牙髓干细胞
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图1｜人牙周膜干细胞培养鉴定及RAW264.7细胞培养
结果：(1)人牙周膜干细胞分离培养：组织块法培养5 d后，光镜下可见组织块周围发亮，长梭形细胞自组织块边缘爬出，呈放射状生长。传代培养后细胞与成纤维细胞形态相近，呈现纺锤形，漩涡状生长，见图1A。克隆形成能力测定显示人牙周膜干细胞增殖能力较强，见图1B。人牙周膜干细胞阳性表达间充质干细胞标记物CD90(97.59%)、CD146(99.82%)；阴性表达造血干细胞标记物CD34(0%)和泛白细胞标记物CD45(4.91%)，见图1C，证实该细胞为间充质来源的牙周膜干细胞。对提取的牙周膜干细胞进行成骨诱导，21 d后进行茜素红染色，见图1D，证明牙周膜干细胞具有成骨向分化能力。
(2) RAW264.7细胞培养：购置的RAW264.7细胞因密度过高，大量细胞悬浮于培养基中，将培养瓶置于培养箱，约4 h后将全部贴壁细胞吹打悬浮分置于离心管中，1 000 r/min离心3 min，重新接种到新培养瓶中培养；生长良好的RAW264.7细胞为球形，处于未分化状态，受到外界刺激后易分化，有触角形成，聚团生长，待七八个细胞聚团时即可传代，见图1E。
图2｜人牙周膜干细胞三维培养支架建立及压力加载模型构建
结果：细胞接种时为圆球形，约2 h后细胞在培养支架内伸展为长梭形，且随时间延长，细胞增殖，密度增加。无血清培养基组与含血清培养基组在48 h内形态无明显差异，含血清培养基组于48 h时细胞密度稍高，见图2A；人牙周膜干细胞三维培养支架可经受压力加载而不破碎，见图2B；最强压力加载实验组与不加压对照组相比，鬼笔环肽进行细胞骨架染色结果显示压力加载组细胞骨架稍皱缩，细胞之间间距减小，更加聚集，其余未见明显差异，见图2C。最强压力加载实验组与不加压对照组活死细胞染色显示均有活、死细胞的存在，且两组红色光显示的死细胞数目无明显差别，绿光标记的活细胞形态状态良好，见图2D。人牙周膜干细胞三维培养支架在压力培养板中状态良好，无破碎情况，见图2E。
图3｜压力加载下人牙周膜干细胞对RAW264.7细胞破骨向分化的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色结果
结果：细胞胞质桃红色表示为抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，证明细胞中破骨相关基因表达。①空白对照组及不加压组细胞上清处理组未见抗酒石酸酸性磷酸酶阳性表达细胞；压力加载实验组可观察到抗酒石酸酸性磷酸酶红染区域；②红染区域的面积呈现一定的表达趋势，相同压力下，随着压力加载时间的延长，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域逐渐增加；相同加载时间下，随着力值的增加，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域逐渐增加，见图3A，B；③但过强的压力加载条件下，65 kPa，12 h组抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域的面积反而减少，见图3C；④此外光学显微镜下可以观察到使用RANKL诱导的阳性对照组有大量的多核巨细胞产生，而使用条件培养基干预的实验组则仅呈抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，并未发现多核巨细胞，见图3A。