况。高、中、低剂量组及a-D3对照组比较无显著性差异，与生理盐水空白对照组比较细胞增殖分化与碱性磷酸酶影响差异有显著性意义(P 。因此，认为益骨汤含药血清具有促进早期成骨细胞的增殖与分化。< 0.05)    鞠大宏等[21]通过观察复方中药左归丸含药血清对成骨细胞的影响，探讨其治疗骨质疏松症的作用机制。体外分离、培养成骨细胞，实验分为3组，正常血清组、卵巢切除血清组、卵巢切除含药血清组，采用原位杂交法，检测成骨细胞骨保护素等的表达。得出在大鼠去势状态下，复方中药左归丸含药血清一方面直接抑制细胞核因子κB受体活化因子配基mRNA的分泌，使破骨细胞活性降低，另一方面促进成骨细胞分泌骨保护素，使之与细胞核因子-κB受体活化因子配基的结合增多，进而使破骨细胞活性降低，从而达到治疗骨质疏松的目的。各组成骨细胞骨保护素、细胞核因子κB受体活化因子配基mRNA的表达，见表1。"

孙晖等[22]进行了复方中药六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究，将六味地黄丸主要血中移行成分以适当浓度添加到大鼠成骨细胞培养液中，用MTT法测定细胞的增殖速度，结果显示，复方中药六味地黄丸主要血中移行成分莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷的混合物各剂量组均明显表现出对大鼠成骨细胞的促增殖作用。因此，初步确定复方中药六味地黄丸主要血中移行成分莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷是其治疗骨质疏松的药效物质基础。2.2 复方中药增加骨密度的效应 骨密度是骨矿代谢中量化骨量的重要指标，是研究骨质疏松和评价药效的重要检测手段[23]。熊学华等[24]探讨复方中药对绝经后骨质疏松大鼠模型血清骨钙素的影响，采用雌性SD大鼠，运用随机对照分组的原则，分别分为正常对照组、模型组、复方中药组及尼尔雌醇组，去双侧卵巢后造绝经后骨质疏松大鼠模型，因为大鼠骨代谢与人存在相似之处[25]，所以对大鼠进行双侧卵巢切除可作为很好的绝经后骨质疏松症模型[26-27]。分别采用生理盐水、复方中药及尼尔雌醇对其进行灌胃，灌胃3个月后采用摘眼球取血，离心分离血清，放免分析法测定其血清骨钙素含量，并行体外右胫骨双能X射线扫描，结果见表2。"

实验研究表明，复方中药能显著提高模型大鼠血清骨钙素水平，并能显著提高其离体骨骨密度，表明其具有促进去势模型大鼠骨形成的作用，而且对松质骨及皮质骨均有影响。 2.3 影响复方中药促进成骨细胞数量增殖及骨密度提高的因素 结果见表3。"

杨林[28]等观察了复方中药对去卵巢大鼠成骨功能的影响，取12周龄Wistar雌性大鼠40只，随机分为A(模型组)、B(治疗组)、C(阳性对照组)、D(正常对照组)4组，每组10只，前3组行完整双侧卵巢摘除，D组行假手术，术后常规饲养12周，再分别予以生理盐水、复方中药水提液、α-D3水溶液及生理盐水灌胃治疗12周，处死大鼠，取血清用放免法测定血清中骨钙素水平，以双能X射线密度仪测定大鼠右股骨上干骺端骨密度，取右胫骨上端做病理切片，通过苏木 精-伊红染色对成骨细胞进行观察比较。 实验结果可见，治疗组血清骨钙素、骨矿含量、骨密度明显高于模型组，苏木精-伊红染色发现其成骨细胞数量明显增加。因此，复方中药能促进骨细胞增殖，增加骨密度，加快骨形成，具有治疗骨质疏松症的作用。 2.3.1 不同性别动物复方中药含药血清对成骨细胞的影响 王威等[29]观察不同性别大鼠的复方中药续断含药血清对成骨细胞增殖的影响。首先制备大鼠含药血清，取雌性与雄性Wistar大鼠各12只，按性别随机分为4组，分别为雄性给药组、雄性对照组、雌性给药组、雌性对照组，每组各6只，给药组按体质量    (4.5 g/kg)分别给予续断水提液灌胃、对照组按体质量分别给予等量生理盐水，灌胃1周后取血，离心提取血清，分离、培养大鼠的原代成骨细胞，将各组大鼠血清稀释为2.5%，5.0%和10.0%3个浓度分别培养大鼠成骨样细胞，采用MTT法检测细胞增殖能力。续断对成骨细胞增殖的影响，见表4。"

结果显示，血清浓度为2.5%时的成骨细胞增殖率，雌性给药组(0.569 0±0.029 5)与雄性给药组(0.361 3±0.098 3)比较差异显著性意义(P < 0.05)，雌性给药组与雌性对照组(0.378 7±0.047 6)比较差异也有显著性意义(P < 0.01)；当血清浓度为5%时的成骨细胞增殖率，雌性给药组(0.879 3±0.100 7)与雄性给药组(0.356 0±0.048 2)比较差异有显著性意义(P < 0.01)，雌性给药组与雌性对照组(0.386 3±    0.018 0)比较差异也存在显著性意义(P < 0.01)；当血清浓度为10%时的成骨细胞增殖率，雌性给药组(0.856 0±0.017 5)与雌性对照组(0.381 7±0.198 6)比较差异有显著性意义(P < 0.05)。在各浓度的血清中，雄性给药组与雄性对照组之间均无显著性差异。因此，认为复方中药具有促进成骨细胞增殖的作用，这种作用在雌性大鼠含药血清中表达强于雄性大鼠，从而其有可能防治绝经后骨质疏松。至于为何不同性别动物复方中药含药血清对成骨细胞增殖影响产生差异有待进一步研究。 2.3.2 不同剂量复方中药对骨密度的影响 周丽珍等[30]将3月龄的雌性SD大鼠，普通饲料喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、尼尔雌醇阳性药物对照组、复方中药小剂量组、复方中药中剂量组、复方中药大剂量组。除假手术组外，其余都经背部切开后切除双侧卵巢，制造去卵巢模型，假手术组则背部切开后切除部分脂肪组织再分层缝合，造模完成后，假手术组及模型组用生理盐水灌胃，阳性药物组用尼尔雌醇混悬液灌胃，复方中药小、中、大剂量组分别给以6.5，13，26 g/kg大鼠体质量(按生药计算)的复方中药液，每日固定在上午九点灌胃1次，全部动物共持续喂养3个月后处死，测定其股骨的骨密度，结果见表5。"