2.1  骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化  如何获取足量种子细胞是骨组织工程研究的重点之一。骨髓间充质干细胞易于获取，易于体外培养和诱导，其成骨能力一直备受重视。通过国内外众多的实验研究，地塞米松、转化生长因子、维生素C、维生素D3等对于骨髓间充质干细胞的成骨分化均有影响，下面将详细介绍。 2.1.1  地塞米松  地塞米松是人工合成糖皮质激素,可以通过增强其受体与基因组靶序列的亲和性,从而调控受体细胞中分化基因的表达，提高碱性磷酸酶活性，促进其向成骨细胞转化。比如，在大鼠类成骨细胞中，地塞米松可以和BSP基因的启动子结合，从而诱导BSP的转录。然而，超过生理剂量的糖皮质激素对体内的成骨组织有毒副作用，会抑制成骨细胞的功能。设计两种培养基进行对照实验[1] ，一组添加地塞米松，浓度从10-11 mol/L到10-6 mol/L；另一组则不添加地塞米松，将骨髓间充质干细胞在两种培养基中培养28 d，结果显示，地塞米松促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的临界作用浓度为10-8 mol/L，与其生理浓度保持一致。更高浓度的地塞米松(超过10-7 mol/L)则会抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，并导致糖皮质激素诱导的骨质疏松[2] 。高浓度的地塞米松也会抑制细胞的增殖，并随其浓度增高抑制作用增强，其原因主要是高浓度地塞米松会抑制胶原蛋白的合成。而当β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素D3，碱性成纤维细胞生长因子，骨形成蛋白2共同作用时可促进骨髓间充质干细胞的生长和成骨分化，其中，地塞米松对骨髓间充质干细胞的矿化作用是必不可少的，当其浓度为100 nmol/L时，可达到最大的钙化作用[3] 。 2.1.2  转化生长因子  研究表明，适宜浓度的转化生长因子β1能有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，是目前调控骨髓间充质干细胞的首选生长因子之一，在影响细胞生长，细胞成骨分化、骨基质合成和骨重建中起着不可或缺的作用，其作用受到Smad3基因的选择性调节。有学者发现，Smad3缺失不会改变转化生长因子β1介导的成骨细胞增殖特性，但是细胞Ⅰ型胶原和骨钙素表达均减少，骨矿质密度降低，骨皮质变薄，骨小梁减少。王运涛等[4]发现野生型Smad3基因能抑制骨髓间充质干细胞的增殖，通过非细胞外信号调节激酶通路促进骨髓间充质干细胞向成骨分化和成熟，说明Smad3不仅可以促进骨形成，而且作为转化生长因子β1的信号转导介质而发挥作用。 骨形成蛋白属于转化生长因子β超家族成员，是一种多功能的细胞生长因子。研究表明，体外骨形成蛋白的作用可能存在种特异性，骨形成蛋白可以促进大鼠和小鼠的成骨分化[5-7] ，但是骨形成蛋白2、骨形成蛋白4和骨形成蛋白7却不能诱导人类骨形成蛋白的成骨分化[8-9] ，骨形成蛋白2、骨形成蛋白4和骨形成蛋白7能够诱导碱性磷酸酶以及非胶原骨蛋白的形成。在促进成骨分化的骨形成蛋白家族中，骨形成蛋白2是最主要的骨形成调控因子。但是天然的骨形成蛋白数量有限，其生物活性难以发挥，因此段智霞等[10]采用了骨形成蛋白2核心功能区合成的寡肽骨形成蛋白2 活性多肽，通过体外培养第3代骨髓间充质干细胞进行实验，结果表明，骨形成蛋白2活性多肽在体外能诱导具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，这种诱导效应存在明显的剂量依赖关系，最佳剂量为200 mg/L，低于此剂量诱导效果不明显，高于此剂量诱导效果不会出现明显增强，不良反应却明显增加。 2.1.3  维生素C  维生素C在细胞外基质中含量丰富，可辅助脯氨酸和赖氨酸残基的羟化，促进基质中胶原合成，参与调节碱性磷酸酶的活性。但是维生素在溶液中不稳定，因此建议使用长效的维生素C衍生物，如维生素C-2-磷酸。研究表明，在维生素C-2-磷酸存在的情况下，骨髓间充质干细胞内和细胞周期以及有丝分裂相关的基因表达上调，有利于骨髓间充质干细胞内的增殖，然而，缺乏维生素C-2-磷酸会导致碱性磷酸酶表达降低，钙离子的积聚受到抑制[11] 。现在，通常在培养基中加入5×10-5-5×10-4 mol/L浓度的维生素C来诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，但是培养基中维生素C的浓度高达10-2 mol/L的时候，也仍然观察不到其对细胞生长的抑制作用[12-14] 。 2.1.4  维生素D3  维生素D3是一类成骨功能必需的开环甾类激素，其活性形式为1，25-D3，在细胞周期中可以有效的阻碍细胞从G1期向S期的转变从而抑制细胞增殖。骨髓间充质干细胞可以促进分化形成的成骨细胞分泌核因子κB受体活化因子配体，减少骨保护素的合成，从而促进破骨细胞分化成熟，破骨细胞数量增加，促进骨吸收[15] 。因此维生素D3可同时调节成骨细胞和破骨细胞的功能，使骨形成和骨吸收达到一个平衡状态。张燕燕等[16]研究表明，设置10-12，10-10，10-8 mol/L 3种浓度的1，25-D3，对骨髓间充质干细胞增殖的影响均表现为7 d内促进增殖，7 d后则抑制增殖，1，25-D3浓度越高，抑制作用越明显。同时，随着测定时间延长，3个实验组的骨保护素的测定值呈现先下降后升高，核因子κB受体活化因子配体的测定值呈现先升高后下降，其中，1，25-D3的浓度越高，骨保护素的浓度越低，而核因子κB受体活化因子配体浓度越高。尽管1，25-D3可以和地塞米松、骨形成蛋白2协同作用促进成骨标记分子的表达，但是当其单独作用时却不能诱导基质的矿物质化。有研究表明龟板提取物可明显促进维生素D受体的mRNA的表达，从而诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 2.1.5  β-甘油磷酸钠  β-甘油磷酸钠可以被碱性磷酸酶水解，是诱导骨髓间充质干细胞成骨分化过程中一种关键的无机磷酸盐。有学者发现在类骨细胞的培养基中，β-甘油磷酸钠可以诱导成骨矿物质形成，促进乳酸的产生，增强碱性磷酸酶的活性，增强蛋白质和磷脂的合成，这些表明β-甘油磷酸钠确实可以增强成骨分化。通常，选浓度5×10-3 -10×10-3 mol/L的β-甘油磷酸钠来诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化。 2.1.6  乙烯雌酚  目前已有研究证实雌激素具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的作用，有实验显示，在体外培养兔骨髓基质干细胞，分别用浓度10-10- 10-5 mol/L的乙烯雌酚干预，并设地塞米松10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50 mg/L为阳性对照。结果发现乙烯雌酚确实可以促进骨髓间充质干细胞向成骨分化，且效果最显著的为10-7 mol/L。乙烯雌酚可以通过抑制成骨细胞凋亡，维持成骨细胞的数量来发挥骨骼系统的保护作用，但是雌激素在人体内促进成骨分化的作用及降低雌激素的不良反应还需进一步研究。 2.1.7  人参皂苷  人参皂苷是人参的主要活性成分，属于三萜类皂苷，与类固醇激素具有相似的基本分子骨架，具有相似的生物活性。根据李德绘等[17]最近的实验结果，人参皂苷Rb1在一定范围内(低剂量时，如0.5 μmol/L)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞具有生长促进作用，但是在高剂量时(6.0 μmol/L)对生长起抑制作用，而对成骨分化具有促进作用。人参皂苷Rb1可以诱导成骨分化的大鼠骨髓间充质干细胞成聚集样生长，还可促进细胞外钙盐的沉积，并且高剂量的人参皂苷Rb1(4.0，6.0 μmol/L)比低剂量(0.5，1.0，2.0 μmol/L)诱导形成的钙化结节面积大，数量多。 2.2  骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化  现在通常采用细胞微团的培养方式，并添加不同的软骨生物活性因子，包括地塞米松、维生素C、转化生长因子β、骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子。其中地塞米松、维生素C和转化生长因子β是最有效的。 2.2.1  地塞米松  糖皮质激素功能由胞质内的糖皮质激素受体介导，可通过诱导转录来影响分化的过程。在Buxton等[18]的研究中，地塞米松可以上调基因的表达，提高软骨基质标记分子的蛋白质水平，尤其是Ⅱ型胶原的水平。然而，与地塞米松和转化生长因子β的复合物相比，单独作用的地塞米松对软骨形成标记分子，比如聚集蛋白聚糖，软骨寡聚基质蛋白和Ⅱ型胶原等几乎没有作用。对于人体原始骨髓来源的骨髓间充质干细胞，含有10-7 mol/L地塞米松的培养基可以成功诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化。 2.2.2  维生素C  维生素C及其衍生物维生素C-2-磷酸可以通过脯氨酸和赖氨酸残基的修正来使胶原羟化，而向培养基中加入维生素C及其衍生物，可以增进骨髓间充质干细胞的增殖，同时促进胶原Ⅱ型蛋白的表达，而胶原Ⅱ型蛋白是软骨基质中最重要的蛋白质。维生素C其本身并不能使骨髓间充质干细胞发生转化，但它可以使细胞分泌的外基质有机的组成与排列，有利于细胞发挥自分泌与旁分泌作用，保证内外源因子的传输，从而具有非特异的促进细胞增殖与转化的作用，目前在培养基中采用较多的维生素C的浓度为50 mg/L[19] 。 2.2.3  转化生长因子  系列转化生长因子(转化生长因子β1、β2、β3) 是一族具有多种功能的多肽，它能够促进细胞增殖，调节细胞分化，促进细胞合成并分泌细胞外基质。转化生长因子β与异源受体复合物相互作用，其中包括了两种结构相关的苏氨酸-丝氨酸激酶，Ⅰ类和Ⅱ类受体，并且可以通过Smad蛋白介导细胞内信号转导。Barry等[20]研究报道，在促进葡糖胺聚糖和Ⅱ型胶原聚集方面，转化生长因子β2和转化生长因子β3诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力强于转化生长因子β1，并将聚集培养的骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的过程分成3个阶段：第1阶段为诱导分化前6 d，标志为纤维调节素及软骨寡聚基质蛋白表达的上调；第2阶段为分化的第7天左右，标志为Ⅱ型胶原和软骨粘连蛋白的表达，同时硫酸软骨素逐渐增多；第3阶段为随后7 -14 d，糖胺多糖逐渐累积，最终形成成熟的软骨细胞。另外也有学者则提出转化生长因子β的任何亚型都和活化的软骨分化因子一样具有等同的效果。同时单层培养基中骨髓间充质干细胞的软骨分化依赖于转化生长因子β1的浓度，邓进等[21]的实验说明不同浓度的转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞具有不同的诱导效率，10 μg/L 转化生长因子β1可能是骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的最佳诱导浓度。 骨形态发生蛋白是转化生长因子β的超家族成员之一，它具有诱导骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞的能力。骨形态发生蛋白在软骨祖细胞的测定以及诱导分化的骨形态发生的过程中都必不可少。在Richter[22]的1项研究中，骨髓中骨髓间充质干细胞成功向软骨细胞分化，只需要添加地塞米松和转化生长因子β，然而对于起源于脂肪组织和滑膜组织的骨髓间充质干细胞，其分化还需要额外补充骨形态发生蛋白6。Minehara等[23]的研究表明，骨形态发生蛋白2可以有效的促进大鼠股骨骺软骨细胞迁移至新月板，并且具有剂量依赖关系，可以将软骨细胞的迁移提高到10 μg/L，3周之后，迁移的软骨细胞合成的外基质可以达到3 mm厚。张清林等[24]通过取健康Wistar大鼠骨髓，全骨髓贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞，体外培养传代并鉴定，结果说明转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化，分泌软骨特异性基质。骨形态发生蛋白6在正常人的血浆中循环，由于有独特的受体及信号特征，在体内诱导动物软骨缺损再生的需要量远小于骨形态发生蛋白7[25] 。 2.2.4  胰岛素样生长因子  胰岛素样生长因子家族由2种多肽组成，即胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2。其合成受生长激素的调控，胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2生物学特征相似，但胰岛素样生长因子1作用较强。胰岛素样生长因子1是一种强有力的合成代谢刺激因子，可显著促进有丝分裂，促进软骨细胞增殖和成熟，同时也可以促进合成软骨基质蛋白多糖，延缓基质的降解并能抑制软骨细胞的凋亡，并促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。1 mg/L胰岛素样生长因子1即可良好地促进体外组织工程学软骨的形成，阻止软骨细胞凋亡，但是胰岛素样生长因子1的半衰期短，在体内环境中很快被降解，而在体外环境中功能可以保持较长时间。Huang等[26]通过实验测定，胰岛素样生长因子1在质量浓度为5-20 μg/L的情况下，可以有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，具有剂量依赖性，同时上调CXCR4基因的表达，加速骨髓间充质干细胞的迁移。不过，在胰岛素样生长因子1单独存在的情况下，其对骨髓间充质干细胞的分化促进作用不明显，说明可能需要在其他因子的共同作用下，胰岛素样生长因子1才具有促进软骨分化的作用。 2.2.5  成纤维细胞生长因子  成纤维细胞生长因子普遍存在于多种器官组织中，免疫组化方法发现成纤维细胞生长因子阳性表达部位主要在细胞和细胞外基质。它能促进软骨基质，特别是Ⅱ型胶原的合成，并阻止蛋白聚糖的降解。有学者用含成纤维细胞生长因子(10 μg/L)的培养液和不含成纤维细胞生长因子的培养液培养软骨细胞，传代培养3周，发现含成纤维细胞生长因子实验组的细胞总数为无成纤维细胞生长因子实验组的2倍多，并且成纤维细胞生长因子实验组表现出良好的体内软骨形成能力。Isogai等[27]的实验进一步表明持续释放的成纤维细胞生长因子可增强新血管形成和软骨分化，在组织工程软骨形成中起到重大作用。成纤维细胞生长因子主要是通过旁分泌机制发挥作用，是目前发现的最强的促细胞生长因子，可以促进骨髓间充质干细胞增殖，促进软骨细胞前体的分化以及软骨细胞的增殖和分化成熟。 2.3  骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化  研究体外生成脂肪细胞不仅有利于组织器官工程，还有利于某些疾病比如肥胖症、糖尿病、再生性贫血以及缺铁性贫血等疾病发病机制的研究。因此骨髓间充质干细胞分化为脂肪组织工程研究将提供诱人的发展前景。目前常规促进骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的培养基中主要含有地塞米松，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，胰岛素和消炎痛，或者这几种物质混合起来共同使用。 2.3.1  地塞米松  糖皮质激素地塞米松可以诱导转录因子C/EBP和过氧化物酶体增殖物激活受体的聚集，而转录因子C/EBP和过氧化物酶体增殖物激活受体2对于脂肪前体细胞转化为脂肪细胞至关重要。过氧化物酶体增殖物激活受体是一种成脂因子，属于核激素受体亚族，与核受体家族中大多数成员一样，活性由配体调节，在脂肪细胞前体中不表达，但在脂肪分化过程中表达并且优先于其他大多数脂肪基因的表达。曹亚伟等[28]实验显示，地塞米松浓度为1× 10-7 mol/L时过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA的表达明显高于地塞米松浓度为1×10-8 mol/L组，说明地塞米松浓度为1×10-7 mol/L可促进骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。地塞米松在10-8 mol/L时，成骨特异性基因表达水平升高，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，因此说明地塞米松对骨髓间充质干细胞的分化具有双向诱导作用，并且这种作用具有剂量依赖性。 2.3.2  3-异丁基-1-甲基黄嘌呤  3-异丁基-1-甲基黄嘌呤是磷酸二酯酶的特异性抑制剂，通过抑制cAMP的降解而提高胞内cAMP的水平。而cAMP是一种十分重要的脂肪诱导剂，它可通过激活cAMP反应元件结合蛋白来调控C/EBPα和C/EBPβ表达，并进而促进脂肪细胞的产生。 2.3.3  胰岛素  胰岛素也可通过调节ERK1/ERK2信号传导途径以及降低核蛋白磷酸酶PP2A的活性来调节cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化和转录活性。 cAMP反应元件结合蛋白的激活不仅可以促进C/EBP的表达，也能够增加过氧化物酶体增殖物激活受体2的表达。从信号传递的角度来看，激活p38信号途径、抑制p42/p44途径有助于脂肪细胞的分化[28] 。 实验表明，同时给予3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和消炎痛时，可促使骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，可能与这些细胞表达过氧化物酶体增殖物激活受体2、脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白αP2相关。油红O为特异性的脂质结合剂，因而被用来检测脂肪细胞。焦嫦亮等[29]的实验显示，未经诱导的骨髓间充质干细胞油红O染色均为阴性，但以上4种诱导剂合用可诱导96%以上的骨髓间充质干细胞定向分化为脂肪细胞，并且所生成的脂肪细胞含有丰富的脂肪颗粒，绝大多数脂肪细胞的脂肪颗粒充满整个细胞，而单用地塞米松仅诱导6%左右的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。因此，建议4种试剂联合使用培养骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的分化。通过对照试验，在培养基中添加500 μmol/L的维生素C-2-磷酸可以最大程度地实现脂肪的聚集[30] 。"