2.1   实验动物数量分析   实验选用大鼠54只，分成3组，实验过程无动物脱失，全部进入结果分析。
2.2   七叶皂苷对脑出血大鼠神经功能损伤的影响   
2.2.1   Longa评分评估大鼠神经学功能   假手术组大鼠Longa评分均是0，无神经功能损伤；与假手术组相比，脑出血组大鼠Longa评分在术后均明显升高(P < 0.05)；与脑出血组相比，七叶皂苷治疗组大鼠在术后12 h及1，3，5 d的Longa评分均显著降低(P < 0.05)，见图2A。
2.2.2   前肢放置测试、转角实验以及旋转木马试验量化感觉运动功能   与假手术组相比，脑出血组大鼠旋转木马时间和同侧肢体




前肢放置次数比例均显著降低(P < 0.05)，向左侧转角次数比例明显升高(P < 0.05)；与脑出血组相比，七叶皂苷治疗组大鼠在术后12 h及1，3，5 d的旋转木马转棒停留时间和同侧肢体前肢放置次数比例均明显上升(P < 0.05)，而向左侧转角次数比例明显下降(P < 0.05)，见图2B-D。
上述结果说明，七叶皂苷可改善脑出血大鼠的神经功能缺损情况。
2.3   七叶皂苷改善脑组织病理损伤   
2.3.1   苏木精-伊红染色结果   与假手术组相比，脑出血组大鼠脑组织在术后1，3，5 d明显出现出血灶，结构紊乱疏松，呈空泡状水肿，神经元可见大量核固缩等改变；七叶皂苷治疗组大鼠脑组织结构出血灶、胞浆内空泡以及核固缩等在第1天时有所减轻，术后3，5 d时损伤改善更为显著，见图3A。除术后第1天外，七叶皂苷处理在第3，5天可显著减少脑水肿体积，见图3B。
2.3.2   脑含水量测定结果   与假手术组相比，脑出血大鼠在术后1，3，5 d的脑组织含水量显著升高；而同一时间点七叶皂苷治疗组的脑含水量较脑出血组显著降低，见图3C。
2.4   七叶皂苷对氧糖剥夺诱导神经生长因子-PC12细胞损伤和凋亡的保护作用   
2.4.1   CCK-8检测细胞活力结果   氧糖剥夺处理1，1.5，2，2.5 h后，神经生长因子-PC12细胞活力均显著降低(P < 0.05)，其中以2.5 h处理的抑制效应最显著，见图4A。与对照组相比，浓度为5，10，20 μmol/L 的七叶皂苷处理均不影响神经生长因子-PC12细胞活力(P > 0.05)，而浓度为40 μmol/L 和80 μmol/L  的七叶皂苷处理显著降低神经生长因子-PC12细胞活力(P < 0.05)，见图4B。与对照组相比，氧糖剥夺组细胞活力降低(P < 0.05)；与氧糖剥夺组相比，浓度为10 μmol/L和20 μmol/L的七叶皂苷处理可显著提高神经生长因子-PC12细胞活力(P < 0.05)，而40 μmol/L和80 μmol/L的七叶皂苷处理则不改变细胞活力(P > 0.05)，见图4C。
2.4.2   ELISA检测乳酸脱氢水平   乳酸脱氢酶是一种稳定的细胞质酶，当细胞膜受损时乳酸脱氢酶会迅速释放到培养基中。与氧糖剥夺组相比，10 μmol/L和20 μmol/L的七叶皂苷处理可降低培养基中乳酸脱氢酶的释放量(P < 0.05)，而40 μmol/L和80 μmol/L的七叶皂苷处理则对乳酸脱氢酶的释放比没有显著影响(P > 0.05)，见图4D。
基于这些结果，选择10 μmol/L和20 μmol/L的七叶皂苷剂量用于后续实验。
2.4.3   流式细胞术检测细胞凋亡情况   与对照组相比， 氧糖剥夺组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)；与氧糖剥夺组相比，10 μmol/L和20 μmol/L的七叶皂苷处理可显著降低细胞凋亡率(P < 0.05)，见图4E。
上述结果表明，七叶皂苷对氧糖剥夺诱导的神经生长因子-PC12细胞损伤和凋亡具有保护作用。
2.5   七叶皂苷逆转氧糖剥夺对PC12细胞内质网应激相关蛋白水平的促进作用   鉴于内质网应激是脑出血后诱导神经元凋亡的关键分子事件，随后探讨了七叶皂苷的保护作用是否与调控内质网应激及其下游未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)信号通路有关。内质网应激发生时，分子伴侣GRP78从UPR蛋白(IRE1、ATF6 和 PERK)中解离出来，进而激活这些通路以恢复稳态。然而，持续且强烈的内质网应激会导致UPR的促凋亡信号通路过度激活。已有研究表明，脑出血后的大面积缺氧会通过引发内质网应激和钙离子过载，导致神经元凋亡。靶向抑制IRE1/PERK通路对内质网应激介导的细胞凋亡具有较强的神经保护作用[20]。
2.5.1   七叶皂苷缓解内质网应激发挥保护作用   Western blot检测了内质网应激标志蛋白GRP78和促凋亡终末蛋白CHOP的表达，见图5A。结果显示，与对照组相比，氧糖剥夺处理显著上调了GRP78和CHOP的蛋白水平(P < 0.05)，证实氧糖剥夺成功












诱导了细胞内质网应激。然而，七叶皂苷预处理显著抑制了氧糖剥夺诱导的GRP78和CHOP蛋白的上调(P < 0.05)，见图5A，提示七叶皂苷能够缓解氧糖剥夺诱导的内质网应激。
2.5.2   七叶皂苷对UPR三条核心分支通路的影响   结果显示，与对照组相比，氧糖剥夺处理显著上调了p-IRE1/IRE1、 p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值及ATF6表达水平(P < 0.05)。与氧糖剥夺组相比，七叶皂苷预处理显著降低了p-IRE1、p-PERK和p-eIF2α的表达水平(P < 0.05)，但对ATF6的蛋白水平影响不大(P > 0.05)，见图5A。
2.5.3   七叶皂苷对PC12细胞的保护作用依赖于其对内质网应激的抑制   采用内质网应激激动剂衣霉素建立内质网应激细胞模型，4-PBA被用作内质网应激抑制的阳性对照。与对照组相比，衣霉素处理可显著降低细胞活力(P < 0.05)，而七叶皂苷处理能显著逆转这一效应(P < 0.05)，见图5B。
   此外，与对照组相比，衣霉素触发了强烈的内质网应激反应，显著上调了GRP78、CHOP、p-IRE1、p-PERK和ATF6的表达水平(P < 0.05)；与衣霉素组相比，七叶皂苷处理显著下调CHOP、GRP78、p-IRE1及p-PERK蛋白水平(P < 0.05)，对IRE1/PERK通路的抑制模式与4-PBA一致，但七叶皂苷对衣霉素诱导的ATF6表达没有影响(P > 0.05)，见图5C，D。
   流式细胞术结果显示：与对照组相比，衣霉素组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)；与衣霉素组相比，七叶皂苷处理组的细胞凋亡率均显著降低(P < 0.05)，这与4-PBA处理组的结果一致，见图5E，F。
   透射电镜观察发现，衣霉素组细胞可见胞质内细胞器整体排布紊乱，局部区域因内质网扩张呈现疏松空泡样改变；七叶皂苷组与4-PBA组细胞胞质内疏松空泡样区域减少，细胞器排布更趋规整，见图5G。
上述结果说明，七叶皂苷可阻断IRE1/PERK信号通路缓解氧糖剥夺和衣霉素诱导的细胞内质网应激损伤。
2.6   七叶皂苷通过抑制IRE1和PERK信号通路缓解氧糖剥夺诱导的内质网应激和细胞损伤   为验证七叶皂苷的作用机制，分别利用IRE1或PERK的特异性siRNA进行基因敲低，并应用通路激动剂进行功能恢复实验。
2.6.1   IRE1信号通路方面   与NC siRNA组相比，敲低IRE1显著降低细胞中IRE1蛋白表达水平，见图6A。与氧糖剥夺组相比，氧糖剥夺+IRE1 siRNA组与氧糖剥夺+七叶皂苷组细胞中内质网应激标志物GRP78、CHOP以及p-IRE1及其下游效应分子XBP1s的蛋白水平均显著降低(P < 0.05)，见图6B，提示敲低IRE1与七叶皂苷干预对IRE1-XBP1通路的抑制作用一致。



与氧糖剥夺+七叶皂苷组相比，加入IRE1激动剂IXA4后，细胞中GRP78、CHOP、p-IRE1与XBP1s蛋白水平显著升高(P < 0.05)，见图6B，表明IXA4可通过激活IRE1通路，逆转七叶皂苷对该通路的抑制作用。此外，与氧糖剥夺组相比，氧糖剥夺+IRE1 siRNA组与氧糖剥夺+七叶皂苷组的细胞活力均明显升高(P < 0.05)、细胞凋亡率均降低(P < 0.05)，见图6C，D，提示IRE1的基因敲低与七叶皂苷的保护效应一致。
   与氧糖剥夺+七叶皂苷组相比，氧糖剥夺+七叶皂苷+ IXA4组的细胞活力显著下降(P < 0.05)，凋亡率显著升高(P < 0.05)，见图6C，D，表明IRE1的激活逆转了七叶皂苷对细胞损伤的保护作用。
2.6.2   PERK信号通路方面   观察到了与1IRE1信号通路高度一致的结果。与NC siRNA组相比，敲低PERK显著降低了细胞中PERK蛋白表达水平，见图7A。敲低PERK与七叶皂苷处理同样有效地抑制了氧糖剥夺诱导的GRP78、CHOP表达以及p-PERK及其下游靶点eIF2α的磷酸化(P < 0.05)(图7B)，并改善了细胞存活(P < 0.05)(图7C)、抑制了凋亡(P < 0.05)(图7D)。同样地，PERK激动剂CCT020312的共处理也成功恢复了PERK-eIF2α通路的活性、并逆转了七叶皂苷对细胞的保护作用(P < 0.05)(图7B-D)。
以上结果表明，七叶皂苷可通过特异性抑制IRE1-XBP1与PERK-eIF2α信号通路，缓解氧糖剥夺诱导的内质网应激，提高细胞活力、减少细胞凋亡。
2.7   七叶皂苷通过阻断IRE1和PERK信号缓解脑出血后脑水肿与神经功能缺损   为验证七叶皂苷对脑出血大鼠内质网应激的保护作用，构建了脑出血大鼠模型并检测其对脑出血大鼠脑组织中内质网应激相关蛋白表达水平的影响。   
2.7.1   Western blot实验结果   与假手术组相比，脑出血大鼠脑组织中CHOP、GRP78、p-IRE1、p-PERK和ATF6表达水平显著升高(P < 0.05)；与脑出血组相比，七叶皂苷治疗组大鼠脑组织中CHOP、GRP78、p-IRE1和p-PERK表达水平显著降低(P < 0.05)，而ATF6表达水平无显著变化(P > 0.05)，见图8A。
2.7.2   相关性分析结果   为直接验证七叶皂苷的疗效与其机制的相关性，对七叶皂苷治疗组大鼠进行了相关性分析。结果显示，GRP78、p-IRE1和PERK的蛋白表达水平与脑水肿体积呈显著正相关(r=0.957，P=0.003；r=0.939， P=0.005；r=0.983，P=0.000)，同时与神经功能Longa评分亦呈显著正相关(r=0.865，P=0.026；r=0.847，P=0.033；r=0.892，P=0.017)，见图8B-D。这表明，七叶皂苷对p-IRE1和PERK通路的抑制作用越强，其减轻脑水肿和改善神经功能的效果越显著。





综上结果，研究证实七叶皂苷可通过特异性阻断IRE1与PERK信号通路的激活，缓解脑出血大鼠的内质网应激反应，从而发挥神经保护作用。

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脑出血是神经系统中致死率和致残率极高的疾病之一，其病理过程涉及血肿占位效应、炎症反应、氧化应激及继发性凋亡等多重机制[1-2]。研究表明，脑出血后血肿周围组织的病理损伤不仅与机械性压迫相关，更与内质网应激激活引发的细胞凋亡密切关[3-4]。内质网应激通过跨膜蛋白葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulating protein 78，GRP78)与蛋白激酶R样内质网激酶(Protein Kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase，PERK)及肌醇需求酶1(Inositol-requiring enzyme 1，IRE1)解离，触发下游信号通路，导致未折叠蛋白反应失衡，进而激活Caspase-12、CHOP等凋亡相关因子，加剧神经元损伤[5-6]。值得注意的是，脑出血后血肿分解释放的血红蛋白、游离铁离子及氧化应激产物等，可直接破坏内质网稳态，引发细胞凋亡，并通过未折叠蛋白反应成分与细胞因子转录因子的相互作用激活神经炎症信号级联反应[7-8]。因此，靶向抑制脑出血后内质网应激通路激活诱导的细胞凋亡，已成为脑出血神经保护治疗的重要
方向。
七叶皂苷是从七叶树科植物中提取的三萜皂苷类化合物，具有抗炎、抗渗出、促进微循环及清除自由基等作用，近年来，七叶皂苷的神经保护作用已在多种神经性疾病中得到验证。在缺血-再灌注损伤方面，研究发现七叶皂苷可通过调控PRAS40/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路减轻神经元凋亡与脑梗死体    积[9]、以及通过AMP激活的蛋白激酶/小窝蛋白1/基质金属蛋白酶9通路保护血脑屏障，避免缺血性脑卒中出血转化[10]。在创伤性脑损伤模型中，七叶皂苷可激活核因子E2 相关因子 2-抗氧化反应元件-血红素加氧酶1轴抑制炎症及氧化应激，显著缓解脑水肿与认知障碍[11-12]。此外，七叶皂苷还被证实对阿尔茨海默病、帕金森和亨廷顿等神经退行性疾病发挥神经保护作用[13-15]。在脊髓损伤模型中，七叶皂苷通过降低炎症浸润和氧化应激促进运动功能恢复[16]。值得注意的是，在脑出血模型中，团队及其他研究进一步证实，七叶皂苷可通过抑制炎症因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β)释放和减少氧化应激损伤，显著减轻神经功能缺损及血脑屏障破坏[17-18]。
然而，当前关于七叶皂苷在脑出血中的保护机制研究多聚焦于炎症与氧化应激通路，对其是否通过调控内质网应激介导的细胞凋亡发挥作用尚未明确。鉴于GRP78-IRE1/PERK通路激活是脑出血后内质网应激诱导细胞凋亡的核心病理机制[19-20]，提出核心研究假说：七叶皂苷可能通过阻断GRP78-IRE1/PERK通路抑制内质网应激介导的细胞凋亡，从而减轻脑出血后脑水肿与神经功能缺损。为验证此假说，此次研究通过建立大鼠脑出血模型与体外氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation，OGD) /衣霉素诱导的神经细胞损伤模型，明确七叶皂苷对该通路的关键分子(GRP78、p-IRE1、p-PERK、CHOP等)及细胞凋亡的影响，以期为七叶皂苷的临床应用提供新的理论依据和机制靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验、细胞学实验观察；研究设计流程见图1。

1.2   时间及地点   实验于2023年4月至2024年6月在河南中医药大学动物实验中心完成。

1.3   材料
1.3.1   仪器与试剂   七叶皂苷粉末(E1378，纯度≥95%)购自美国Sigma公司；七叶皂苷粉末用无菌的生理盐水溶解，现用现配；4-苯基丁酸(内质网应激抑制剂，4-PBA；P21005)购自Thermo Fisher公司；CCT020312(#HY-119240)和IXA4(#HY-139214)均购自美国MedChemExpress公司；胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM和RPMI 1640培养基均购自美国Thermo Fisher公司；神经生长因子(13257019)购自美国Gibco公司；衣霉素(内质网应激激活剂，ab120296)、CHOP抗体(ab194533)、GRP78 抗体(ab21685)、IRE-1抗体(ab37073)、p-IRE1抗体(ab48187)、激活转录因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)抗体(ab203119)、XBP1抗体(ab37152)、GAPDH抗体(ab9485)、HRP标记的山羊抗兔IgG(ab205718)和山羊抗鼠IgG(ab6789)二抗均购自英国Abcam公司；真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha，eIF2α)抗体(11170-1-AP)和p-EIF2α抗体(68023-1-Ig)购自美国Proteintech公司；PERK(PA5-15,305)，p-PERK(PA5-40,294)购自上海Thermo Fisher公司；青霉素、链霉素和RIPA裂解缓冲液购自中国碧云天生物技术有限公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒(G021-1-2)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(003-1-2)和ECL发光检测试剂盒(W028-2-1)均购自南京建成生物。石蜡包埋机(美国A0820)；离心机(上海安亭仪器厂)；病理组织切片机(美国A0820)；光学显微照相系统(日本OLYMPUS公司)；Rotarod跑步机(中国RAD生物公司)；BioSpa自动培养箱(美国BioTek公司)；流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。
1.3.2   动物   8周龄雄性无特定病原体(SPF级)SD大鼠，体质量250-300 g，购于河南中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(豫)2021-0015。所有动物在实验期间自由采食和饮水，光周期12/12 h，相对湿度为55%，温度为22 ℃。该实验严格遵循动物实验3R原则，所有实验操作均符合《实验动物管理条例》要求，实验方案已通过河南中医药大学动物伦理委员会批准(批号为202302021)，确保实验动物得到人道对待，减少实验过程中动物的痛苦与应激反应。
1.3.3   PC12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞系)   购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.4   实验方法   

1.4.1   脑出血模型建立   参照自体血注射方法构建大鼠脑出血模型[21]。

   造模具体操作如下：大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后消毒并备皮，并固定于脑立体定位仪上，头部正中纵行切口，暴露前卤和冠状缝，在冠状缝前0.2 mm、中线左旁开3.5 mm处用牙钻钻一个直径1 mm的颅骨孔，不伤及硬脑膜及脑组织。使用微量注射器将50 µL的自体血液以50 µL/min的速度注射到大鼠尾状核部，针头在原位停留10 min后缓慢拔出，缝合皮肤切口。假手术组大鼠在相同的位置进行相同的立体定位穿刺操作，只是不注入血液。在所有手术过程中，始终监测心率、血压和体温，直肠温度维持在37 ℃。以Longa评分法评价是否造模成功，评分为2，3分提示模型构建成功，可进行后续实验。 
1.4.2   动物分组干预   将54只大鼠随机分为假手术组、脑出血组及脑出血+七叶皂苷组，每组各18只。各组大鼠于麻醉清醒后(约术后2 h)开始给药，七叶皂苷组大鼠腹腔注射七叶皂苷(10 mg/kg，溶于生理盐水，剂量选择基于先前的体内研究实验[17])，每天2次，持续3 d。假手术组和脑出血组大鼠在相同时间点注射等体积生理盐水。各组大鼠均自由进食水。
1.4.3   大鼠行为学评价   实验各组大鼠于术后清醒后0，6，12 h和1，3，5 d通过前肢放置测试、转角实验、旋转木马试验以及Longa评分对大鼠进行行为学评分。评分由不明分组、非实验人员进行测评。
(1)前肢放置测试：将大鼠握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近。大鼠正常反应为前肢即刻爪向桌面，脑出血损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。触须刺激后，神经功能完整的大鼠会将与刺激触须同一侧的前肢迅速放置到试验台上。每个动物每侧前肢测试10次，确定触须刺激后大鼠将同侧前肢放在工作台面边缘的实验次数。实验设计为6个单元。计算大鼠放置对侧前肢的试验百分比。计算公式：同侧前肢放置次数/10×100%。 该比值越高，代表神经功能损伤越轻。
(2)转角实验：将2块20 cm长的玻璃板组成约30°的角落，当大鼠进入角落深处时，两边触须同时受到刺激，会出现向上向后回转动作，记录小鼠左转情况。每只大鼠测试10次，均只记录大鼠在转身过程中完成一次彻底的转身的次数。计算向左转身的百分比=左侧转身次数/所有转身次数×100%。
(3)旋转木马试验：大鼠在Rotarod跑步机上进行了测试。训练结束后，分别于术后清醒后0，6，12 h和1，3，5 d进行评估。将程序设定为5-35 r/min的加速模式，持续5/min以上。每次测定记录动物停留在跑步机上的最长时间(最多5 min)。每只大鼠各测定3次。数值以基线评估的百分比表示。所有的行为实验在上午8：00至12：00之间进行。
(4)Longa五级评分法：采用Longa五级评分法对各组大鼠的神经功能进行评价。评分标准为：0分，无神经功能缺损；1分，瘫痪侧爪不能完全伸开；2分，行走时向瘫痪侧盘旋；3分，行走时向瘫痪侧跌倒；4分，不能自发行走。评分越高，提示大鼠神经系统损伤越严重。评分为 2，3分提示模型构建成功，纳入后续实验。评分由2名非实验人员按照双盲原则进行评估。
1.4.4   大鼠取材   ①每组在术后1，3，5 d各有4只大鼠经深度麻醉后经心脏灌注固定取脑，用于脑组织病理学观察。②在术后第5天行为学评估后每组剩余的6只大鼠麻醉下断头取脑，沿大脑中线(矢状缝)将大脑精确分为损伤灶所在半球与对侧半球，利用干湿质量法测损伤灶所在半球脑组织含水量(显著大于对侧半球脑组织含水量评定为脑水肿)，对侧半球脑组织立即于-80 ℃冻存用于Western blot检测内质网相关蛋白的表达水平。
脑组织含水量(%)=(W湿-W干)/W湿×100%
1.4.5   苏木精-伊红染色   大鼠采用异氟醚深度麻醉后经心脏灌注固定取脑处死，取出脑组织并置于40 g/L的多聚甲醛中固定48 h，后将脑组织置于脱水机中梯度脱水并浸蜡，切片，切片厚5 μm。将切片分别用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡水化，最后经双蒸水5 min。然后将切片放入苏木精染液染色15 min左右，用盐酸乙醇分化数秒，直至镜下观察细胞核及核内染色质清晰为止。流水冲洗玻片30-60 min返蓝后，用1%伊红染色3-5 min。随后用不同梯度的乙醇脱水，经二甲苯透明后用中性树胶封固，在显微镜下观察并拍照。
1.4.6   细胞培养和糖氧剥夺细胞模型构建   PC12细胞于37 ℃水浴箱中迅速复苏后接种于含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中常规培养，经一两次传代后，收集对数期细胞备用。将PC12细胞与50 ng/mL的神经生长因子孵育24 h，以诱导神经突起形成，作为神经细胞模型。为了建立氧糖剥夺诱导的细胞损伤模型[20]，PC12细胞保存在无血清和无葡萄糖培养基中，并置于无氧(体积分数95% N2，5% CO2)的BioSpa自动培养箱分别培养0.5-2.5 h。
1.4.7   细胞分组及给药   将PC12细胞随机分为以下几组：①对照组：用生理盐水处理细胞24 h；②七叶皂苷组：分别用5，10，20，40，80 μmol/L的七叶皂苷处理细胞24 h；③氧糖剥夺组：PC12细胞氧糖剥夺条件下处理2.5 h；④氧糖剥夺+不同浓度七叶皂苷组：用5，10，20，40，80 μmol/L的七叶皂苷处理细胞24 h后，进行氧糖剥夺处理；⑤衣霉素组：用50 μg/mL的衣霉素处理细胞12 h[20]；⑥衣霉素+七叶皂苷组：用20 μmol/L的七叶皂苷处理细胞24 h，再用衣霉素处理细胞(50 μg/mL 12 h)；⑦衣霉素+4-PBA组：用250 μmol/L的4-PBA处理PC12细胞48 h[20]，然后用衣霉素处理细胞(50 μg/mL 12 h)；⑧氧糖剥夺+七叶皂苷+IXA4(IRE1激动剂)或CCT020312(PERK激动剂)组：用20 μmol/L的七叶皂苷处理细胞24 h，再用IXA4(10 μmol/L 1 h)或CCT020312(5 μmol/L 2 h)处理细胞[22-23]，随后进行氧糖剥夺处理；⑨氧糖剥夺+NC siRNA/IRE1 siRNA(或NC siRNA/PERK siRNA)组：按照制造商的说明利用lipofectamine TM 3000试剂(Thermo Fisher Scientific)将100 nmol/L IRE1 siRNA/PERK siRNA或者各自阴性对照NC siRNA/转染细胞12 h后，再进行氧糖剥夺处理。
1.4.8   细胞活力测定   采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。实验分为：对照组、七叶皂苷组、氧糖剥夺组、氧糖剥夺+不同浓度七叶皂苷组。PC12细胞以1×105/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL的细胞培养液，每组4孔重复。各组细胞处理方法同1.4.7，每孔加入10 μL CCK-8试剂，并在37 ℃培养箱孵育2 h。使用酶标仪在450 nm波长下测定各组吸光度值(A值)。
1.4.9   氧糖剥夺诱导神经生长因子-PC12细胞损伤和凋亡的检测   采用氧糖剥夺处理神经生长因子-PC12细胞构建体外细胞损伤模型。采用AnnexinV-FITC和PI染色法，按照制造商的说明对细胞凋亡情况进行分析。实验分为：细胞分为对照组，氧糖剥夺+0 μmol/L七叶皂苷组，氧糖剥夺+10 μmol/L七叶皂苷组， 氧糖剥夺+20 μmol/L七叶皂苷组。将PC12细胞以1×105 /孔密度接种至6孔板内，每孔加入2 mL的细胞培养液，待细胞融合度达到80%-90%时按照分组分别进行干预处理，方法同1.4.7。收集细胞培养液，PBS洗涤细胞，加入不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，并通过轻柔吹打确保细胞单分散性后收集于流式管中。细胞经过1 000 r/min离心5 min后，弃去上清，PBS洗3次，195 μL流式凋亡结合缓冲液重悬细胞。分别加入5 μL AnnexinV-FITC染色液和5 μL PI染色液，轻轻混匀后，室温避光孵育30 min。使用BD FACSCantoTM Ⅱ流式细胞仪分析计算细胞凋亡率。
1.4.10   乳酸脱氢酶水平检测   采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同剂量七叶皂苷预处理对氧糖剥夺诱导的细胞乳酸脱氢酶释放量的影响。细胞干预方法同1.4.7④。收集各处理组细胞培养液，离心取上清液转移至96孔板后，每组设立4个复孔，每孔加入60 μL乳酸脱氢酶检测工作液，混匀、室温避光孵育30 min，在酶标仪490 nm处测定吸光度值，计算各组细胞的乳酸脱氢酶活力，以此来评估细胞死亡情况。
1.4.11   电镜观察细胞内结构变化   将PC12细胞以1×105 /孔密度接种至6孔板内，每孔加入2 mL的培养液，分别进行不同干预处理(对照组、衣霉素组、衣霉素+七叶皂苷组、衣霉素+4-PBA组)后，将PC12细胞置于3%戊二醛中，4 ℃固定过夜；次日弃去戊二醛固定液，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次15 min，随后转入1%四氧化锇固定液中，室温下重新固定1 h。固定完成后，用梯度浓度丙酮进行脱水处理。对脱水后的细胞用Epon 812包埋，然后使用超薄切片机对包埋块进行切片，制备厚度为60 nm的超薄切片。随后，将切片用醋酸铀酰在室温下染色10 min，用双蒸水冲洗3次；再置于柠檬酸铅染色液中，在室温下染色2 min。最后采用透射电镜(JEM-1400FLASH，日本电子株式会社)进行观察并拍照。
1.4.12   Western blot法检测内质网应激相关蛋白   利用含有1 mmol/L蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取PC12细胞和大鼠脑组织中的总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。取40 μg蛋白上样，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙膜上。然后，用5%脱脂牛奶在37 ℃下封闭膜2 h后，加入anti-CHOP(1∶1 000)、anti-GRP78(1∶1 000)、anti-p-IRE1(1∶1 000)、anti-IRE1(1∶1 000)、anti-ATF6(1∶800)、anti-p-PERK(1∶1 000)、anti-PERK(1∶1 000)、anti-p-eiF2α(1∶5 000)、anti-eiF2α(1∶5 000)、XBP1(1∶500)和GAPDH(1∶1 500)一抗，在4 ℃下孵育过夜。用TBST冲洗3次后，加二抗在37 ℃下孵育1 h，然后使用ECL试剂进行可视化。最后，采用Image J软件进行定量分析。
1.5   主要观察指标   ①大鼠Longa法评分；②脑组织的病理学变化；③PC12细胞活力和凋亡情况；④脑组织和PC12细胞中内质网应激相关蛋白表达水平。
1.6   统计学分析   使用SPSS 22.0软件进行数据分析，采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验，符合正态分布的数据采用x±s表示，多组间数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析，两两比较采用Tukey-HSD法。通过Pearson相关系数确定七叶皂苷治疗组大鼠脑组织中内质网应激相关蛋白表达水平与脑水肿体积和Longa评分之间的关系。P < 0.05被认为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经河南中医药大学生物统计学专家审核。

改善血脑屏障损伤、抑制神经细胞凋亡、控制血肿周围水肿等继发性脑损伤，是缓解脑出血诱导的神经功能受损的重要机制[24-25]。此次实验通过七叶皂苷干预SD大鼠脑出血模型，从早期神经功能缺损评分、脑含水量、脑组织病理等角度验证了其保护效应。与假手术组相比，脑出血大鼠脑含水量显著升高，显示脑出血后急性脑水肿的典型病理特征；而七叶皂苷治疗组大鼠脑含水量显著降低，直接证实其可有效缓解脑出血诱发的脑水肿，这与七叶皂苷既往被证实的“抗渗出、改善微循环”药理特性一致[10]。苏木精-伊红染色结果进一步显示，七叶皂苷可减少脑组织空泡和水肿，维持脑组织结构完整性。结合神经功能缺损评分的改善，共同表明七叶皂苷可通过减轻继发性脑损伤(如血脑屏障破坏、神经细胞凋亡)缓解脑出血后的神经功能障碍，这与以往研究所报道的七叶皂苷通过抑制炎症因子释放、减轻氧化应激发挥神经保护相一致[17，26]。
在脑出血病理进程中，内质网应激诱导的细胞凋亡是脑出血期间神经元神经元损伤的核心环节[27]。在应激状态下，内质网稳态失衡导致错误折叠蛋白蓄积，触发未折叠蛋白反应。生理状态下UPR通过重建细胞内稳态发挥保护作用，但若应激持续存在，UPR过度激活将通过上调CHOP等促凋亡分子启动细胞死亡程序[28]。GRP78通过诱导UPR蛋白调节内质网应激反应。GRP78作为内质网应激的核心调控分子，通过介导下游PERK-eIF2α、IRE1α-XBP1及ATF6三条信号分支调控UPR进程[29]。大量研究证实，抑制内质网应激相关通路可显著减轻脑出血大鼠的脑水肿与神经功能障碍[30-32]，这为此次研究探索七叶皂苷的作用机制提供了重要依据。研究显示，七叶皂苷可抑制脑出血大鼠脑组织的内质网应激反应，这与“干扰PERK/ATF4通路可抑制内质网氧化应激、减轻神经元损伤”的报道一致[33-35]。类似地，CHEN等[36]报道瓜萎桂枝物可降低氧化应激诱导的损伤，促进钙动态平衡，从而抑制内质网应激，对神经元缺血性损伤起抗凋亡作用，这与GRP78/PERK/ATF4信号通路的密切相关。从UPR三条通路的分工来看，ATF6通路主要通过调控内质网相关降解系统清除错误折叠蛋白，其短暂激活主要发挥适应性保护功能[37]；当应激过于严重或持续时间过长，ATF6介导的适应性反应不足以解决问题时，PERK和IRE1α通路的持续激活将主导促凋亡信号[38]。此次研究中，无论是氧糖剥夺诱导的细胞模型还是脑出血大鼠模型，七叶皂苷能特异性抑制IRE1α和PERK的磷酸化及其下游凋亡信号，而对ATF6通路无显著影响，这表明七叶皂苷的神经保护作用源在不妨碍早期保护性信号的同时，有效阻断了IRE1/PERK通路下游促凋亡通路的激活。此外，已有研究表明与七叶皂苷药理活性完全相同的七叶皂苷钠可通过调节激酶磷酸化水平发挥作用[39-40]，而ATF6的激活主要依赖于高尔基体剪切加工[41]，其调控机制与PERK/IRE1α的磷酸化激活存在本质差异，这可能导致七叶皂苷对ATF6通路缺乏直接调控能力。这一结果也提示，不同抗内质网应激药物可能存在通路选择性，未来需针对不同通路设计特异性药物，以实现更精准的治疗。
此次研究证实七叶皂苷能有效抑制脑出血后GRP78-IRE1/PERK通路的过度激活，这一发现的意义可能远超于单纯缓解内质网应激本身。近年来研究进一步揭示，内质网应激与线粒体功能障碍密切相关，构成凋亡信号放大的关键环节[42-44]。一项关于脑出血的最新研究揭示，PERK/ATF4通路的持续激活会直接调控线粒体单碳代谢的关键酶(如MTHFD2)，影响其生成NADPH的能力，从而导致线粒体氧化应激并最终诱发神经元凋亡。MTHFD2可能会在内质网中稳定GRP78，与GRP78/PERK/ATF4轴形成负反馈回路，以维持内质网的稳态[33]。此外，七叶皂苷活性成分已被证实在多种疾病中可通过有效缓解线粒体功能障碍，改善疾病进展[45-46]。重要的是，七叶皂苷通过抑制Pg-LPS诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能障碍发挥抗凋亡作用[47]。因此，推测七叶皂苷抑制PERK通路不仅缓解了内质网本身的应激压力，更可能通过缓解由ATF4介导的线粒体功能障碍，进而抑制了凋亡信号的最终执行。未来研究直接检测七叶皂苷对脑出血后线粒体功能指标的影响，将能有力验证这一推论。
此次研究证实七叶皂苷通过靶向GRP78-IRE1/PERK轴缓解内质网应激，表明七叶皂苷具有抗内质网应激的神经保护作用，这为其临床应用于脑出血治疗提供了崭新的精准医学视角和潜在的生物标志物。未来临床研究可重点探索基于影像学(核磁共振成像评估脑水肿程度)或体液生物标志物(如GRP78、CHOP动态变化)来确定七叶皂苷的最佳治疗时间窗，可能是在继发性损伤高峰来临前的预防性或早期干预阶段给药，或可获得最大疗效。目前，与七叶皂苷药理活性高度一致的七叶皂苷钠，已在临床与甘露醇、依达拉奉等药物联合用于脑出血治疗，减轻脑水肿和改善血液循环[48-50]。相较于其他靶向IRE1或PERK通路的特异性抑制剂，七叶皂苷作为多靶点药物，兼具抗内质网应激、抗炎、改善微循环的协同作用优势。因此，未来可探索其与靶点更单一的神经保护剂(如特异性IRE1α抑制剂)进行低剂量联合用药，可能是克服其局限性、增强疗效并减少不良反应的重要方向。
综上所述，此次研究证实七叶皂苷可通过抑制氧糖剥夺或衣霉素诱导的神经细胞内质网应激，减轻细胞凋亡；其核心机制在于阻断GRP78-IRE1/PERK信号通路，从而缓解脑出血诱导的神经功能损伤。但研究仍存在局限性：①研究仅观察了七叶皂苷通过IRE1/PERK信号通路在脑出血后发挥抗凋亡作用，但具体的分子机制还没有研究；②只研究了七叶皂苷对脑出血血肿周围神经凋亡的影响，未进一步探讨七叶皂苷的抗氧化损伤作用、以及对血管和神经再生等影响，这些都需要进一步的研究；③研究仅探讨了七叶皂苷通过缓解内质网应激抑制神经元凋亡，但没有研究其在脑出血后线粒体功能障碍中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脑出血后，血肿周围神经元面临内质网应激(ERS)的致命威胁——错误折叠蛋白堆积触发“未折叠蛋白反应”(UPR)，过度激活则会启动细胞凋亡程序。本研究揭示七叶皂苷可通过选择性抑制IRE1/PERK通路，显著降低内质网应激核心蛋白GRP78、CHOP及磷酸化IRE1/PERK的表达，从而减轻神经元凋亡和脑水肿，改善脑出血大鼠脑损伤。#br# 内质网就像神经细胞的“蛋白质质检工厂”，脑出血后工厂因缺氧、毒素堆积而瘫痪，发出“自杀信号”。七叶皂苷如同一位聪明的“维修队长”，优先修复IRE1/PERK两条核心生产线，快速恢复工厂秩序，减少细胞死亡。这一机制不仅解释了其抗水肿、抗凋亡和神经保护作用的传统药效，更为精准治疗脑出血提供了新靶点。七叶皂苷钠注射液已用于脑出血临床治疗，本研究为其联合神经保护药物(如内质网应激抑制剂)提供了理论依据。未来或可开发针对IRE1/PERK通路的特异性抑制剂，进一步提升脑出血预后疗效。

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