人脐带间充质干细胞治疗大鼠骨关节炎：缓解疼痛和保护软骨的双重作用

doi:10.12307/2026.838

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是最常见的退行性关节疾病，主要特征是关节软骨进行性丧失，引起慢性疼痛和日益严重的活动障碍，最终可能导致关节功能完全丧失。
人脐带间充质干细胞：是来源于人脐带华通氏胶组织的一类具有自我更新和多向分化潜能的成体细胞类型，具有典型的间充质干细胞生长和形态学特点、表型特征和分化潜能。人脐带间充质干细胞具有软骨保护效应、成软骨分化潜能、旁分泌功能以及促进细胞外基质合成的作用，被认为是治疗骨关节炎的理想候选药物。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞是治疗骨关节炎的潜在候选药物，但其剂量-疗效关系尚不明确。
目的：观察不同剂量人脐带间充质干细胞对骨关节炎大鼠的疗效，为人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎的剂量选择提供参考。
方法：将单碘乙酸钠诱导的骨关节炎大鼠分为阴性对照组、透明质酸对照组、干细胞低剂量组(2.5×105/关节)、干细胞中剂量组(8.0×105/关节)和干细胞高剂量组(2.5×106/关节)，未造模的正常大鼠纳入条件对照组，每组16只。各干细胞组大鼠右后肢膝关节腔内注射25 μL不同剂量的人脐带间充质干细胞，随后立刻注射25 μL 0.2%透明质酸溶液，透明质酸对照组大鼠右后肢膝关节腔内注射25 μL 0.2%透明质酸溶液和25 μL注射用氯化钠溶液，条件对照组和阴性对照组大鼠右后肢膝关节腔内注射50 μL注射用氯化钠溶液。分别于给药后2，4，6，8，10，12周时行爪压痛阈值、足底疼痛阈值、左右膝关节压痛阈值差和自主活动能力检测，给药后6，12周时取右后肢膝关节行关节软骨大体检查、苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色并进行分级评分。
结果与结论：①在所有检测时间点，阴性对照组大鼠的爪压痛阈值、足底疼痛阈值和自主活动能力均低于条件对照组，左右膝关节压痛阈值差、关节软骨大体检查评分和组织损伤评分均高于条件对照组，表明成功建立骨关节炎大鼠模型；②与阴性对照组相比，干细胞中、高剂量组的上述指标均有不同程度改善。结果表明：经关节腔内单次注射8.0×105-2.5×106的人脐带间充质干细胞可明显提高骨关节炎大鼠的疼痛阈值和自主活动能力，修复关节软骨病理损伤，可见人脐带间充质干细胞对骨关节炎大鼠关节功能和关节软骨损伤有改善作用。

https://orcid.org/0009-0005-7561-4941(刘芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人脐带间充质干细胞, 骨关节炎, 疼痛, 功能, 软骨损伤, 剂量, 疗效, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells have been identified as a potential therapeutic agent for osteoarthritis; however, the precise dose-efficacy relationship remains to be elucidated.
OBJECTIVE: To observe the efficacy of varying doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells in treating osteoarthritis in rats, offering insights for optimal dose selection in human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells therapy for osteoarthritis.
METHODS: The osteoarthritis rats induced by monosodium iodoacetate were divided into the following groups: negative control group, hyaluronic acid control group, low-dose group (2.5×105 cells/joint), medium-dose group (8.0×105 cells/joint), and high-dose group (2.5×106 cells/joint). Normal rats without modeling were included as the conditional control group. Each group consisted of 16 rats. In the stem cell group, rats received an intra-articular injection of 25 μL of different doses of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into the right hind limb knee joint cavity, followed immediately by an injection of 25 μL of 0.2% hyaluronic acid solution. In the hyaluronic acid control group, rats received an intra-articular injection of 25 μL of 0.2% hyaluronic acid solution and 25 μL of saline solution into the right hind limb knee joint cavity. In the condition control group and negative control group, rats received an intra-articular injection of 50 μL of sodium chloride solution into the right hind limb knee joint cavity. At 2, 4, 6, 8, 10, and 12 weeks after administration, assessments were conducted for paw pressure pain threshold, plantar pain threshold, difference in knee pressure pain threshold between left and right limbs, and spontaneous locomotor activity. At 6 and 12 weeks after administration, the right hind limb knee joints were collected for macroscopic examination of articular cartilage, hematoxylin-eosin staining, and safranin O-fast green staining, followed by grading and scoring.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At all tested time points, the negative control group exhibited lower paw withdrawal thresholds, plantar pain thresholds, and spontaneous locomotor activity ability compared with the conditional control group, while demonstrating higher differences in knee pressure pain thresholds between left and right limbs, macroscopic articular cartilage scores, and tissue damage scores, which confirmed successful establishment of the osteoarthritis rat model. (2) Compared with the negative control group, medium- and high-dose groups showed varying degrees of improvement in all these parameters. These results suggest that a single intra-articular injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells ranging from 8.0×105 to 2.5×106 cells significantly increased the pain threshold and enhanced spontaneous locomotor activity in osteoarthritis rats, while also repairing pathological cartilage damage. These results indicate that human umbilical cord mesenchymal stem cells can improve joint function and alleviate cartilage damage in osteoarthritis rats.

Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cells, osteoarthritis, pain, function, cartilage damage, dose, efficacy, rat

中图分类号:

刘芳, 胡海敏, 宋丹, 南洁, 蔡晓晓, 贺庆瑞, 廉瑞娇, 罗林, 苑春慧. 人脐带间充质干细胞治疗大鼠骨关节炎：缓解疼痛和保护软骨的双重作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(31): 8108-8115.

Liu Fang, Hu Haimin, Song Dan, Nan Jie, Cai Xiaoxiao, He Qingrui, Lian Ruijiao, Luo Lin, Yuan Chunhui. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to treat osteoarthritis in rats: dual effect of relieving pain and protecting cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(31): 8108-8115.

图/表（结果） 13

2.1 实验动物数量分析 该研究共使用96只SD大鼠，所有大鼠均进入结果分析。
2.2 行为学检查结果
2.2.1 爪压痛阈值 图2显示，给药2-12周时，阴性对照组的爪压痛阈值均低于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药4周时，干细胞高剂量组的爪压痛阈值高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药6，8，10，12周时，干细胞低、中、高剂量组的爪压痛阈值均高于阴性对照组和透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药10，12周时，干细胞高剂量组的爪压痛阈值高于干细胞低、中剂量组，差异有显著性意义(P < 0.05)；其余时间点干细胞各剂量组的爪压痛阈值无明显差异(P > 0.05)。

2.2.2 足底疼痛阈值 图3显示，给药2-12周时，阴性对照组的足底疼痛阈值均低于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药4周时，干细胞中、高剂量组的足底疼痛阈值高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药6周时，干细胞低、中、高剂量组的足底疼痛阈值高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药8周时，干细胞中、高剂量组的足底疼痛阈值高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药10，12周时，干细胞低、中、高剂量组的足底疼痛阈值高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。在所有检测时间点，干细胞各剂量组的足底疼痛阈值无明显差异(P > 0.05)。

2.2.3 左右膝关节压痛阈值差 图4显示，给药2-12周时，阴性对照组的左右膝关节压痛阈值差高于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药6周时，干细胞高剂量组的左右膝关节压痛阈值差低于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；干细胞中、高剂量组的左右膝关节压痛阈值差低于透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药8，10，12周时，干细胞低、中、高剂量组的左右膝关节压痛阈值差均低于阴性对照组、透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药8周时，干细胞高剂量组的左右膝关节压痛阈值差低于干细胞低剂量组，差异有显著性意义(P < 0.05)；其余时间点干细胞各剂量组的左右膝关节压痛阈值差无明显差异(P > 0.05)。

2.2.4 自主活动能力 自主活动跨格数检测结果(图5)显示，给药2-12周时，阴性对照组的跨格数低于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药4周时，干细胞高剂量组的跨格数高于阴性对照组、透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药6周时，干细胞高剂量组的跨格数高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药8周时，干细胞低、中、高剂量组的跨格数高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药10周时，干细胞低、中、高剂量组的跨格数高于阴性对照组、透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药12周时，干细胞中剂量组的跨格数高于阴性对照组(P < 0.05)；干细胞高剂量组的跨格数高于阴性对照组和透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。在所有检测时间点，干细胞各剂量组的自发活动跨格数无明显差异(P > 0.05)。

自主活动直立次数检测结果(图6)显示，给药2-12周时，阴性对照组的直立次数低于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药4周和6周时，干细胞高剂量组的直立次数高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药8周时，干细胞低、中、高剂量组的直立次数高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；干细胞中、高剂量组的直立次数高于透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药10周时，干细胞低、中、高剂量组的直立次数高于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。给药12周时，干细胞低、中、高剂量组的直立次数高于阴性对照组、透明质酸对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。在所有检测时间点，干细胞各剂量组的自发活动直立次数无明显差异(P > 0.05)。

2.3 关节软骨大体检查结果 图7，8显示，给药6，12周时，条件对照组大鼠的关节软骨表面光滑，玻璃样外观，无明显滑膜增生；阴性对照组、透明质酸对照组及干细胞低、中剂量组大鼠的关节软骨表面粗糙且不透明，可见明显磨损、纤维化组织和滑膜增生；而干细胞高剂量组大鼠的上述情况有所改善。分级评分结果(图9)显示，给药6，12周时，阴性对照组的关节软骨损伤评分高于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；干细胞高剂量组的关节软骨损伤评分低于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。在所有检测时间点，干细胞各剂量组的关节软骨损伤评分无明显差异(P > 0.05)。

2.4 苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色结果 苏木精-伊红染色和番红-固绿染色(图10-13)显示，给药6，12周时，条件对照组大鼠关节软骨表面规则，基质较厚，潮线完整；阴性对照组、透明质酸对照组、干细胞低剂量组大鼠表面不平整，具有不规则裂隙，基质较薄且番红O染色较浅，潮线不完整；干细胞中、高剂量组上述病理改变有所改善。分级评分结果(图14)显示，给药6，12周时，阴性对照组的组织损伤评分高于条件对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；干细胞中、高剂量组的组织损伤评分低于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；干细胞高剂量组的组织损伤评分低于透明质酸对照组(P < 0.05)。在所有检测时间点，干细胞各剂量组的组织损伤评分无明显差异(P > 0.05)。

参考文献

[1] KWON DG, KIM MK, JEON YS, et al. State of the Art: The Immunomodulatory Role of MSCs for Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1618.
[2] ZHANG P, DONG B, YUAN P, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells promoting knee joint chondrogenesis for the treatment of knee osteoarthritis: a systematic review. J Orthop Surg Res. 2023;18(1):639.
[3] XIANG XN, ZHU SY, HE HC, et al. Mesenchymal stromal cell-based therapy for cartilage regeneration in knee osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2022;13(1):14.
[4] ZHU Y, YE L, CAI X, et al. Icariin-Loaded Hydrogel Regulates Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation and Promotes Cartilage Repair in Osteoarthritis. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:755260.
[5] HE L, HE T, XING J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes protect cartilage damage and relieve knee osteoarthritis pain in a rat model of osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):276.
[6] CARNEIRO DC, ARAÚJO LT, SANTOS GC, et al. Clinical Trials with Mesenchymal Stem Cell Therapies for Osteoarthritis: Challenges in the Regeneration of Articular Cartilage. Int J Mol Sci. 2023;24(12):9939.
[7] HAMDALLA HM, AHMED RR, GALALY SR, et al. Assessment of the Efficacy of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells against a Monoiodoacetate-Induced Osteoarthritis Model in Wistar Rats. Stem Cells Int. 2022;2022:1900403.
[8] COPP G, ROBB KP, VISWANATHAN S. Culture-expanded mesenchymal stromal cell therapy: does it work in knee osteoarthritis? A pathway to clinical success. Cell Mol Immunol. 2023;20(6):626-650.
[9] 陈驹,郑锦畅,梁振,等.β-石竹烯对小鼠膝骨关节炎的作用及机制[J].中国组织工程研究,2026,30(6):1341-1347.
[10] DE SOUSA VALENTE J. The Pharmacology of Pain Associated With the Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis. Front Pharmacol. 2019;10:974.
[11] PAN X, LI X, ZHANG L, et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells relieve osteoarthritis in rats through immunoregulation and inhibition of chondrocyte apoptosis. Sci Rep. 2023;13(1):14975.
[12] LIU X, LIU Y, HE H, et al. Human adipose and synovial mesenchymal stem cells improve osteoarthritis in rats by reducing chondrocyte reactive oxygen species and inhibiting inflammatory response. J Clin Lab Anal. 2022;36(5):e24353.
[13] WANG G, XING D, LIU W, et al. Preclinical studies and clinical trials on mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis: A systematic review on models and cell doses. Int J Rheum Dis. 2022;25(5):532-562.
[14] MOHAND-KACI F, ASSOUL N, MARTELLY I, et al. Optimized hyaluronic acid-hydrogel design and culture conditions for preservation of mesenchymal stem cell properties. Tissue Eng Part C Methods. 2013;19(4):288-298.
[15] GERWIN N, BENDELE AM, GLASSON S, et al. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18 Suppl 3:S24-34.
[16] COURTIES A, KOUKI I, SOLIMAN N, et al. Osteoarthritis year in review 2024: Epidemiology and therapy. Osteoarthritis Cartilage. 2024;32(11):1397-1404.
[17] GIORGINO R, ALBANO D, FUSCO S, et al. Knee Osteoarthritis: Epidemiology, Pathogenesis, and Mesenchymal Stem Cells: What Else Is New? An Update. Int J Mol Sci. 2023;24(7):6405.
[18] WATSON N, DIVERS R, KEDAR R, et al. Discarded Wharton jelly of the human umbilical cord: a viable source for mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2015;17(1):18-24.
[19] WU C, XU H, WU Z, et al. Subchondral injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells ameliorates knee osteoarthritis by inhibiting osteoblast apoptosis and TGF-beta activity. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):235.
[20] PERRY J, MENNAN C, COOL P, et al. Intra-Articular Injection of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells Reduces Radiographic Osteoarthritis in an Ovine Model. Cartilage. 2024:19476035241287832.
[21] AO Y, DUAN J, XIONG N, et al. Repeated intra-articular injections of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells for knee osteoarthritis: a phase I, single-arm study. BMC Musculoskelet Disord. 2023;24(1):488.
[22] PICO OA, ESPINOZA F, CÁDIZ MI, et al. Efficacy of a single dose of cryopreserved human umbilical cord mesenchymal stromal cells for the treatment of knee osteoarthritis:a randomized, controlled, double-blind pilot study. Cytotherapy. 2025;27(2):188-200.
[23] SONG Y, ZHANG J, XU H, et al. Mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis treatment: A systematic review and meta-analysis. J Orthop Translat. 2020;24:121-130.
[24] YU H, HUANG T, LU WW, et al. Osteoarthritis Pain. Int J Mol Sci. 2022;23(9):4642.
[25] KUAH D, SIVELL S, LONGWORTH T, et al. Safety, tolerability and efficacy of intra-articular Progenza in knee osteoarthritis: a randomized double-blind placebo-controlled single ascending dose study. J Transl Med. 2018;16(1):49.
[26] GUPTA PK, CHULLIKANA A, RENGASAMY M, et al. Efficacy and safety of adult human bone marrow-derived, cultured, pooled, allogeneic mesenchymal stromal cells (Stempeucel®): preclinical and clinical trial in osteoarthritis of the knee joint. Arthritis Res Ther. 2016;18(1):301.
[27] HO KK, LEE WY, GRIFFITH JF, et al. Randomized control trial of mesenchymal stem cells versus hyaluronic acid in patients with knee osteoarthritis - A Hong Kong pilot study. J Orthop Translat. 2022;37:69-77.
[28] JIN WS, YIN LX, SUN HQ, et al. Mesenchymal Stem Cells Injection Is More Effective Than Hyaluronic Acid Injection in the Treatment of Knee Osteoarthritis With Similar Safety: A Systematic Review and Meta-analysis. Arthroscopy. 2025;41(2):318-332.
[29] COACCIOLI S, SARZI-PUTTINI P, ZIS P, et al. Osteoarthritis: New Insight on Its Pathophysiology. J Clin Med. 2022;11(20):6013.
[30] ABDEL JALEEL GA, SALEH DO, AL-AWDAN SW, et al. Impact of type III collagen on monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. Heliyon. 2020;6(6):e04083.
[31] SAMARA O, JAFAR H, HAMDAN M, et al. Ultrasound-guided intra-articular injection of expanded umbilical cord mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis: a safety/efficacy study with MRI data. Regen Med. 2022;17(5):299-312.
[32] GÜNAY AE, KARAMAN I, GUNEY A, et al. Assessment of clinical, biochemical, and radiological outcomes following intra-articular injection of Wharton jelly-derived mesenchymal stromal cells in patients with knee osteoarthritis: A prospective clinical study. Medicine (Baltimore). 2022;101(37):e30628.
[33] LIM HC, PARK YB, HA CW, et al. Allogeneic Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cell Implantation Versus Microfracture for Large, Full-Thickness Cartilage Defects in Older Patients: A Multicenter Randomized Clinical Trial and Extended 5-Year Clinical Follow-up. Orthop J Sports Med. 2021;9(1):2325967120973052.
[34] MATAS J, GARCÍA C, POBLETE D, et al. A Phase I Dose-Escalation Clinical Trial to Assess the Safety and Efficacy of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells in Knee Osteoarthritis. Stem Cells Transl Med. 2024;13(3):193-203.
[35] 闫文鑫,张烨,郭景玥,等.间充质干细胞注射液对大鼠膝骨关节炎的影响[J].药物评价研究,2023,46(10):2179-2185.
[36] CHEN CF, HU CC, WU CT, et al. Treatment of knee osteoarthritis with intra-articular injection of allogeneic adipose-derived stem cells (ADSCs) ELIXCYTE®: a phase I/II, randomized, active-control, single-blind, multiple-center clinical trial. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):562.
[37] NAIR AB, JACOB S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 2016;7(2):27-31.
[38] FANG Z, LI X, LEI S, et al. Protective effects of Pudilan Tablets against osteoarthritis in mice induced by monosodium iodoacetate. Sci Rep. 2023;13(1):2760.
[39] SAMVELYAN HJ, HUGHES D, STEVENS C, et al. Models of Osteoarthritis: Relevance and New Insights. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):243-256.
[40] KWON M, NAM D, KIM J. Pathological Characteristics of Monosodium Iodoacetate-Induced Osteoarthritis in Rats. Tissue Eng Regen Med. 2023;20(3):435-446.
[41] ENOMOTO T, AKAGI R, OGAWA Y, et al. Timing of Intra-Articular Injection of Synovial Mesenchymal Stem Cells Affects Cartilage Restoration in a Partial Thickness Cartilage Defect Model in Rats. Cartilage. 2020;11(1):122-129.
[42] SATUÉ M, SCHÜLER C, GINNER N, et al. Intra-articularly injected mesenchymal stem cells promote cartilage regeneration, but do not permanently engraft in distant organs. Sci Rep. 2019;9(1):10153.
[43] TOUPET K, MAUMUS M, LUZ-CRAWFORD P, et al. Survival and biodistribution of xenogenic adipose mesenchymal stem cells is not affected by the degree of inflammation in arthritis. PLoS One. 2015;10(1):e0114962.
[44] TOUPET K, MAUMUS M, PEYRAFITTE JA, et al. Long-term detection of human adipose-derived mesenchymal stem cells after intraarticular injection in SCID mice. Arthritis Rheum. 2013;65(7):1786-1794.
[45] SHIM G, LEE S, HAN J, et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2015;24(9):1124-1132.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。实验技术路线见图1。

1.2 时间及地点 实验于2023年2-10月在浙江鹰旸医药研发有限公司SPF级实验动物房内完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞及试剂 人脐带间充质干细胞系北京再生生物科技研究院有限公司自主研发的人脐带间充质干细胞注射液(新药注册受理号：CXSL2500494)，透明质酸(上海艾伟拓医药科技有限公司，批号：42122)，单碘乙酸钠(Sigma，批号：I2512)，苏木精(Sigma，批号：20230425)，伊红(Sigma，批号：20230417)，固绿(Sigma，批号：P1226763)，番红O(Sigma，批号：P1603164)。
1.3.2 仪器 Von Frey针刺痛觉测试包(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型号：Aesthesio)，大小鼠足底刺痛仪(南京卡尔文生物科技有限公司，型号：KW-CT-1)，联合开场(旷场硬件)[众实鼎盛生物科技(北京)有限公司，型号：ZS-KC]，脱水机(DIAPATH，型号：Donatello)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)，病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)，正置光学显微镜(Nikon，型号：Nikon Eclipse Ci-L)，成像系统(Nikon，型号：Nikon DS-U3)，全景扫描仪(宁波江丰生物信息技术有限公司，型号：KF-PRO-120)。
1.3.3 人脐带间充质干细胞混悬液制备 人脐带间充质干细胞注射液经(37.0±0.5) ℃水浴复苏，以氯化钠注射液稀释后，400×g离心5 min，弃上清，细胞沉淀以氯化钠注射液复配成浓度为1.0×1010 L-1，3.2×1010 L-1或1.0×1011 L-1的人脐带间充质干细胞混悬液备用。
1.3.4 实验动物 雄性SD大鼠96只，6-8周龄，体质量180-220 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2022-0004。饲养条件：温度20-26 ℃，湿度50%-60%，光照每12 h明暗交替，换风次数15-20次/h，由浙江鹰旸医药研发有限公司SPF级实验动物屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2021-0033。实验方案经浙江鹰旸医药研发有限公司实验动物伦理委员会批准，审批号为ZJEY-20230206-01。
1.4 实验方法
1.4.1 骨关节炎模型建立 参考HE等[5]方法建立骨关节炎大鼠模型。适应性喂养1周后，随机抽取80只SD大鼠行异氟烷呼吸麻醉、备皮及碘伏消毒，随后经右后肢关节腔内缓慢注射40 mg/mL单碘乙酸钠溶液，注射体积为50 μL，注射时配合抽屉样关节运动，注射完毕后放回笼中观察。其余16只未造模的正常SD大鼠作为条件对照组。造模2周后通过行为学变化判断造模是否成功，如大鼠出现活动减少、右膝肿胀、跛行、负重不佳和屈伸功能障碍等症状表明建模成功[9]。
1.4.2 分组及给药 该模型的早期阶段以炎症为主要特征，此时出现巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，通常在第7天消退；后期(10-14 d后)阶段以软骨进行性退化和软骨下骨重塑为主要特征，此时出现全层软骨损伤、破骨细胞形成等软骨病理变化，因此将给药时间设置为造模2周后[10]。造模2周后，经单碘乙酸钠造模的80只SD大鼠按随机数字表法分成阴性对照组、透明质酸对照组、干细胞低剂量组、干细胞中剂量组、干细胞高剂量组，每组16只。未造模的16只正常SD大鼠纳入条件对照组。
参考既往临床前研究结果将该研究的剂量范围设置为2.5×105/关节-2.5×106/关节[11-13]。干细胞低、中、高剂量组大鼠经异氟烷呼吸麻醉后经右后肢膝关腔内注射25 μL浓度为1.0×1010 L-1，3.2×1010 L-1，1.0×1011 L-1的人脐带间充质干细胞悬液，随后立刻注射25 μL 0.2%透明质酸溶液，注射期间配合抽屉样关节运动。透明质酸是一种存在于所有结缔组织中的糖胺聚糖，是细胞外基质的主要组成部分，有助于保持人脐带间充质干细胞的生物学特性[14]。该研究将透明质酸作为人脐带间充质干细胞的共移植载体以减缓人脐带间充质干细胞的死亡。透明质酸对照组大鼠经右后肢膝关节腔内注射25 μL 0.2%透明质酸溶液和25 μL注射用氯化钠溶液。条件对照组和阴性对照组SD大鼠经右后肢膝关节腔内注射50 μL注射用氯化钠溶液。所有组均给药1次。
1.4.3 爪压痛阈值检测 分别于给药2，4，6，8，10，12周时，测定大鼠右后肢爪压痛阈值。将大鼠固定，待其安静后用足底刺痛仪探头对大鼠右后肢爪背侧表面的一小块区域施加一个不断增加的压力。在轻度束缚的情况下，增加机械压力，将大鼠出现发声或退缩反射时的机械压力值记为压痛阈值。
1.4.4 足底疼痛阈值检测 分别于给药2，4，6，8，10，12周时，测定大鼠右后肢足底疼痛阈值。将大鼠置于底部有金属网的笼子中适应30 min后，采用代表不同压力值的von Frey纤维丝从笼下通过金属网依次施加2，4，6，8，10，15，26，60 g的弯曲力到右后肢足底皮肤，每根von Frey纤维丝重复刺激3次，每次两三秒，每次间隔5 s。如果3次刺激中大鼠出现2次爪缩回，则将该弯曲力记为机械疼痛阈值；如果在弯曲力为60 g时大鼠仍无响应，则将足底疼痛阈值记为60 g。
1.4.5 左、右膝关节压痛阈值差检测 分别于给药2，4，6，8，10，12周时，测定大鼠左、右后肢膝关节压痛阈值差。将大小鼠足底刺痛仪的力传感器安装在操作人员的拇指上，将大鼠固定，待其安静后用力传感器分别对大鼠左、右后肢膝关节施加逐渐增大的压力，将大鼠后肢发生退缩时的压力记为膝关节压痛阈值，计算右后肢膝关节压痛阈值与左后肢压痛阈值之间的差值。

1.4.6 自主活动能力检测 分别于给药2，4，6，8，10，12周时，检测大鼠自主活动能力。采用100 cm×100 cm×50 cm旷箱，旷箱底面分成25个边长为4 cm的正方形，旷场上方放置摄像头，将大鼠放在正中格，观察大鼠5 min水平活动情况和垂直活动情况。水平活动得分以爬行总格数计；垂直活动得分以直立次数计。每只大鼠测试前使用乙醇喷洒旷箱消除上只大鼠气味。

1.4.7 关节软骨大体检查 给药6，12周时，每组随机取8只大鼠，行关节软骨大体检查。解剖暴露右后肢膝关节，大体观察膝关节软骨表面并按表1所示评分标准进行分级评分[15]。

1.4.8 苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色 给药6，12周时，每组随机取3只大鼠，解剖暴露右后肢膝关节，小心取出完整右后肢股骨，多聚甲醛固定24 h后，在10% EDTA (pH 7.4)中脱钙21 d，石蜡包埋并切成5 μm厚切片。选取的切片在二甲苯中脱蜡，通过一系列分级乙醇洗涤再水化，随后行苏木精-伊红染色和番红O-固绿染色，按表2所示的4个评分标准分别对右后肢膝关节软骨组织损伤程度进行分级评分[7，15]，以4个指标评分的总和作为判断组织损伤程度的依据。

1.5 主要观察指标 各组大鼠行为学变化，造模侧膝关节软骨的大体和组织病理学检测结果。
1.6 统计学分析 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料若符合正态分布且方差齐性，用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey分析；若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett’s T3检验或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis H检验。所有数据以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已得到北京再生生物科技研究院有限公司质量保证部审核。

讨论

根据全球疾病发展的最新数据，骨关节炎影响了全球7.6%的人口(相当于5.95亿人)，已成为全球性的重大公共卫生问题[16]。间充质干细胞因具有软骨保护效应、成软骨分化潜能、旁分泌功能以及促进细胞外基质合成的作用，被认为是治疗骨关节炎的理想候选药物[11-12]。与其他组织来源间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞具有无创获取、增殖能力强、免疫原性低的特性，在临床使用中更具优势[17-18]。多项临床前和临床研究为人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎的有效性提供了实验依据[11，19-22]。然而，现有研究多局限于单一剂量的疗效观察，缺乏对人脐带间充质干细胞剂量依赖性的系统探究[23]。该研究探讨了关节腔内注射人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎的剂量-效应关系，为后续药物开发提供了基础。
3.1 人脐带间充质干细胞具有缓解关节疼痛的作用 骨关节炎的典型临床表现包括关节疼痛、僵硬及活动功能障碍。虽然软骨组织因缺乏神经血管分布而不直接产生痛觉，但关节软骨周围的滑膜、脂肪垫、韧带、关节囊及软骨下骨等结构均富含感觉神经和交感神经，可引发持续性疼痛和运动障碍，显著降低患者生活质量[24-25]。该研究的行为学检测结果显示，在人脐带间充质干细胞给药2-12周观察期内，与条件对照组相比，阴性对照组大鼠的爪压痛阈值和足底痛阈值降低(P < 0.05)，自主活动能力减退(P < 0.05)，同时双侧膝关节压痛阈值差异增大(P < 0.05)，表现出明显的机械痛觉过敏，这些结果证实关节腔内注射单碘乙酸钠可成功建立符合临床特征的骨关节炎疼痛模型。与阴性对照组比较，人脐带间充质干细胞治疗组的所有行为学指标均有明显改善(P < 0.05)，而透明质酸对照组在疼痛行为和运动功能改善方面未表现出明显作用，该结果与既往研究结论相符[26-28]，表明大鼠的疼痛缓解作用主要来源于人脐带间充质干细胞，而非透明质酸。
3.2 人脐带间充质干细胞具有软骨保护作用 骨关节炎的特征性病理改变主要表现为关节软骨的进行性缺损、纤维化病变、软骨下骨硬化、滑膜炎症反应及边缘骨赘形成[29]。该研究的关节软骨大体评估结果显示，在给药第6周及第12周时，阴性对照组大鼠具有明显的宏观改变，包括滑膜组织增生、软骨表面磨损及糜烂。组织病理学检测结果进一步证实，阴性对照组大鼠的关节软骨存在不规则裂隙形成、基质厚度减少、蛋白聚糖含量降低(表现为番红O染色程度减轻)以及潮线结构破坏等，这些病理特征与HAMDALLA等[7]和ABDEL JALEEL等[30]报道的人类骨关节炎病理表现相似，证明单碘乙酸钠诱导的大鼠骨关节炎模型与人类骨关节炎具有良好的病理学相关性。在治疗干预方面，与阴性对照组相比，透明质酸对照组的软骨损伤具有减轻的趋势，但差异无显著性意义(P > 0.05)。而干细胞治疗组大鼠的滑膜炎症程度和软骨磨损程度明显减轻，表层结构和软骨细胞排列更规则，蛋白聚糖含量明显增加，与阴性对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。临床研究结果也表明人脐带间充质干细胞能够改善骨关节炎患者的多项影像学指标，包括软骨缺损、骨赘形成、骨髓病变、软骨下硬化、关节积液及滑膜炎症等[31-33]。这些结果表明人脐带间充质干细胞具有软骨保护作用，这一特性使其在骨关节炎治疗领域具有重要的临床转化价值。
3.3 人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎的最低有效剂量为8.0×105/关节 剂量-效应关系是影响给药剂量的重要因素。该研究结果显示，在12周的观察期内，随着给药剂量的增加，人脐带间充质干细胞在缓解疼痛和改善关节软骨损伤方面的疗效有增强趋势，但各剂量组间差异无显著性意义(P > 0.05)，表明人脐带间充质干细胞在此剂量范围内(2.5×105-2.5×106/关节)的剂量依赖性不强。与此一致的是，GUPTA等[26]将低剂量(6×105/关节)和高剂量(1.3×106/关节)骨髓间充质干细胞移植至单碘乙酸钠引起的骨关节炎大鼠关节腔内，观察期为12周，结果显示两个剂量组均可缓解关节疼痛和改善软骨损伤，但疗效无明显差异。MATAS等[34]建立了胶原酶诱导的骨关节炎小鼠模型，观察期为6周，结果亦显示低剂量(5×104/关节)和高剂量(2×105/关节)人脐带间充质干细胞的疗效差异无显著性意义。而闫文鑫等[35]探讨了不同剂量(1.5×105-1.5×106/关节)人脐带间充质干细胞对手术法建立骨关节炎大鼠模型的作用，观察期为5周，结果显示人脐带间充质干细胞改善大鼠行为学评分和软骨损伤的作用具有剂量依赖性，其疗效随剂量增加而升高。上述研究的剂量-效应关系不一致可能与模型建立方式和观察期不同有关。
与现有骨关节炎治疗药物不同的是，软骨保护作用是间充质干细胞的独特优势，在选择给药剂量时需更关注软骨保护作用。该研究结果显示干细胞中、高剂量组给药6周和12周时均可降低关节软骨的病理组织评分(P < 0.05)，表明人脐带间充质干细胞在此剂量范围内具有软骨保护作用。此外，安全性也是选择给药剂量的重要考量因素。MATAS等[34]的临床研究表明，关节腔内给予高剂量(8×107)间充质干细胞后，100%患者遭受高度疼痛，40%患者出现滑膜炎症。CHEN等[36]的临床研究结果亦显示3.2×107及以上剂量组的关节注射部位疼痛和肿胀等不良事件的发生率较高，可能与关节间隙小以及死亡细胞引起的炎症反应有关。鉴于间充质干细胞在该研究剂量范围内的剂量依赖性不强，并且关节腔内注射高剂量间充质干细胞的不良反应风险较高，推荐将中剂量(8.0×105/关节)作为人脐带间充质干细胞的最低有效剂量，在疗效未达预期且可耐受的情况下可尝试更高剂量。因该研究采用局部注射给药方式，大鼠给药剂量不能通过体表面积折算法直接换算为人体给药剂量[37]，但后续可探讨人脐带间充质干细胞经动物和人体关节腔内给药后的药代动力学参数，从而为临床使用剂量的换算提供依据。
3.4 局限性 单碘乙酸钠作为甘油醛-3-磷酸脱氢酶的特异性抑制剂，可破坏细胞糖酵解过程使软骨细胞凋亡，从而导致软骨退化和软骨下骨改变[38]。单碘乙酸钠诱导的骨关节炎大鼠模型在临床前研究中广泛使用，该模型的组织病理学和疼痛行为学表现与人类骨关节炎相似，且具有重复性高和模型持续时间长的优点[10，39]。但该模型也因关节结构破坏进展迅速和广泛的组织学损伤受到部分质疑[40]，并且单一的骨关节炎动物模型不能反映人类骨关节炎的所有异质性，病理进展会因动物种属、年龄、环境和性别差异发生变化，因此后续可继续探讨人脐带间充质干细胞在不同动物模型中的剂量-疗效关系。
细胞在体内的存活时间是限制干细胞类药物疗效的重要影响因素。该研究结果显示给药第12周时干细胞低、中、高剂量组的病理组织损伤评分较第6周时均略有升高，可能与细胞在关节腔内的存活时间较短有关。药代动力学研究结果显示间充质干细胞在免疫功能正常的骨关节炎大鼠关节腔内可存活1-8周[41-42]，与该研究的软骨保护作用趋势一致。间充质干细胞在关节腔内的快速清除与免疫排斥有一定相关性，既往研究表明间充质干细胞在免疫功能正常的小鼠关节腔内的存活时间少于1个月[43]；而在免疫缺陷小鼠关节腔内的存活时间为4-6个月[44-45]，提示受体的免疫功能强度影响供体细胞的存活时间。该研究未探讨与免疫抑制剂联合应用或重复给药是否能延长间充质干细胞在关节腔内的留存时间以及增强疗效，后续可进一步深入研究。
结论：该研究评价了不同剂量人脐带间充质干细胞对骨关节炎大鼠的疗效，为人脐带间充质干细胞作为新型骨关节炎治疗药物的开发提供了基础。基于该研究的行为学和组织学结果，可以确定8.0×105/关节为人脐带间充质干细胞治疗骨关节炎大鼠的最低有效剂量，具有缓解疼痛和保护软骨的双重作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程