同种异体脱蛋白骨复合纤维蛋白胶体内构建组织工程骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.16.003

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有实验证明复合纤维蛋白胶的异体骨在体外培养中更适合种子细胞生长和增殖。
目的：观察复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为骨髓间充质干细胞支架材料的差异。
方法：将28只新西兰大白兔随机分为3组，实验组在兔背部植入复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与自体骨髓间充质干细胞，对照组在兔背部植入单纯脱蛋白骨与自体骨髓间充质干细胞，空白组在兔背部植入单纯脱蛋白骨。
结果与结论：随着植入时间的延长，各组植入物碱性磷酸酶活性逐渐增强，但实验组强于对照组与空白组(P < 0.01)。实验组与对照组术后4，8周均有新骨形成，且实验组成骨量高于对照组(P < 0.01)，空白组未见新骨形成。表明复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨新骨形成能力优于单纯脱蛋白骨，可作为骨髓间充质干细胞的复合型载体构建于组织工程骨。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 同种异体, 脱蛋白骨, 纤维蛋白胶, 骨髓间充质干细胞, 骨组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Some experiments have demonstrated that allogenic deproteinized bone combined fibrin glue is more suitable for seed cells growth and proliferation in vitro.
OBJECTIVE: To observe the difference between allogenic deproteinized bone combined fibrin glue and allogenic deproteinized bone alone as scaffold materials for bone tissue engineering.
METHODS: Twenty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: allogenic deproteinized bone combined fibrin glue composited with mesenchymal stem cells was implanted in experiment group, allogenic deproteinized bone composited with mesenchymal stem cells implanted in control group, and allogenic deproteinized bone alone implanted in blank group.
RESULTS AND CONCLUSION: With the duration of implantation, the alkaline phosphatase activity of eachgroup was increased gradually. The experiment group was higher than control group and blank group in the alkaline phosphatase activity (P < 0.01). New bone tissue formed in both the experiment group and control group at 4 and 8 weeks after implantation, and there were more new bone tissues formed in the experiment group (P < 0.01). In the blank group, there was no new bone formed. Allogenic deproteinized bone combined fibrin glue is more suitable for mesenchymal stem cells than allogenic deproteinized bone alone, and it can be used as a scaffold for bone tissue engineering.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, allogeneic, deproteinized bone, fibrin glue, bone marrow mesenchymal stem cells, bone tissue engineeringr

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 术后实验组、对照组和空白组28只兔术后4周时均无死亡，术后活动及进食正常，伤口无红肿、渗液等炎性反应，伤口Ⅰ期愈合。

2.2 各组植入材料大体观察结果 3组植入材料周围组织未见坏死、化脓、积液等迹象，材料皆有软组织长入、包裹，难于将其分开。

2.3 各组植入物碱性磷酸酶活性测定结果 为便于统计学处理，各组每个时间点均选2只兔，共12份移植物组织块进行碱性磷酸酶活性测定，结果见表1.. 经两独立样本间t 检验表明，实验组和对照组材料植入体内相同时间点组织块的碱性磷酸酶活性不一致，实验组较对照组植入体内后同一时间的碱性磷酸酶活性强(P < 0.01)，且实验组体内植入后8周时的碱性磷酸酶活性均比4周时强(P < 0.01)。实验组与对照组植入后4，8周时碱性磷酸酶活性均明显强于空白组(P < 0.01)。

2.4 各组植入物组织学检查结果 实验组植入后4周，标本可见绿色纤维软骨与成熟骨交杂，大量新生软骨已向成熟骨组织转化，形成较致密的骨小梁结构，见图1A；对照组标本主要由绿色的纤维软骨构成，仅有极少量的成熟骨组织，见图1B。

术后8周，实验组标本已大部分钙化为成熟的板层骨，并可见髓腔形成，其内见有岛状小梁骨，见图2A；对照组标本见有片块状或条索状新骨形成，边缘仍见有软骨组织，见图2B。两组材料随植入时间的延长而逐渐被降解吸收，且新骨或软骨形成增多，并有血管、纤维组织、肌肉组织长入材料间隙内。

空白组植入物中未见任何软骨或新骨形成，随植入时间延长，渐被降解吸收，并可见材料周围的肌肉组织、纤维、血管等长入材料孔隙内，见图3。

2.5 实验组与对照组植入物成骨的定量判断按照检测方法中的描述，分析两组植入物的成骨量，使用SPSS统计学软件进行两独立样本间t 检验，结果见表2。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2006年3月至2010年7月在南方医科大学组织工程实验室完成。
材料：
实验动物及分组：健康成年新西兰大白兔28只，体质量2.0-2.5 kg，雌雄不拘，随机分为实验组(n=12)、对照组(n=12)及空白组(n=4)；另取成年健康新西兰大白兔若干只，制备脱蛋白骨；均由南方医科大学实验动物中心提供。
试剂：胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司；纤维蛋白原、凝血酶及胰蛋白酶购自Sigma公司；细胞DNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；其他试剂及仪器由南方医科大学试剂中心提供。
实验方法：
脱蛋白骨支架材料的制备：取成年健康新西兰大白兔双侧髂骨松质部分，去除其上软组织及软骨组织，以电锯将其加工成3 mm×3 mm×8 mm大小骨粒，自来水反复冲洗后用蒸馏水洗净；体积分数30%过氧化氢室温下浸泡48 h(每24 h换液)，双蒸水冲洗30 min；氯仿：甲
醇(1∶1)溶液脱脂4 h；乙二胺于索氏提取器中循环提取24 h；无水乙醇浸泡24 h去乙二胺，
双蒸水冲洗30 min；低温冷冻干后分袋真空包装，60Co照射消毒后备用制成骨块共40块，实验前2 h将材料于含DMEM培养基的24孔培养板中预湿。
骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定：将实验组与对照组兔以新眠灵0.3 mL/kg肌注麻醉，常规消毒铺巾后，用16号骨穿针穿刺髂棘，以含肝素800 U/mL的DMEM抽取骨髓，全血培养于条件为37 ℃，体积分数5%CO2饱和湿度培养箱培养。5 d后换液，倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况，以表面标记物检测鉴定为干细胞。原代细胞融合为单层后，用0.25%胰蛋白酶(PBS配制)消化并传代。两组取第3代骨髓间充质干细胞5×105与脱蛋白骨柱接种于6孔培养板内，实验组随后加入凝血酶10 U，培养基中预先加入20 g/L纤维蛋白原，待纤维蛋白胶凝固后，两组分别加入培养基体外培养3 d。
分组干预：取3组新西兰大白兔，肌肉注射速眠新Ⅱ进行麻醉，剂量为0.4 mL/kg，常规消毒铺单。于兔背部脊柱两侧做长约2 cm小切口，切开皮肤及皮下组织，暴露椎旁肌，分开肌间隙，实验组植入同种异体脱蛋白骨+待纤维蛋白胶+自体骨髓间充质干细胞，对照组植入同种异体脱蛋白骨+自体骨髓间充质干细胞，空白组仅植入同种异体脱蛋白骨。每只兔背部两侧各植3块材料，然后缝合切口。术毕将各组动物放入清洁环境下分笼饲养，于术后4，8周各组取2只兔取材做相关检查。
一般观察：术后兔活动及进食情况，伤口愈合情况，植入材料取出后的大体观察及其与周围组织的关系。
碱性磷酸酶活性测定：将各组兔术后第4，8周的植入物用磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性。
组织学检查：将取出的植入物组织块用体积分数4%中性甲醛液固定，10%硝酸脱钙，石蜡包埋，制成5 μm厚切片，做Masson染色，纤维软骨显示为绿色，成熟骨钙沉积后显示为红色，光镜下观察植入材料内新骨生成情况。
植入物成骨的定量判断：将实验组与对照组侧植入物每一组织块取不同节段随机做5张切片，Masson染色，光镜下观察，每张切片取中央和四角共5个视野，使用图像分析软件Image-Pro Plus 5.0进行定量分析，设定每个视野总面积为100，用软件计算红色成熟骨和绿色纤维软骨所占面积的比例，对植入组织成骨量进行分析。因空白组植入物组织块内皆无新生的软骨或骨组织，故对其未作评估。
主要观察指标：各组植入物碱性磷酸酶活性检测及新骨生成情况。
统计学分析：采用统计学软件SPSS 11.5，应用析因设计的方差分析。

讨论

组织工程的基本方法是将体外培养的种子细胞种植于人工合成或天然衍生的支架材料上，然后将其体外培养或移植到体内，达到形成新的有功能组织的目的。种子细胞能否发挥最大的生物效能与如何选取恰当的支架材料密切相关。生物衍生骨骨质结构与机械性能与人骨最为接近，具有良好的应用前景。脱蛋白骨是天然骨衍生材料中应用较为广泛的一种。新鲜异种、异体骨抗原成分主要来自于异种蛋白，特别是骨中的非胶原蛋白。采用一些理化方法将这些蛋白脱除便可使其抗原性减弱或消除。目前主要用过氧化氢(体积分数20%-30%)浸泡处理，用甲醇、氯仿等有机溶剂抽提脱脂，如Keil骨、Bio-oss骨^[1] 。处理得到的脱蛋白骨具有良好生物相容性，可作为修复骨缺损的材料^[2] 。脱蛋白骨的缺点是天然骨中胶原和非胶原蛋白同时被破坏，包括一些对新骨生成有诱导作用的生长因子。而且过氧化氢浓度越高，作用时间越长，蛋白质和胶原纤维的破坏就越完全，组织反应越轻^[3] 。Staropoulos等^[4]用大鼠进行实验表明完全脱蛋白牛骨缺乏诱导新骨生成的能力。骨中的Ⅰ型胶原可以支持并保护细胞，同时与细胞的黏附、生长、表型表达均有密切关系。氧化剂的强氧化作用使天然骨中蛋白质变性而消除其抗原性的同时也使骨中的胶原纤维失去了其作为骨基质三维框架的功能。纤维蛋白胶有良好的组织相容性^[5] ，能较好介导细胞信号传导和细胞间相互作用，可降解并释放β转化因子和血小板衍生生长因子促进细胞黏附和增殖，为细胞提供三维空间，促进组织再生^[6] 。Isogai等^[7]将培养后的牛骨膜细胞与纤维蛋白胶混合植入裸鼠背部皮下，12周时形成了新骨，单纯纤维蛋白胶无新骨形成，证明了其具有的骨诱导能力。目前纤维蛋白胶主要在可注射型组织工程骨中应用。体外实验已证明复合材料的性能明显优于单纯材料^[8] 。近年来骨组织工程材料进展较快，许多新兴材料不断被应用^[9-13] ，在传统材料基础上又有纳米材料等研究热点^[14-16] ，但生物性骨材料仍然是一种可供选择的天然材料。随着细胞学的进一步研究，提高了组织工程的构建效率^[17] 。

实验在体外实验的基础上进一步深化，通过体内异位成骨方法验证复合材料作为组织工程支架的成骨能力。通过植入后不同时间点的组织块检测，从大体观察、碱性磷酸酶检测及组织学切片多个方面证明了复合材料的成骨能力明显高于单纯材料，为生物衍生支架材料在骨组织工程中的应用提供了新的思路。

文章快阅

延伸阅读

脱蛋白骨是天然骨衍生材料中应用较为广泛的一种。新鲜异种、异体骨抗原成分主要来自于异种蛋白，特别是骨中的非胶原蛋白。采用一些理化方法将这些蛋白脱除便可使其抗原性减弱或消除。目前主要用过氧化氢(体积分数20%～30%)浸泡处理，用甲醇、氯仿等有机溶剂抽提脱脂，如Keil骨、Bio-oss骨。处理得到的脱蛋白骨具有良好生物相容性，可作为修复骨缺损的材料。脱蛋白骨的缺点是天然骨中胶原和非胶原蛋白同时被破坏，包括一些对新骨生成有诱导作用的生长因子。而且过氧化氢浓度越高，作用时间越长，蛋白质和胶原纤维的破坏就越完全，组织反应越轻。Staropoulos 等用大鼠进行实验表明完全脱蛋白牛骨缺乏诱导新骨生成的能力。骨中的Ⅰ型胶原可以支持并保护细胞，同时与细胞的黏附、生长、表型表达均有密切关系。氧化剂的强氧化作用使天然骨中蛋白质变性而消除其抗原性的同时也使骨中的胶原纤维失去了其作为骨基质三维框架的功能。纤维蛋白胶有良好的组织相容性，能较好介导细胞信号传导和细胞间相互作用，可降解并释放β转化因子和血小板衍生生长因子促进细胞黏附和增殖，为细胞提供三维空间，促进组织再生。Isogai 等将培养后的牛骨膜细胞与纤维蛋白胶混合植入裸鼠背部皮下，12周时形成了新骨，单纯纤维蛋白胶无新骨形成，证明了其具有的骨诱导能力。目前纤维蛋白胶主要在可注射型组织工程骨中应用。体外实验已证明复合材料的性能明显优于单纯材料。近年来骨组织工程材料进展较快，许多新兴材料不断被应用，在传统材料基础上又有纳米材料等研究热点[，但生物性骨材料仍然是一种可供选择的天然材料。随着细胞学的进一步研究，提高了组织工程的构建效率。