优化全血分离工艺制备治疗级血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护作用

doi:10.12307/2026.223

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (19): 4983-4989.doi: 10.12307/2026.223

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

优化全血分离工艺制备治疗级血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护作用

蒋丽红1，2，林富文1，陈迎1，2，黄雨晨1，2，彭绍静1，陈洁润1，2，苏常山1，2，钟周琳1，2

1南宁中心血站，广西壮族自治区南宁市 530007；2南宁输血医学研究所，广西壮族自治区南宁市 530007

收稿日期:2025-08-01 接受日期:2025-10-22 出版日期:2026-07-08 发布日期:2026-02-24
通讯作者: 钟周琳，硕士，主任技师，南宁中心血站，广西壮族自治区南宁市 530007；南宁输血医学研究所，广西壮族自治区南宁市 530007；共同通讯作者：苏常山，副主任医师，南宁中心血站，广西壮族自治区南宁市 530007；南宁输血医学研究所，广西壮族自治区南宁市 530007
作者简介:蒋丽红，女，1990年生，广西壮族自治区南宁市人，壮族，主管技师，主要从事输血医学研究检测相关工作。
基金资助:
广西壮族自治区卫生健康委自筹经费科研课题(Z-A20231264)，项目负责：蒋丽红；广西壮族自治区卫生健康委自筹经费科研课题(Z-A20231265)，项目负责人：钟周琳

Protective effect of optimization of the whole blood separation process to prepare therapeutic-grade platelet lysate on cardiomyocytes from hypoxic injury

Jiang Lihong1, 2, Lin Fuwen1, Chen Ying1, 2, Huang Yuchen1, 2, Peng Shaojing1, Chen Jierun1, 2, Su Changshan1, 2, Zhong Zhoulin1, 2

1Nanning Central Blood Station, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Nanning Institute of Transfusion Medicine, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2025-08-01 Accepted:2025-10-22 Online:2026-07-08 Published:2026-02-24
Contact: Zhong Zhoulin, MS, Chief technician, Nanning Central Blood Station, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Nanning Institute of Transfusion Medicine, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Co-corresponding author: Su Changshan, Associate chief physician, Nanning Central Blood Station, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Nanning Institute of Transfusion Medicine, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Jiang Lihong, Technician-in-charge, Nanning Central Blood Station, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Nanning Institute of Transfusion Medicine, Nanning 530007, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Self-Funded Research Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region Health Commission, No. Z-A20231264 (to JLH); Self-Funded Research Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region Health Commission, No. Z-A20231265 (to ZZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血小板裂解液：是一种通过裂解血小板并收集其释放的细胞内成分而制备的液体，富含血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β等生长因子及其他生物活性分子，在细胞增殖、迁移、组织修复、调节细胞行为和免疫反应中起着重要作用。
心肌细胞缺氧损伤：是指心肌细胞因氧气供应不足或利用障碍导致的代谢异常、结构破坏及功能受损的病理过程。血小板裂解液的生物活性分子可通过激活细胞内的信号通路，诱导心肌细胞及相关修复细胞的增殖与分化，进而促进受损心肌细胞的修复。

摘要
背景：血小板是重要的血液资源，然而在常规的血站工艺流程下却常与白细胞一起被滤除为医疗废物，优化全血分离工艺制备血小板裂解液制品并探索其在组织工程和再生医学等领域的应用具有重要价值。
目的：优化全血分离工艺制备治疗级血小板裂解液，探讨血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护作用。
方法：在封闭血袋及管路条件下分离21份合格全血的血小板，采用冻融法制备21份血小板裂解液，应用酶联免疫试剂盒检测血小板裂解液中的血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1的质量浓度范围，分别采用菌落培养法和支原体PCR检测试剂盒观察活菌和支原体的污染情况；建立心肌细胞缺氧模型，评估血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护效果。
结果与结论：①血小板裂解液主要生长因子和细胞因子的质量浓度范围：血小板衍生生长因子AA为12.86-24.17 μg/L、血小板衍生生长因子BB为0.25-0.32 μg/L、血小板衍生生长因子AB为85.09-114.91 μg/L、血管内皮生长因子为10.57-58.37 μg/L、表皮生长因子为0.43-0.69 μg/L、胰岛素样生长因子1为106-204.9 μg/L、成纤维细胞生长因子为0.03-0.06 μg/L、转化生长因子β1为124.17-192.38 μg/L；②菌落培养及支原体检测结果呈阴性；③低体积分数(1%)血小板裂解液培养的心肌细胞增殖效率最高；低体积分数(1%)血小板裂解液刺激心肌细胞产生高水平超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶以保护心肌细胞。该研究通过优化全血分离工艺建立了制备治疗级血小板裂解液的方法，可提高血液资源的利用率。血小板裂解液的主要生长因子水平高，可显著促进缺氧损伤心肌细胞的修复。

https://orcid.org/0009-0000-8476-2587 (钟周琳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血小板裂解液, 富血小板血浆, 生长因子, 细胞培养, 心肌细胞, 超氧化物歧化酶, 谷胱甘肽过氧化物酶

Abstract: BACKGROUND: Platelets, crucial blood components, are commonly discarded along with white blood cells in traditional blood processing and become medical waste. Optimizing whole blood separation processes to prepare platelet lysate products and exploring their applications in tissue engineering and regenerative medicine are of great value.
OBJECTIVE: To optimize blood separation for therapeutic-grade platelet lysate production and explore the protective impact of platelet lysate on myocardial hypoxia injury.
METHODS: Twenty-one platelets were isolated from whole blood using a closed blood bag and tubing system, followed by the preparation of twenty-one platelet lysates through the freeze-thaw method. The concentrations of platelet-derived growth factors (platelet-derived growth factor AA, platelet-derived growth factor BB, and platelet-derived growth factor AB), vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, fibroblast growth factor, and transforming growth factor-β1 in the platelet lysate were quantified using an enzyme-linked immunosorbent assay kit. Detection ranges for these factors were determined. Bacterial and mycoplasma contamination were observed using the colony culture method and a Mycoplasma PCR detection kit, respectively. A hypoxic cardiomyocyte model was established to evaluate the protective effects of platelet lysate on hypoxia-stressed cardiomyocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The concentration ranges of major growth factors and cytokines in platelet lysates were as follows: platelet-derived growth factor AA: 12.86-24.17 μg/L, platelet-derived growth factor BB: 0.25-0.32 μg/L, platelet-derived growth factor AB: 85.09-114.91 μg/L, vascular endothelial growth factor: 10.57-58.37 μg/L, epidermal growth factor: 0.43-0.69 μg/L, insulin-like growth factor 1: 106-204.9 μg/L, fibroblast growth factor: 0.03-0.06 μg/L, transforming growth factor β1: 124.17-192.38 μg/L. (2) Colony culture and mycoplasma detection yielded negative results. (3) The efficiency of cardiomyocyte proliferation was highest with a low concentration (1%) of platelet lysate in culture. A 1% concentration of platelet lysate effectively stimulated cardiomyocytes to produce high levels of superoxide dismutase and glutathione peroxidase, providing protective effects for cardiomyocytes. This study established a method for preparing therapeutic-grade platelet lysate by optimizing the whole blood separation process, thereby improving the utilization of blood resources. Platelet lysate, rich in essential growth factors, significantly promotes the repair of hypoxic injuries in cardiomyocytes.

Key words: platelet lysate, platelet-rich plasma, growth factor, cell culture, myocardial cell, superoxide dismutase, glutathion peroxidase

中图分类号:

蒋丽红, 林富文, 陈迎, 黄雨晨, 彭绍静, 陈洁润, 苏常山, 钟周琳. 优化全血分离工艺制备治疗级血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(19): 4983-4989.

Jiang Lihong, Lin Fuwen, Chen Ying, Huang Yuchen, Peng Shaojing, Chen Jierun, Su Changshan, Zhong Zhoulin. Protective effect of optimization of the whole blood separation process to prepare therapeutic-grade platelet lysate on cardiomyocytes from hypoxic injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(19): 4983-4989.

图/表（结果） 7

2.1 血小板裂解液中生长因子和细胞因子水平 酶联免疫吸附试验结果显示，血小板裂解液中血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β以及血小板因子4的质量浓度均处于较高水平，见表1。

2.2 血小板裂解液的菌落检测结果 经琼脂平板菌落培养检测显示，21份血小板裂解液样本均未观察到菌落生长，菌落计数结果为0 CFU/mL，表明所制备的血小板裂解液具有良好的无菌性，见图1。

2.3 血小板裂解液支原体检测结果 采用支原体检测试剂盒对21份血小板裂解液样本进行检测，结果显示所有样本均未出现支原体污染，见图2。

2.4 低体积分数(1%)血小板裂解液能快速且高效修复因缺氧损伤的人心肌细胞 在体积分数1%时心肌细胞活力：血小板裂解液 >富血小板血浆 > 新鲜血浆(均P < 0.001)；在体积分数5%时心肌细胞活力：富血小板血浆> 血小板裂解液 >新鲜血浆(均P < 0.001)。血小板裂解液在体积分数1%时心肌细胞活力显著高于其他体积分数(均P < 0.001)，富血小板血浆在体积分数5%时心肌细胞活力达到峰值(均P < 0.001)。体积分数1%血小板裂解液组心肌细胞活力显著高于体积分数5%富血小板血浆组(P < 0.001)。因此，低体积分数(1%)血小板裂解液在心肌细胞损伤修复方面明显较富血小板血浆以及新鲜血浆更突出，但随着体积分数的上升(10%和20%)，其细胞损伤修复作用反而减弱。相较之下，低体积分数(1%)血小板裂解液的修复效率显著高于富血小板血浆和新鲜血浆。即使在体积分数增加的情况下，高体积分数(≥5%)富血小板血浆和新鲜血浆对损伤心肌细胞的修复效率也明显低于低体积分数(1%)血小板裂解液，见图3。

2.5 低体积分数血小板裂解液可促进缺氧损伤人心肌细胞增殖 各组间细胞总数存在显著差异(P < 0.001)。对于血小板裂解液，体积分数1%组细胞总数显著高于体积分数5%组和体积分数10%组(均P < 0.001)，且体积分数5%组细胞总数显著高于体积分数10%组(P < 0.001)。对于富血小板血浆，体积分数5%组显著高于体积分数1%组和体积分数10%组(均P < 0.001)。对于新鲜血浆，体积分数5%组显著高于体积分数1%组和体积分数10%组(均P=0.024)。当体积分数控制在1%时，血小板裂解液组细胞总数显著高于富血小板血浆组和新鲜血浆组(均P < 0.001)。当体积分数控制在5%时，新鲜血浆组细胞总数显著低于血小板裂解液组(P=0.003)和富血小板血浆组(P=0.006)。当体积分数控制在10%时，富血小板血浆组细胞总数显著高于血小板裂解液组(P < 0.001)和新鲜血浆组(P=0.008)，而新鲜血浆组显著高于血小板裂解液组(P < 0.001)。
各组间细胞存活率存在显著差异(P < 0.001)。对于血小板裂解液，体积分数1%组细胞存活率显著高于体积分数5%组和10%组(均P < 0.001)，且体积分数5%组细胞存活率显著高于体积分数10%组(P < 0.001)。对于富血小板血浆，体积分数10%组细胞存活率显著高于体积分数1%组和体积分数5%组(均P < 0.001)，且体积分数5%组细胞存活率显著高于体积分数1%组(P < 0.001)。对于新鲜血浆，体积分数10%组细胞存活率显著高于体积分数1%组和体积分数5%组(均P < 0.001)，且体积分数5%组细胞存活率显著高于体积分数1%组(P < 0.001)。当体积分数控制在1%时，血小板裂解液组细胞存活率显著高于富血小板血浆组和新鲜血浆组(均P < 0.001)，而富血小板血浆组细胞存活率显著低于新鲜血浆组(P < 0.001)。当体积分数控制在5%时，血小板裂解液组细胞存活率显著高于富血小板血浆组和新鲜血浆组(均P < 0.001)，而富血小板血浆组细胞存活率显著低于新鲜血浆组(P < 0.001)。当体积分数控制在10%时，富血小板血浆组细胞存活率显著高于血小板裂解液组和新鲜血浆组(均P < 0.001)，而血小板裂解液组细胞存活率显著低于新鲜血浆组(P < 0.001)。
因此，根据细胞总数和细胞存活率的比较得出：体积分数1%血小板裂解液修复损伤心肌细胞的能力以及促进细胞增殖的效率均显著优于富血小板血浆和新鲜血浆。低体积分数血小板裂解液组的细胞总数和细胞存活数均高于富血小板血浆组和新鲜血浆组，这进一步证实了低体积分数血小板裂解液在心肌细胞损伤修复和增殖中的优势，见表2。

2.6 低体积分数(1%)血小板裂解液通过快速合成和分泌超氧化物歧化酶从而维持细胞的稳定性和完整性 低体积分数(1%)血小板裂解液和富血小板血浆均能显著促进心肌细胞快速合成和分泌超氧化物歧化酶，高体积分数富血小板血浆在这方面的效果略优于血小板裂解液，而新鲜血浆在这一过程中的效果则明显偏弱，见图4。

2.7 低体积分数(1%)血小板裂解液可通过促进细胞谷胱甘肽过氧化物酶快速合成和分泌以减轻细胞氧化损伤 低体积分数(1%)血小板裂解液和富血小板血浆均能显著促进心肌细胞快速合成和分泌谷胱甘肽过氧化物酶，但血小板裂解液能减少外来物的注入，避免了细胞膜的免疫原性风险。然而随着体积分数升高，高体积分数富血小板血浆在促进谷胱甘肽过氧化物酶合成和分泌方面的效果略优于血小板裂解液，而新鲜血浆无论体积分数高低在此过程中的效果均显著较弱，见图5。

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引言

浓缩血小板制品在输血领域广泛应用于预防或治疗血小板减少或功能障碍引起的出血性疾病。近年再生医学和组织工程等领域聚焦于血小板(因含有多种生长因子和生物活性分子)的开发，衍生出富血小板血浆、富血小板纤维蛋白及血小板裂解液等血小板衍生制品，其中血小板裂解液作为第3代血小板衍生制品，生长因子和生物活性成分含量更高，而且可以在4-10 ℃保存14 d或冰冻保存更长的时间，克服了富血小板血浆对温度敏感、不能在4 ℃以下保存且保存期短的难题[1-2]。血小板裂解液更容易实现标准化的制备程序，这种特性使它能够成为即用型的替代医疗产品，展现出广阔的临床应用前景[2]。然而，在常规的血站工艺流程下全血中的血小板却常伴随白细胞被作为医疗废物滤除，导致血小板资源的浪费。在当前血液资源紧张的背景下，如何充分利用全血中的血小板资源制备血小板衍生制品具有重要的意义。
心肌梗死发生时，冠状动脉流向心脏的血液供应不足导致心肌细胞遭受氧化应激，心肌细胞因氧气供应不足或利用障碍导致自身代谢异常、结构破坏及功能受损，从而造成了心肌细胞缺氧损伤，进而引发细胞凋亡[3]。在现有文献报道中，尚未见涉及血小板裂解液应用于心肌细胞培养的相关研究。因此，开展血小板裂解液在心肌细胞增殖培养领域的研究，具有十分重要的价值与探索意义。血小板裂解液主要是通过丰富的生长因子、细胞因子及生物活性物质对心肌细胞缺氧损伤发挥保护作用，另外，血小板裂解液可通过多靶点协同作用(包括促血管新生、抗凋亡、抗炎、抗氧化、代谢调控)，有效减轻心肌细胞缺氧损伤，促进组织修复[4-6]。由此可见，血小板裂解液的天然组合成分相较于单一因子在治疗方面更具优势，系统探究血小板裂解液对心肌细胞损伤的保护与再生机制，为心脏修复领域的研究提供了新的思路和方向。
该研究以南宁中心血站采集的全血为原料，通过优化全血分离工艺，分离获得浓缩血小板，随后进一步制备成血小板裂解液，有效避免了血液资源的浪费。同时，构建心肌细胞缺氧模型，通过定量检测超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平[7]，从而系统评估血小板裂解液在心肌细胞缺氧损伤的保护效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外应用对比实验研究。
1.2 时间及地点 实验于2023年6月至2024年12月在南宁中心血站成分科及输血医学研究所的血小板免疫学实验室和细胞工程实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 浓缩血小板 从全血分离的21份浓缩血小板由南宁中心血站成分科提供。因血小板具有容易被激活的特点[8]，如果不滤除血小板，血小板留在悬浮红细胞制品内，可能会增加输血不良反应的发生率[9]，故中国采供血系统为临床供应的血小板制品主要为单采血小板。当前血站常规工艺流程里，全血中的血小板随白细胞一同被滤除，作为医疗废物处理，在一定程度上造成了血液资源的浪费。该实验通过优化全血分离工艺，在全血采集后成分分离前进行浓缩血小板制备，以达到充分利用血液资源的目的，并为血小板裂解液的研究提供了新的原料来源。血小板的分离与制备过程严格遵循《血站技术操作规程(2019版)》中白膜法所规定的标准操作程序。实验所用浓缩血小板均来源于2023年在南宁中心血站参与无偿献血的健康献血者所捐献的400 mL全血，分离血小板后不影响其他血液成分的临床应用。经标准化分离制备后，选择体积分数范围为900×109 L-1至
1 100×109 L-1的浓缩血小板。对照组富血小板血浆为未进行冻融的浓缩血小板，对照组血浆为浓缩血小板经0.22 μm过滤后的血浆。此研究已通过南宁中心血站伦理审查委员会的批准(伦理审查批号：2023-EC-03)，并按照伦理意见征得献血者知情同意，所有献血者均签署知情同意书。
1.3.2 细胞、试剂与仪器 人心肌细胞(普诺赛，K2V0603IZI)；人血小板衍生生长因子AA酶联免疫试剂盒(华美生物，批号：Q15016724)；人血小板衍生生长因子BB ELISA试剂盒(欣博盛生物，批号：H240531-181a)；人血血小板衍生生长因子AB酶联免疫试剂盒(华美生物，批号：Q16016725)；人血管内皮生长因子ELISA试剂盒(欣博盛生物，批号：H240531-108a)；人表皮生长因子ELISA试剂盒(欣博盛生物，批号：H240531-126a)；人胰岛素样生长因子1酶联免疫试剂盒(华美生物，批号：Q02016726)；人碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒(欣博盛生物，批号：H240531-130a)；人转化生长因子β1 ELISA试剂盒(欣博盛生物，批号：H240531-107a)；支原体检测试剂盒(BI，批号：2107145)；DMEM培养基(Gibco，批号：6124401)；胎牛血清(Gibco，批号：2287582CP)；MEM培养基(Gibco，批号：6123136)；胰蛋白酶(索莱宝，240001001)；人超氧化物歧化酶酶联免疫吸附试验试剂盒(睿信生物，批号：2024110166607)；人谷胱甘肽过氧化物酶酶联免疫吸附试验试剂盒(睿信生物，批号：2024110166607)；CCK-8(GLPBIO，批号：359549)；酶标仪(TECAN)；真空过滤系统(Biosharp，批号：21307675)；二氧化碳培养箱(Eppendorf，cellXpert C170i)；生物安全柜(海尔，HR30-IIA2)；全自动细胞计数仪(Bio-Rad，TC20)。
1.4 方法
1.4.1 血小板裂解液的制备 将21份经检测合格的浓缩血小板采用反复冻融法(-80 ℃/37 ℃)冻融5次使血小板破裂。将破裂后的血小板混合液置于离心机中，以4 000×g的离心力离心20 min，取上清液，通过0.22 μm真空过滤系统进行过滤，以去除残留的细胞碎片和杂质，制成最终的血小板裂解液。将制备好的血小板裂解液分装至15 mL无菌、无内毒素、无热源质的离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.4.2 酶联免疫吸附试剂盒检测主要生长因子和细胞因子水平 血小板破裂后，释放出α颗粒中的多种生长因子和细胞因子。为评估所制备血小板裂解液的生物活性，采用酶联免疫吸附试剂盒检测血小板裂解液中的关键生长因子和细胞因子水平：血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子AB、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β以及血小板因子4。
1.4.3 菌落培养 采用琼脂平板培养法对血小板裂解液进行无菌检测。取1 mL 血小板裂解液样本均匀涂布于不同琼脂平板上，做好标记后将平板置于生化培养箱中，在37 ℃条件下培养24 h，培养结束后取出平板，读取并记录菌落数。
1.4.4 支原体检测 根据支原体检测试剂盒说明书，对21份血小板裂解液样本进行支原体检测。通过琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统分析检测结果，以确定血小板裂解液样本的支原体污染情况。
1.4.5 人心肌细胞的获取和处理 将购买的人心肌细胞复苏后在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2条件下进行培养，待细胞生长至状态最佳时，采用胰蛋白酶对细胞进行消化处理，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基以终止消化。收集细胞悬液，并按照2×104/孔的密度接种于96孔板，以及1×105/孔的密度接种于6孔板。将接种后的细胞转移至含有体积分数95%空气和体积分数5% CO2的培养箱中，在37 ℃条件下培养2 d，使细胞适应新的培养环境并达到适宜的生长状态，以供后续实验使用。
1.4.6 心肌细胞缺氧/复氧方案和分组 为模拟体内缺血缺氧状态并进行复氧修复，对培养的心肌细胞进行了以下处理[3]。将心肌细胞的培养基更换为不含胎牛血清的无糖MEM培养基，再将细胞置于缺氧袋中培养5 h，以模拟缺血缺氧状态。缺氧处理结束后，向培养皿中分别加入含不同体积分数血小板裂解液(1%，5%，10%，20%)或相应体积分数的富血小板血浆或新鲜血浆的DMEM培养基。将细胞转移至37 ℃、体积分数5% CO2培养箱进行20 h的复氧处理，以模拟复氧修复过程。
1.4.7 细胞活力测定 根据CCK-8试剂说明书操作规程检测各组细胞的活力。复氧处理完成后立即向96孔板的每孔中加入10 μL CCK-8溶液，随后将培养板放回CO2培养箱中继续培养3 h。培养结束后，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度值，以评估细胞的活力水平。所有实验均重复3次，统计平均值。
1.4.8 细胞增殖效率测定 复氧处理完成后，采用全自动细胞计数仪检测各组细胞的增殖效率。将6孔板中的细胞在相同条件下用胰蛋白酶消化处理，收集细胞悬液，调整总体积至3 mL。向细胞悬液中加入适量锥虫蓝染液，利用全自动细胞计数仪对各组细胞总数及细胞存活数进行精确计数，以评估细胞的增殖效率。所有实验均重复3次，统计平均值。
1.4.9 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平检测 复氧处理完成后，根据人超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶酶联免疫吸附试验试剂盒说明书，检测培养液上清和细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平。收集6孔板中各组细胞的培养液上清，按照试剂盒操作步骤直接检测超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平。随后，使用胰蛋白酶对6孔板中各组细胞进行消化处理，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，以去除残留的培养液成分，采用化学裂解法破碎细胞，收集细胞内液，按照试剂盒说明书检测细胞内液中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平，所有实验均重复3次，统计平均值。
1.5 主要观察指标 ①血小板裂解液中的关键生长因子和细胞因子水平及微生物检测结果；②应用不同体积分数血小板裂解液、富血小板血浆和新鲜血浆培养后缺氧损伤的心肌细胞活力、增殖效率和存活率的差异；③心肌细胞培养液上清和心肌细胞内的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 25.0软件整理和分析数据。计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析。计数资料以百分率(%)表示，采用卡方检验进行组间比较。对多重比较采用 Bonferroni校正。所有分析均采用双侧检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南宁中心血站输血医学研究所具有统计学专业背景的同事审核。

讨论

血小板裂解液蕴含丰富的生长因子、细胞因子、趋化因子、抗炎以及抗氧化分子，展现出巨大的应用潜力[10-11]，相关应用研究已广泛涉及多个关键领域，如细胞培养、伤口愈合、抗炎镇痛、组织再生等。在骨科、颌面外科、皮肤科等多个学科方向均有深入探索并取得显著研究成果 [12-13]。
但目前血小板裂解液促进细胞增殖和损伤修复的具体作用机制尚未明确，血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子等生长因子在细胞增殖和损伤修复中起主要作用[14]。然而因制备工艺的不同，血小板裂解液中血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子水平和活性存在较大差异。目前血小板裂解液的原料来源主要是过期机采血小板，但过期机采血小板因存放温度和时间的问题，有细菌污染及酸碱度变化的可能，从而影响细胞因子的生物活性。因此，该研究以血站系统采集的全血为原材料，通过优化传统血站分离工艺，在不影响其他血液成分的临床应用效果的同时，充分利用全血中的血小板，即提升了血液资源的利用率，又为血小板裂解液的原料来源提供了安全有效的途径，避免了当前来源原料过期的问题。该研究将21份浓缩血小板制备成血小板裂解液，通过检测其中的生长因子水平，发现质量浓度范围跨度较小，最低质量浓度与最高质量浓度相差小于一个数量级，且与文献报道普遍认可的血小板裂解液中主要生长因子的近似含量一致[2]，胰岛素样生长因子水平略优于刘广亚等[15]报道的14.24-17.3 μg/L，转化生长因子β水平略高于刘广亚等[15]报道的518.08-643.2 ng/L，血小板衍生生长因子AA水平检测结果近似。
目前，血小板裂解液的制备工艺在行业内尚未建立统一标准体系。国际上首份有关血小板裂解液的制备全过程的标准化声明由国际输血协会(International Society of Blood Transfusion，ISBT)细胞治疗工作组发表[16]，该声明针对血小板裂解液制备、产品质量控制、病原体安全性以及产品应用标准等关键问题进行了详细阐释，并就原材料血小板的来源、供者变异性、制备工艺等关键要素达成了共识[17]。该实验以血站系统采集的全血分离得到的浓缩血小板为关键原料，分离后的其他血液成分仍可正常使用，未对临床应用造成任何不良影响，有效避免了珍贵血液资源的闲置与浪费，充分实现了血液资源的合理利用与高效调配，为血液相关领域的研究与实践开辟了更为经济且可持续的路径。另外，浓缩血小板严格按照国家的标准化流程《血站技术操作规程(2019版)》进行制备，而血小板裂解液采用国际输血协会声明中使用率最高(74%)的冻融法制备。在微生物方面，参照《中国药典》中血清的质量标准，开展血小板裂解液的菌落培养以及支原体检测工作，以期为中国未来构建血小板裂解液工艺生产的相关行业标准提供参考依据。
心肌梗死发生时，从冠状动脉流向心脏的血液供应不足，从而诱发心肌细胞氧化应激，导致心肌细胞发生一系列的病理改变，甚至坏死，进而造成心室功能障碍和进行性心力衰竭[4]。然而，低体积分数的血小板裂解液在心肌缺氧状态下，可刺激心肌细胞快速产生超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶可清除体内过多的超氧阴离子自由基，减少氧化应激导致的细胞损伤，谷胱甘肽过氧化物酶能够使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而有效保护细胞免受氧化损伤。另外，谷胱甘肽过氧化物酶可清除细胞膜中的过氧化脂质，防止脂质过氧化反应，从而维持细胞膜的稳定性和完整性。FEMMINÒ等[18]研究指出，人血小板可激活鞘氨醇1磷酸受体，从而发挥心脏保护作用。该实验采用的人源心肌细胞系(AC16)的生物学特性与功能稳定性[19-22]，以及作为心肌损伤模型的有效性及可重复性在既往文献中已获充分证实，符合实验的细胞模型选择标准。相关研究表明，血小板中含有不少于3 357种蛋白[23]，是凝血的主要参与者，裂解后的血小板将可溶性蛋白溶于血小板裂解液中，但这些蛋白成分的功能以及单独对细胞增殖、分化和细胞损伤修复的影响尚未有研究报道。因此，该实验在体外细胞水平进行了细胞增殖研究，结果显示血小板裂解液能保护心肌细胞并且促进细胞增殖，从而减缓心肌细胞因缺血缺氧造成的伤害。
该实验研究的体外缺氧心肌细胞模型中，体积分数1%血小板裂解液表现出最优的促增殖与存活效应，显著优于体积分数5%富血小板血浆及其他测试体积分数，提示血小板裂解液在低体积分数下即可激活蛋白激酶B/细胞外信号调节激酶等促细胞存活通路，且避免了高体积分数血浆制品可能带来的渗透压或蛋白过载等不利因素。然而，抗氧化酶活性测定结果呈现出与细胞功能指标部分分离的现象：体积分数10% 富血小板血浆组超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶水平最高，但对应的细胞增殖率与存活率却低于体积分数1% 血小板裂解液组，这一结果提示，超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶的过量表达可能反映细胞处于氧化应激代偿状态，而非单纯的细胞保护；过高的抗氧化酶活性亦可能通过耗竭NADPH 或影响H₂O₂ 信号稳态，反而抑制细胞增殖。此外，各体积分数新鲜血浆均未能有效提升超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶活性，且对细胞功能几乎无改善，进一步证实了体积分数1%血小板裂解液在心肌细胞缺氧保护中的关键作用。因此，抗氧化酶活性虽为衡量氧化损伤修复的重要指标，但它与细胞最终功能结局之间并非简单正相关，具体的有效体积分数尚待进一步研究。
综上所述，血小板裂解液富含多种生物活性蛋白与生长因子，展现出广阔的再生医学应用前景。虽然目前尚无统一的制备标准，但根据标准化浓缩血小板制备流程和国际输血协会声明中应用最广的冻融法，可在可控条件下获得生长因子水平相对稳定的血小板裂解液，为中国制定相关行业标准提供了可行的实验依据。依托血站体系开展血小板裂解液的研究具备原料溯源清晰、质控严格的优势：依照《血站技术操作规程(2019版)》采集与处理血小板，可确保主要生长因子水平处于较稳定的范围；冻融法避免了外源添加剂引入，兼具工艺简单与成本低廉的特点[24]。缺血性心脏病是高发病率和高死亡率的一类疾病[25]，血小板裂解液能快速启动心肌细胞的缺氧保护机制，但在动物实验及临床试验方面的数据尚待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

优化全血分离工艺制备治疗级血小板裂解液对心肌细胞缺氧损伤的保护作用

Protective effect of optimization of the whole blood separation process to prepare therapeutic-grade platelet lysate on cardiomyocytes from hypoxic injury

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