2.1   造血干细胞移植后的免疫重建机制   免疫重建是造血干细胞移植后患者恢复的一个重要进程，受多种因素影响和调控。由于大剂量放化疗或其他免疫抑制剂的移植预处理，患者在移植后失去了自身原有的细胞免疫功能。在造血功能重建之后，粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等固有免疫防御屏障也快速恢复，而淋巴细胞的适应性免疫功能重建却明显滞后于细胞数量的恢复，往往需要数月甚至更长的时间，故此缺乏针对巨细胞病毒的特异性免疫应答反应。在适应性免疫应答中，T细胞既是抗原特异性的细胞毒效应细胞，在清除病原体(如病毒)感染细胞和异常分化细胞过程中发挥重要作用，也是体液免疫功能的调节者，受抗原刺激的B细胞在分化成熟过程中需要依赖T细胞释放的细胞因子；T细胞还可进一步激活固有免疫细胞如吞噬细胞等，从而更有效地杀死病原体。因此，促进T细胞应答库多样性的恢复，是免疫重建和抗病毒治疗优化的关键，这是当前的研究焦点和热点问题。  移植初期，患者体内会有一些来源于供者的初始T细胞和记忆细胞，以及预处理后残留的受者成熟T细胞，这些T细胞可以快速转化为效应细胞，为机体提供短暂却不完整的免疫保护作用。然而，稳定持久的免疫重建需要通过胸腺选择才能实现[4]。研究证实，异基因造血干细胞移植患者免疫重建障碍的主要根源在于移植相关性的胸腺功能衰竭[5-6]，移植后新生的初始T细胞只有在经过胸腺的阴性和阳性选择之后，才能分化发育为成熟T细胞形成完整的免疫系统。但是，胸腺功能可能因个体衰老或病理损伤而衰退，导致成熟T细胞的输出量减少，细胞免疫功能下降[7]。相对于胸腺再生能力较强的儿童，成人患者在移植后由于胸腺成熟而恢复较慢。此外，预处理放化疗、免疫抑制治疗和移植物抗宿主病均会对胸腺上皮微环境造成急性损伤，表现为胸腺细胞减少和基质细胞成分改变，导致T 细胞再生延迟。移植物抗宿主病还可干扰胸腺细胞的成熟，表现为胸腺萎缩退化、胸腺小体消失和皮髓质差别消失，严重阻碍了T 细胞的正常发育。 随着对增龄性胸腺衰退和移植后胸腺损伤的认识，如何重建胸腺功能促进T细胞再生，对于维持T细胞免疫应答至关重要。既往的研究主要集中在细胞因子对胸腺再生的刺激作用[8]，如角化细胞生长因子和白细胞介素7。角化细胞生长因子可能通过改善胸腺微循环促进免疫重建[9]，白细胞介素7虽是维持体内T细胞内稳态的重要因子[10]，但高浓度的白细胞介素7是否能增加胸腺细胞输出，尚缺乏证据；另有研究报道，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与白细胞介素7融合的细胞因子(GIFT7)可促进CD44intCD25-双阴性胸腺祖细胞的扩增和巨细胞病毒特异性T细胞数量增加。最近研究发现，上调胸腺上皮细胞特异性转录因子(FOXN1)基因、过继性输注胸腺上皮祖细胞样细胞能逆转增龄性胸腺衰退，而c-Met和Wnt/β-catenin信号通路可能参与调控胸腺再生。然而，上述方法对于胸腺功能的恢复成果有限，因此迫切需要探索进一步的方法。 2.2   巨细胞病毒感染/再激活的主要机制   巨细胞病毒感染的细胞类型十分广泛，其中CD34+造血干细胞和间充质干细胞容易感染巨细胞病毒，是巨细胞病毒在体内终身潜伏、重新激活和扩散传播的主要站点。更为严峻的是，间充质干细胞受染后功能受损，对机会性感染的防御能力也显著降低，以致移植患者体内呈现出巨细胞病毒特异性的免疫缺陷状态，在患者免疫重建以前，这种免疫缺陷状态会持续存在很长一段时间。此外，巨细胞病毒感染还常侵犯体内多个脏器或系统，其中以肝、肺损害最多见。研究者发现巨细胞病毒肺炎并非产毒型的感染，不会引起病毒的激活和传播，而肝脏组织中却可以检测到巨细胞病毒的广泛性裂解复制。因此，造血干细胞、间充质干细胞、肝脏组织是研究巨细胞病毒潜伏/持续感染所需的细胞和组织来源。 移植后巨细胞病毒感染主要是由移植前血清学阳性患者(R+)体内潜伏的巨细胞病毒重新激活所引起的，而移植前血清学阴性患者(R-)的原发感染主要源自血清学阳性供者(D+)的造血干细胞，由于现行的献血者筛查防范和去白细胞血制品的广泛应用，输血传播的巨细胞病毒原发感染已很少见。巨细胞病毒再激活大多发生在移植后早期(<100 d)，但移植后期也可能因为移植物抗宿主病的强化免疫抑制治疗，或因巨细胞病毒本身及抗病毒药物对造血的抑制作用，导致机体免疫重建延迟，巨细胞病毒反复再激活而呈持续性症状感染。目前已知供、患者的巨细胞病毒血清学状态可以直接影响移植后巨细胞病毒感染的发生率和移植预后。例如，当供者阴性、患者阳性(D-/R+)时，因移植物中几乎没有巨细胞病毒特异性T细胞，移植后巨细胞病毒感染的概率会明显增高；而供、患者巨细胞病毒均为阳性(D+/R+)时，因移植物中含有大量的巨细胞病毒特异性T细胞，移植后巨细胞病毒感染的概率会明显降低。 2.3   当前巨细胞病毒感染/再激活的治疗现状   移植后巨细胞病毒感染/再激活的治疗仍是目前临床工作中较为棘手的难题。虽然近年来有新的病毒检测技术和治疗手段，但从诊断到治疗仍存在很多问题。巨细胞病毒感染治疗的最终目标是避免病毒反复重新激活、降低病毒载量以及阻止或减轻巨细胞病毒终末器官病变的发生，但现有的治疗手段十分有限，疗效也不甚理想。过早停用或者减少免疫抑制剂可能增加移植物抗宿主病的风险；阿昔洛韦、更昔洛韦等抗病毒药物虽然能抑制病毒复制，但不能完全清除病毒，对高负荷的病毒载量(> 500 IU/mL)和巨细胞病毒症状性感染往往无效，单用易产生耐药性，如给予普遍性预防则有发生迟发性巨细胞病毒病的潜在危险。此外，药物的不良反应如更昔洛韦的骨髓抑制和膦甲酸钠的肾毒性也令人担忧，抗病毒药物的骨髓抑制作用不仅阻碍了造血恢复，还影响了细胞毒性T淋巴细胞的产生，以致机体自身的免疫防御功能被削弱或延迟。因此，即使积极给予药物治疗，死亡率仍较高。近年陆续推出的抗病毒新药包括Maribavir、Letermovir、CMX-001等，尚无大样本的临床研究数据证实疗效。 临床研究显示，与血清学阴性供者(D-/R+)相比，血清学阳性供者(D+/R+)的移植物中因富含巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞，可以发挥过继性的抗巨细胞病毒作用，巨细胞病毒感染的概率明显降低[11]。鉴于此，国内外开展了多项供者巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞输注治疗的临床试验，均能取得一定的疗效[12-13]。北大人民医院血研所团队发表的最新研究提出，供者巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞能促进受者内源性的巨细胞病毒特异性免疫重建，有免疫保护作用[13]。另有临床试验证实，输注供者抗原特异性的巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞能够过继转移抗病毒的免疫功能[14]，治疗安全且有效，但是由于制备时间长且操作繁杂而无法规模化使用。研究还发现，巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞单次输注的复发率较高，为30%-50%，重复输注可能在一定程度上延缓或避免复发。究其原因，其疗效主要还是受制于患者体内的巨细胞病毒负荷和免疫受损程度，只有促进早期免疫重建，才能激发机体产生巨细胞病毒特异性免疫应答，真正有效地长期控制病毒复制，以实现稳定持久的抗巨细胞病毒效应。 2.4   机体免疫重建与巨细胞病毒感染/再激活的相关因素   目前已知移植后免疫重建是一个高度复杂而有序的动态变化过程。一方面， 病毒血症需要免疫重建来控制和清除，另一方面，巨细胞病毒特异性免疫应答建立又需要来自巨细胞病毒抗原的刺激[13，15-16]。如D-/R-组合因为缺乏病毒抗原的刺激，不会发生巨细胞病毒特异性免疫应答[17]；倘若有巨细胞病毒抗原的持续刺激，供者巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞也可能会在受者体内不断增殖形成持久的病毒学应答，从而有效控制巨细胞病毒感染[13]。以免疫重建不佳或不稳定重建是巨细胞病毒反复再激活的主要发病机制，而巨细胞病毒感染/再激活又反过来会对移植后免疫重建规律产生影响。机体的免疫状态是巨细胞病毒激活的关键因素，造血干细胞移植后的免疫重建是一个缓慢的过程，研究已经证实移植后细胞免疫重建较早，主要包括T淋巴细胞和自然杀伤细胞重建，在移植早期T细胞的功能直接影响造血干细胞移植后早期并发症的发生，对移植早期巨细胞病毒激活尤为关键。移植后免疫重建延迟增加了巨细胞病毒的激活率，不利于机体的抗病毒免疫。已经有大量的临床证据表明，细胞免疫特别是T细胞介导的免疫应答在机体防御巨细胞病毒感染中起着核心的作用。移植过程中患者自身免疫系统被清除，而供者免疫系统重建需要数月甚至更长时间。患者一旦获得免疫重建就能拥有健康完整的适应性免疫应答体系，不需要抗巨细胞病毒药物治疗也能自发清除巨细胞病毒的亚临床激活，但在还未获得免疫重建之前或免疫重建不全时，巨细胞病毒感染/再激活的发生风险很高。 在免疫重建过程中，与巨细胞病毒感染相关的影响因素主要有以下几个方面：细胞毒性 T 细胞多为CD8+的细胞毒性T细胞[16]，它通过主要组织相容性复合物限制性识别病毒肽复合物发挥杀伤效应，此过程有赖于CD4+ Th细胞的辅助；在首次清除病毒抗原之后，一部分T细胞需要分化为记忆性细胞毒性 T 细胞群，才能在再次免疫应答反应中发挥重要作用。更重要的是，病毒血症与免疫重建之间还存在双向调控的关系，病毒血症需要免疫重建来控制和清除，而免疫重建也需要病毒抗原来刺激抗原特异性T细胞的增殖活化。临床研究中发现：①当供、患者均为血清学阴性(D-/R-)时，因缺乏病毒抗原的刺激，患者体内不能检测到抗病毒免疫应答反应；②受低水平病毒抗原的不断刺激，第三方细胞毒性 T 细胞有可能会在患者体内增殖活化，形成持久的病毒学应答；③若病毒抗原持续存在，也可能会发生T细胞功能性耗竭，丧失其活化增殖能力、细胞因子分泌功能和细胞毒作用，导致免疫保护功能障碍，巨细胞病毒再发感染的风险增高。另外，移植物抗宿主病的发生及强化免疫抑制治疗均可导致免疫重建延迟，造成持续性症状感染。这些研究表明，T细胞免疫重建不佳或不稳定重建是巨细胞病毒反复重新激活的主要危险因素，而巨细胞病毒再激活也会对免疫重建的基本规律造成干扰。 2.5   间充质干细胞发挥生物学作用的机制及局限性  "

2.5.1   间充质干细胞发挥生物学作用的机制   在一系列研究进程中，最具有临床转化潜力的科学发现是间充质干细胞。间充质干细胞是维持骨髓生态中的关键元素，其能够提供物理支持并分泌可溶性因子来控制和维持造血干细胞[18]。间充质干细胞联合移植可改善造血干细胞的治疗效果[19]。作为一种重要的免疫调节细胞，间充质干细胞可以改变炎症环境，上调脾脏和肝脏中CD4+IL-10+IFN-γ+ T细胞的产生并下调血清白细胞介素27水平[20]，抑制T细胞、B细胞、自然杀伤细胞的增殖，调节Treg/Th17，Th1/Th2等平衡，诱导移植后的免疫重建，通过选择性阻止免疫细胞迁移并下调趋化因子和趋化因子受体来调节免疫重建[21]。尤为独特的是，间充质干细胞具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，在不同条件下可诱导分化为多种造血细胞以外的组织细胞，正是这种多向分化潜能使其在组织修复中发挥重要作用，它既可以诱导分化为很多组织细胞，直接修复替代损伤的组织，也可以通过旁分泌效应，分泌细胞因子参与组织修复。理论上而言，早期应用间充质干细胞治疗巨细胞病毒感染，有利于机体免疫重建的恢复，及时阻断巨细胞病毒感染/再激活，也能发挥免疫调节和组织损伤修复功能，有效控制病情，恢复正常的生理功能。另外，间充质干细胞来源广泛、免疫原性低、没有主要组织相容性复合体的限制性、取材方便、无道德伦理问题限制、易于体外培养制备等优点，应用前景十分广阔。除此之外，间充质干细胞在造血干细胞移植后的移植物抗宿主病、自身免疫性肝病、系统性红斑狼疮等疾病的治疗上也显示出一定的应用优势和前景。 2.5.2   间充质干细胞的局限性   尽管间充质干细胞在临床具有广泛的应用，但在其应用过程中也暴露了其局限性：体外扩增效率差异大；培养需时较长，无法及时满足病情需要；危重患者的疗效较差；需要多次回输；即便治疗有效也可能因脏器功能衰竭而最终死亡等，这些问题制约了间充质干细胞的应用发展。间充质干细胞日益凸显的局限性，源于对间充质干细胞的作用机制了解甚微，尚不足以准确高效地指导临床应用。当前，迫切需要研发调控间充质干细胞增殖、迁移、分化和免疫抑制功能的关键技术，提高疗效和无病生存率。此前有研究发现，间充质干细胞经体外扩增培养后回输，在受者骨髓中无法检测出外源性的间充质干细胞。随后的动物实验证实，外源性间充质干细胞回输后很快迁移至淋巴组织或组织损伤部位，发挥组织修复功能和免疫调节作用。 2.5.3   miR-21在间充质干细胞生物学行为中发挥的作用   最近研究表明，间充质干细胞的效应主要由细胞外泌体介导[3]。 间充质干细胞来源外泌体在组织损伤部位发挥作用，能促进转化生长因子β诱导的CD4+CD25-T淋巴细胞转化为Foxp3+Treg细胞，抑制淋巴细胞产生和分泌干扰素γ、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子，发挥免疫调节功能。间充质干细胞来源外泌体可以通过抑制Th17细胞并诱导Treg细胞来调节免疫应答[22]。此外，间充质干细胞来源外泌体还能直接激活受体细胞，或作为递质转运生物活性物质进入受体细胞中，参与细胞间的信息传递，促进间充质干细胞的增殖和迁移能力，介导损伤修复和组织再生。已有研究表明，间充质干细胞来源外泌体中所含有的miRNAs是间充质干细胞发挥作用的重要因子，它们可以通过调控其靶基因的表达来调节间充质干细胞的各种生物学行为和功能。miR-21是哺乳动物细胞中含量最丰富的microRNA之一，是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，可通过与靶基因碱基互补配对，引起其降解或阻遏mRNA翻译，在转录后水平对基因进行调控，由于其在调节细胞凋亡和致癌性转化中的作用而被深入研究。研究发现，miR-21、miR-23a 和 miR-210表达升高时间充质干细胞的抗凋亡能力增强，而表达下调则加速细胞凋亡，揭示miRNA 对间充质干细胞自我更新的调控作用。FANG等[23]以脐带间充质干细胞来源外泌体为研究对象，经过测序、过表达和knockdown等实验技术揭示了外泌体中miR-21、miR-23、miR-125b和miR-145对组织功能修复起主导作用。此外，有研究表明间充质干细胞来源外泌体通过miR-21抑制细胞凋亡[24]，miR-21表达升高通过多种途径产生旁分泌因子，从而下调细胞中促凋亡基因产物PDCD4、PTEN、Peli1和FasL的表达[25-26]，过表达miR-21还可增强间充质干细胞的增殖、侵袭和分化[27]。miR-21基因修饰可以增强干细胞活性，并通过调节血管生成基因的表达促进新血管形成[28-29]。miR-21保留了间充质干细胞的纤维化机械记忆，参与并促进间充质干细胞向脂肪细胞、神经细胞等分化，作用机制与转化生长因子β信号通路的抑制相关[30-31]。以上研究提示miR-21在间充质干细胞的生物学行为和功能中扮演了重要的角色。 此外，miRNAs还被认为是免疫调控的关键因素，参与淋巴细胞的选择和增殖，以及T细胞的分化和恒定，在自身免疫性疾病研究中，miR-21通过抑制T细胞活化，减轻免疫反应。研究表明，miR-21可以抑制Th1表达促炎症因子干扰素γ，上调Th2表达抗炎症因子白细胞介素4，诱导Th1/Th2平衡向Th2偏移，以及促进 Treg细胞的分化，发挥免疫抑制作用。另有学者认为，miR-21是双向调节剂，一方面可以刺激记忆性T细胞的活化，另一方面通过下调趋化因子受体7表达抑制初始T细胞的活化。综上，miR-21具有一定的免疫调节能力，这一发现为移植后免疫重建和抗病毒免疫提供新的研究方向及相应的理论依据。鉴于miR-21参与调控间充质干细胞的自我更新、组织修复和免疫抑制功能，补充外源性miR-21将有可能弥补间充质干细胞体外扩增效率的差异，促进间充质干细胞向损伤组织迁移并修复，增强免疫重建，减轻病毒感染等相关并发症。因此，miR-21基因修饰间充质干细胞有望为移植后免疫重建和抗病毒免疫提供新思路和新策略。 2.6   间充质干细胞的免疫重建和抗巨细胞病毒免疫作用机制   2.6.1   间充质干细胞的免疫重建机制   研究表明，间充质干细胞具有逆转胸腺衰老、修复胸腺损伤和促进胸腺再生的功能[2]，其可能的作用机制包括：①在衰老大鼠模型中，显著提高胸腺指数和脾脏指数，增强T淋巴细胞活性[32]；②通过血液循环迁移至受损胸腺组织，改善胸腺中淋巴细胞和细胞因子的免疫微环境，重建免疫平衡[2]；③通过上调Treg细胞，发挥抗移植物抗宿主病的作用并修复胸腺损伤[2]；④促进白细胞介素7的分泌[33]。此外，间充质干细胞可分泌多种可溶性细胞因子如集落刺激因子、白细胞介素、转化生长因子β、肝上皮生长因子、血管内皮生长因子、前列腺素、基质金属蛋白酶2等发挥免疫调节作用。同时，间充质干细胞也是细胞微环境的建造者，其为免疫细胞构建生长所需的微环境，并分泌各种细胞因子维护其功能，这一系列研究表明间充质干细胞参与了免疫重建的进程。 2.6.2   间充质干细胞抗巨细胞病毒免疫的机制   人巨细胞病毒感染具有种属和细胞特异性，造血干细胞、间充质干细胞和肝窦内皮细胞是巨细胞病毒在人体内潜伏、重新激活和扩散传播的主要站点，更为严峻的是，间充质干细胞受染后功能受损，对机会性感染的防御能力也显著降低，以致移植患者体内呈现出巨细胞病毒特异性的免疫缺陷状态，在患者免疫重建以前，这种免疫缺陷状态会持续存在很长一段时间。移植前患者可能因巨细胞病毒感染使得造血干细胞和间充质干细胞功能受损，供者CD34+干细胞移植可以替换患者原有的病态造血干细胞，但仍保留患者自身的间充质干细胞。移植前巨细胞病毒血清学阳性患者可因巨细胞病毒潜伏在间充质干细胞而成为巨细胞病毒再激活并持续感染的重要危险因素；而且间充质干细胞作为造血微环境的主要基质细胞，其受染后的功能缺陷还严重阻碍了造血功能重建。间充质干细胞与造血干细胞联合移植有望在患者免疫功能重建前的过渡阶段起到一定的保护作用，从而达到促进造血恢复、遏制巨细胞病毒重新激活和发挥抗巨细胞病毒效应的治疗目的。 间充质干细胞兼具有造血支持、免疫调节和组织修复功能，在移植免疫中的应用研究已经取得较好的进展，近年来先后在加拿大、新西兰和日本获批用于治疗难治性移植物抗宿主病。除移植物抗宿主病之外，间充质干细胞在防治病毒感染方面也具有巨大潜力。"

研究也发现，间充质干细胞在调节机体适应性免疫应答方面具有双重作用，它既可以抑制宿主对同种异型抗原的免疫应答，抑制组织器官移植诱导的免疫排斥反应和系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫反应，避免移植物抗宿主病的发生，也可以发挥抗病毒免疫作用，以保护宿主免受病毒攻击。PD-1/PD-L1信号轴和吲哚胺2，3-双加氧酶代谢通路可能参与了间充质干细胞的免疫调控[45]，其中吲哚胺2，3-双加氧酶通路还可能直接操控间充质干细胞免疫功能双向调控的切换。此外，有研究发现，间充质干细胞通过外泌体miR-21介导调节性T细胞的AKT/GSK-3β/Foxp3信号通路改变[46]，发挥免疫调节和组织修复功能。体外研究发现，间充质干细胞不影响巨细胞病毒特异性细胞毒性 T 细胞的抗病毒活性，还能分泌干扰素γ协助介导病毒特异性细胞毒效应；临床研究也表明，间充质干细胞治疗没有增加移植物抗宿主病患者病毒复发的危险或损害宿主免疫应答；一项多中心回顾性研究显示，间充质干细胞共移植治疗组中巨细胞病毒血症发生率明显低于对照组。因此，有理由认为间充质干细胞对抗病毒免疫具有一定的疗效。"