2.1 纳入文献基本情况 纳入的36篇文献中，中文文献7篇，英文文献29篇。文献[1-9]主要涉及人和动物细胞三维培养的概况，文献[10-25]心肌细胞三维培养的研究进展，文献[26-36]探讨心肌细胞三维培养存在的亟待解决的问题。 2.2 人和动物细胞三维培养的一般概况 动物和人细胞的三维培养几乎涉及到所有组织和器官，包括上皮组织、肌组织、结缔组织和神经组织，目前研究最多的是结缔组织(包括骨、软骨、脂肪等)和上皮组织。Qiu等[1]用可降解的中空生物陶瓷微球作为支架，培养成了骨细胞的前体细胞，获得了三维骨组织，并成功进行了骨移植实验。Kamil等[2]尝试在体外运用三维培养技术构建人类的耳郭软骨和鼻软骨，首先制造与实际尺寸一样的人耳郭和鼻尖外形的支架，然后将分离所得的牛肩关节软骨细胞种植在支架上并以丙烯酸涂层提供内部的支持。在12周的体外培养期间，支架保持了其形态和尺寸，并逐渐为软骨组织取代，从而培养出了成人尺寸的人耳郭和鼻软骨样结构。陈家琪等[3]原代培养人角膜上皮、基质和内皮细胞，利用生物工程技术体外重建人工角膜，代替常规角膜移植治疗角膜疾病。Suuronen等[4]证明组织工程化的人工角膜与在体角膜一样可促进神经内生，并且再生神经形态正常，可与靶细胞连接，并能产生动作电位，对理化刺激敏感。张小猛等建立了成熟视网膜神经节细胞的三维培养模型，为体外研究视网膜神经节细胞的生理学和药理学奠定了基础[5]。Mahoney等[6]观察到在三维培养系统中神经细胞可以形成适于自己生存的微环境，从而可以增殖和分化，以及在神经元和神经胶质细胞之间借助神经递质发生联系。刘志国等[7]运用三维培养技术培养的人皮肤成纤维细胞虽然增殖缓慢，但生物学活性良好。王丽等[8]将分离的子宫内膜基质细胞和上皮细胞依次种植于生物可降解的杂交聚合网支架上，建立了体外子宫内膜的三维模型。运用三维支架培养的自体皮肤等价物，对治疗慢性伤口以及深而广泛的烧伤，疗效似乎是最好的。该皮肤等价物可以分泌生长因子促进伤口愈合，并且比常规疗法有更好的美学效果[9]。此外，有人将脱去供体皮肤中的表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞的异体真皮基质，经过冷冻干燥制成三维的生物补片。目前，已有不少三维培养的细胞或组织用于临床治疗，如泌尿系统的膀胱及输尿管的缺损修复，心血管系统的瓣膜修复，神经外科的硬脑膜损伤的修复等。 2.3 心肌细胞三维培养的进展 随着冠心病及先心病对人类威胁日益加重，受损心肌的替代治疗已成为医学研究领域急需解决的难题之一。目前的治疗手段尚不能有效解决心肌再生问题，故近年来通过细胞移植来修复受损的心肌组织的研究已被高度重视。心肌细胞移植即将健康的心肌细胞种植到受损的心肌上来修复心肌组织，改善心肌功能[10]。但是，心肌细胞移植存在许多尚无法解决的弊端。例如，移植的心肌细胞通常仅形成小岛样的细胞聚合体，与宿主组织整合较差；移植的体外心肌细胞容易因血液冲刷及缺氧发生凋亡和坏死，这就需要不断地注入新鲜的心肌细胞；另外，移植的心肌细胞还容易造成肺、肾及脑的毛细血管栓塞[11]。这就限制了心肌细胞移植的发展，从而为心肌细胞的三维培养，开发心肌补片提供了发展空间。心肌细胞的三维培养即是将心肌细胞接种到可降解支架上，在体外制造出心肌组织块的方法。心肌细胞三维培养的发展为病损心肌的修复提供了新的可能。 随着组织工程的发展，心肌细胞的三维培养技术发生了质的飞跃。刘兴茂等[12]利用旋转式细胞生物反应器模拟微重力条件进行心肌细胞的体外培养，构建了具有同步自律收缩的三维组织。Leor等[13]利用三维的有孔的藻酸盐支架，将乳鼠心肌细胞种入该支架中，得到了心肌细胞片，其中的细胞可以自发的收缩，将心肌细胞片移植到有梗死区的大鼠模型上，一些细胞分化成了成熟的心肌纤维，增强了梗死区心肌的功能。移植的细胞片减弱了心室的扩张程度及心衰的程度，并且移植的心肌细胞片有新生血管形成，这就有助于心肌细胞片的长期存活。但是这种心肌细胞片的潜在不足是不能很好控制其形状及大小，而且形状大小不适宜的心肌细胞片会干扰心肌的收缩功能。Freed等[14]将新生鼠心肌细胞接种到可降解聚合物支架上，体外培育数周后形成了具有收缩能力的心肌组织。Carrier等[15]对细胞接种和组织培养条件如何影响工程化心肌复合体结构和功能进行研究，证明了工程化心肌在体外培育一两周后，开始表达心肌特异性蛋白，并呈现出心肌的超微结构特点，同时，移植细胞开始具有与自体心肌细胞相似的代谢活性。藤伟等[16]在Atelocollagen胶原支架上三维培养具有收缩功能的乳鼠心肌细胞块，在整个培养过程中，心肌细胞始终保持良好的自律性收缩。Yamato等[11,17]将温敏的聚合物PIPAAm(聚异丙基丙烯酰胺)嫁接到普通商用的聚丙乙烯培养皿表面，在37 ℃下各种类型的细胞都能够粘附和增殖。当温度下降到低于32 ℃，融合的细胞、完整的细胞与细胞连接以及细胞外基质一起从培养皿表面自动脱离，形成单层连续的细胞片。将用此方法收获的细胞片进行堆叠，已经重建出多种组织。而且证明，该细胞片移植至宿主，可与宿主形成形态上的连接。这种方法制成的三维组织避免了固体支架中存在的细胞迁移不充分而易发生炎症反应等缺点。细胞片工程由于无需使用支架，能很好的作为组织工程的补充。细胞片工程已经在角膜、牙周膜、肺漏气修复等多个方面获得了成功，细胞片的制备技术也在不断改进，细胞片工程的专用仪器已经问世。随着组织工程的发展，细胞片工程必将成为再生医学的重要工具[18] 。细胞片工程面临的一大难题即细胞片的厚度及血管化的程度。之前的研究表明，单层内皮细胞可促进体内毛细血管的形成，因此推断，在形成的两层心肌细胞之间加入一层内皮细胞可以促进血管网络的形成。最近研究表明，在动物模型中，将形成的心肌细胞片移植到受损的心肌处，可以增强受损心肌的功能[19]。所以，可以采用多次移植的方法来达到增加心肌细胞片的厚度这一目的[20]，目前这种方法移植的心肌细胞片厚度已达到大约80 μm，但这一厚度对心肌的功能需要还有一定距离。 心肌细胞的三维培养领域除了心肌组织的培养，还涉及血管培养、瓣膜培养及细胞为基础的心脏泵和组织工程化心室的体外培养。血管的培养包括片状血管和管状血管，片状血管主要作为补片来修复动脉瘤中发生破损的血管，而管状血管则可以直接替换受损血管。随着组织工程的发展，血管的三维培养技术也不断发展，其爆裂强度也从最初的300 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)上升到2 000 mm Hg[21-22]。目前大量应用金属瓣膜由于存在血栓栓塞形成的巨大风险，生物瓣膜的诞生就显得十分必要，但是要制成形态、大小完全合适的生物瓣膜仍需进一步的努 力[23]。细胞为基础的心脏泵和组织工程化心室是当心肌细胞节律收缩时能够形成一个有压力的腔从而应对心肌细胞收缩时产生的压力这样一个装置[24]。这个装置可以模拟正常哺乳动物心脏的压力泵功能，为基础研究提供一个直观的模型，更有助于学习心肌细胞功能重塑的形成过程[25]。"

心肌三维培养存在的问题 3.1 缺乏理想的种子细胞 寻找满足要求和易于操作的种子细胞是三维培养的关键环节。理想的种子细胞应该是容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、且具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的潜能，并且还可以促进新血管的形成。常用的种子细胞主要有：①胎幼心肌细胞 ：胎幼心肌细胞是研究最早最广泛的种子细胞。但胎幼心肌细胞作为种子细胞其来源受到限制，并且存在异体移植带来的免疫排斥问题。②心脏自体细胞：心脏自体细胞移植有更大的潜力达到与自体心肌同步收缩，Akhyari等[26]研究表明在体外心肌细胞可以重建复杂的三维结构，但是这种方法获得心肌细胞肌丝排列紊乱，细胞无收缩功能。③胚胎干细胞：胚胎干细胞已经证实具有向心肌细胞分化的潜能，但是存在异体移植的免疫排斥问题，此外，人类胚胎干细胞移植还涉及伦理学方面的问题。④骨骼肌卫星细胞：骨骼肌卫星细胞同样来源有限，纯化困难，而且其数量和有丝分裂的潜能随着年龄的增长进行性下降等问题。⑤骨髓间充质干细胞 ：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，能分化为成骨、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞，是目前最有发展前景的种子细胞。尽管种子细胞的研究取得了很大的进展，但是人们对种子细胞的了解仍然存在许多误区，技术上也存在很多挑战，还需要在大量的基础实验中多方探究。 3.2 支架材料需要进一步完善 种子细胞的空间立体生长要求有支架的依附，支架使种子细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系，并可以提供信号诱导细胞的生长和分化。因此，支架的形态和功能直接影响所构成组织的形态和功能。细胞支架材料是组织工程的基础，是组织工程领域中一个不可或缺的环节，理想的支架材料应该具备：①良好的生物相容性，在体内不引起炎症反应或致畸反应而影响新组织的功能。②生物可降解性，且降解速率与细胞组织生成同步。③无免疫原性和毒性。④要维持细胞的形态和表型，并可以促进细胞黏附与增值，诱导组织再生。⑤具有一定的孔隙率和比表面积。⑥在一定时间内可以保持外观和结构的完整性。⑦具有符合细胞、组织器官要求的生物力学强度。现有的支架材料来源主要分为天然和人工两大类。 理想的高分子合成材料致支架不仅应该具有良好的相容性(包括组织相容性和血液相容性)、高度多孔的超微结构(便于细胞生长、营养物质的供应和代谢废物的移除)，而且应具有诱导细胞粘附、迁移、增殖和分化以及细胞外基质合成与重构的潜能[27]。因此，能真正模拟细胞外基质的智能化支架材料的研究仍任重道远。 常用的天然生物降解材料主要有丝素蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐、琼脂糖凝胶、小肠黏膜下层等。天然生物降解材料是指来源于动植物或人体内天然存在的可生物降解的大分子。天然生物降解高分子材料是人类最早使用的医用材料，具有良好的生物相容性且降解产物无毒。天然降解材料虽然具有上述的许多优良性能，但仍存在一些不足，如力学强度较差、降解时间难以控制、性能随批次不同而有差异等。而合成可降解性高分子材料的微细结构、机械性能及降解时间都可以预先设计和控制，因此，生产重复性好，是目前组织工程所用生物材料的主要研究及应用对象。目前合成的材料主要有聚乳酸、聚羟基乙酸，聚乙二醇，聚羟基乙酸聚乳酸聚合物等，但这些合成材料在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性方面尚有许多问题未得到解决。 3.3 三维化心肌的厚度和大小尚不能满足实际需要及血管化 对于临床应用，心肌组织块面积应该达到10-50 cm²并且要达到几个毫米的厚度[28]。许多组织工程技术制造了面积足够大的组织，但是厚度以及血管化仍然不能达标，而限制组织块厚度最重要的因素是组织块达到一定厚度后，其深层细胞得不到充分的氧供。氧供的充分与否又取决于培养基中的营养物质是否可以在组织块中充分的扩散，许多研究者试图克服这一难题。Dvir等[29]发明了一种灌流生物反应器，这种装置利用一个逆流分布的网格，可以将培养基最大限度的均匀的分布于细胞之间，这样以来细胞就有了充分的氧供，也就提高了其生存能力。Radisic等[30]将细胞种到多孔支架上，该支架内充满成矩阵排列的管道，这样就有利于培养基的流动，而且这些管道也为未来血管的生成提供一个依托。充分的氧供增强了细胞的增殖与分化能力，同时还使得管道周围的细胞形成一个致密的细胞层。然而，培养基的充分扩散并不表示血管可以形成，而且移植前血管化的程度至今仍旧有争议[31]。新近的研究发现，体外培养的心肌细胞间有血管形成，它们可能来源于在心肌细胞分离过程中残存的内皮细胞[32]。这一结果提示，如果分离的细胞成分包含内皮细胞，是有可能在不施加其他条件的情况下形成毛细血管的，问题是如何保证适当的细胞比例尚待研究。总而言之，可供移植的心肌组织块及时有效地与宿主建立血管联系是心肌组织工程的一个仍然没有攻克的难题。 3.4 构建的心肌组织块的功能需求与检测 在体外制造一个心肌组织的完美复制品虽然不是轻而易举的，但构建的心肌组织块如果应用，则必须满足正常哺乳动物在体心肌组织的所具有的各种生理机能[33]。①该心肌组织块中必须包括正常心肌组织所包括的各种细胞类型。②所有生物材料必须与心脏的细胞外基质有很好的生物相容性。③具有良好的生物可降解性，可以安全地从机体移除。④该组织应用后不会产生血栓并且机体不会产生免疫反应。⑤从功能学、生物学、组织学上进行评价，须与正常心肌组织相当。⑥该心肌组织须能承受心血管系统复杂的流体环境产生的生理应力。 无论是电刺激还是机械刺激引起的心肌细胞的收缩都与心肌细胞的方向、长度、Cx43以及心肌细胞的特异的超微结构-横纹有关[34, 35]。但是组织学鉴定又不能作为移植组织与宿主发生了耦合的证据，因为不能排除电接触的单传播的可能性[36]。目前尚无理想的方法来检测三维心肌植入受体后是否与宿主发生电-机械关系。"