3D打印甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架的细胞相容性

doi:10.12307/2026.559

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (8): 1912-1920.doi: 10.12307/2026.559

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3D打印甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架的细胞相容性

王奇飒1，卢雨征2，韩秀峰1，赵文玲1，石海涛1，徐哲1，3

1北京市顺义区妇幼保健院，北京儿童医院顺义妇儿医院皮肤科，北京市 101300；2首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京市 100038；3国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科，儿科学国家重点学科，教育部儿科重大疾病研究重点实验室，北京市 100045

收稿日期:2024-10-15 接受日期:2024-12-23 出版日期:2026-03-18 发布日期:2025-07-14
通讯作者: 徐哲，博士，主任医师，副教授，北京市顺义区妇幼保健院，北京儿童医院顺义妇儿医院皮肤科，北京市 101300；国家儿童医学中心，首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科，儿科学国家重点学科，教育部儿科重大疾病研究重点实验室，北京市 100045
作者简介:王奇飒，女，1989年生，北京市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事特应性皮炎、痤疮等相关疾病的管理、患者教育以及皮肤屏障、微生态、痤疮丙酸杆菌药敏等相关领域的研究。
基金资助:
国家重点研发计划资助(2023YFC2508200)，项目负责人：徐哲

Cytocompatibility of 3D printed methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin hydrogel scaffolds

Wang Qisa1, Lu Yuzheng2, Han Xiufeng1, Zhao Wenling1, Shi Haitao1, Xu Zhe1, 3

1Beijing Shunyi District Maternal and Child Health Hospital, Dermatology Department of Beijing Children’s Hospital Shunyi Maternal and Child Hospital, Beijing 101300, China; 2Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; 3National Center for Children’s Medicine, Dermatology Department of Beijing Children’s Hospital Affiliated to Capital Medical University, National Key Discipline in Pediatrics, Key Laboratory for Major Pediatric Diseases of the Ministry of Education, Beijing 100045, China

Received:2024-10-15 Accepted:2024-12-23 Online:2026-03-18 Published:2025-07-14
Contact: Xu Zhe, MD, Chief physician, Associate professor, Beijing Shunyi District Maternal and Child Health Hospital, Dermatology Department of Beijing Children’s Hospital Shunyi Maternal and Child Hospital, Beijing 101300, China; National Center for Children’s Medicine, Dermatology Department of Beijing Children’s Hospital Affiliated to Capital Medical University, National Key Discipline in Pediatrics, Key Laboratory for Major Pediatric Diseases of the Ministry of Education, Beijing 100045, China
About author:Wang Qisa, MS, Attending physician, Beijing Shunyi District Maternal and Child Health Hospital, Dermatology Department of Beijing Children’s Hospital Shunyi Maternal and Child Hospital, Beijing 101300, China
Supported by:
National Key Research & Development Program of China, No. 2023YFC2508200 (to XZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
数字光处理3D打印：是生物3D打印系统之一，通过光聚合以逐层方式制造水凝胶支架，具有高分辨率和打印速度快速等优点。
透明质酸：是一种酸性黏多糖，以独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。

背景：组织工程技术在组织与器官的修复治疗中展现出广阔的应用前景，也为处理大面积皮肤损伤提供了一种创新解决方案。然而，鉴于皮肤结构的复杂性，创建具备功能性的三维皮肤组织工程模型以模拟或替代自然皮肤仍然面临诸多挑战。
目的：开发一种成分仿生的甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架，评估该支架对人脐静脉内皮细胞增殖、活性、迁移与成管的影响。
方法：利用数字光处理3D打印技术分别制备甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架和甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤基质水凝胶支架，扫描电镜下观察两种支架的微观形貌，通过Tranwell小室、划痕实验检测两种支架对人脐静脉内皮细胞迁移的影响，小管形成实验检测两种支架对人脐静脉内皮细胞成管的影响。使用两种支架的前驱液分别重悬人脐静脉内皮细胞，利用数字光处理3D打印技术分别制备含人脐静脉内皮细胞的甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架和甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤基质水凝胶支架，通过CCK-8实验、死活染色、鬼笔环肽染色检测两种支架内人脐静脉内皮细胞的增殖、活性与状态。
结果与结论：①扫描电镜下可见两种支架均呈现三维立体的多孔结构，孔与孔之间相互贯通；两种支架均可促进人脐静脉内皮细胞的迁移与成管，并且甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤基质水凝胶支架的促进作用强于甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶支架；②CCK-8实验结果显示，两种支架均可促进人脐静脉内皮细胞的增殖，并且甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤基质水凝胶支架内的细胞增殖更快；死活染色显示，两种水凝胶支架内的人脐静脉内皮细胞均呈均匀且立体分布状态，并且均具有较高的存活率；鬼笔环肽染色显示，人脐静脉内皮细胞在两种支架内均呈现良好的伸展状态，并且甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤基质水凝胶支架内的细胞伸展更加充分；③结果表明，甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移与成管，具有良好的细胞相容性。
https://orcid.org/0009-0001-8428-6477(王奇飒)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 数字光处理">, 3D打印">, 皮肤组织工程">, 皮肤再生">, 脱细胞皮肤基质">, 细胞增殖">, 细胞迁移">, 细胞成管">, 工程化皮肤

Abstract: BACKGROUND: Tissue engineering technology holds broad application prospects in the repair and treatment of tissues and organs, offering a novel solution for the treatment of large-scale skin defects. However, due to the complexity of skin structure, constructing functional three-dimensional skin tissue engineering models to mimic or replace natural skin remains challenging.
OBJECTIVE: To develop a bio-mimetic methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin hydrogel scaffold and evaluate its effects on the proliferation, activity, migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: Digital light processing 3D printing technology was utilized to produce methyl acrylated hyaluronic acid hydrogel scaffolds and methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin matrix hydrogel scaffolds. The microscopic morphology of the two scaffolds was observed under a scanning electron microscope. The effects of the two scaffolds on the migration of human umbilical vein endothelial cells were detected by Tranwell chamber and scratch test. The effect of the two scaffolds on the tube formation of human umbilical vein endothelial cells was detected by the tube formation experiment. The human umbilical vein endothelial cells were resuspended in the precursor solution of the two scaffolds. The methyl acrylated hyaluronic acid hydrogel scaffold containing human umbilical vein endothelial cells and the methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin matrix hydrogel scaffold were prepared by digital light processing 3D printing technology. The proliferation, activity, and state of human umbilical vein endothelial cells in the two scaffolds were detected by CCK-8 assay, live/dead staining, and phalloidin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that both scaffolds presented a three-dimensional porous structure with interconnected pores; both scaffolds could promote the migration and tube formation of human umbilical vein endothelial cells, and the promoting effect of methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin matrix hydrogel scaffold was stronger than that of methyl acrylated hyaluronic acid hydrogel scaffold. (2) CCK-8 assay results showed that both scaffolds could promote the proliferation of human umbilical vein endothelial cells, and the proliferation of cells in methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin matrix hydrogel scaffold was faster. Live/dead staining showed that the human umbilical vein endothelial cells in both hydrogel scaffolds were uniformly and three-dimensionally distributed, and both had a high survival rate. Phalloidin staining showed that the human umbilical vein endothelial cells in both scaffolds showed a good extension state and the cells in the methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin matrix hydrogel scaffold were more fully extended. (3) The results showed that the methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin hydrogel scaffold could promote the proliferation, migration, and tube formation of human umbilical vein endothelial cells and had good cell compatibility.

Key words: digital light processing">, 3D printing">, skin tissue engineering">, skin regeneration">, decellularized skin matrix">, cell proliferation">, cell migration, cell tube formation">, engineered skin

中图分类号:

王奇飒, 卢雨征, 韩秀峰, 赵文玲, 石海涛, 徐哲. 3D打印甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架的细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1912-1920.

Wang Qisa, Lu Yuzheng, Han Xiufeng, Zhao Wenling, Shi Haitao, Xu Zhe. Cytocompatibility of 3D printed methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin hydrogel scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(8): 1912-1920.

图/表（结果） 7

2.1 两种支架的大体观及微观结构实验成功制备了两种支架(图1A)，从宏观角度看，这两种支架均呈现出近圆形的外观，并由横竖交叉的网格状结构组成，这些网格结构排列整齐，并且两种支架在宏观上无明显差异；通过扫描电镜观察发现两种支架均展现出三维立体网状结构，孔隙之间相互连通，共同构建了一个开放的网络体系。两种支架大孔的孔径基本相似，在400-500 μm的范围内，其中HAMA水凝胶支架的微孔孔径平均为(38.348±9.259) μm，HAMA/DS水凝胶支架的微孔平均孔径为(29.524±7.232) μm，见图1B，这一结果表明，在加入脱细胞皮肤后甲基丙烯酰化透明质酸支架的孔径有所减小，并且纤维间的连接变得更加均一。这种微观结构上的变化对于细胞的黏附和伸展是有利的，更小的孔径和更均一的纤维连接可以提供更多的接触点，从而增强细胞与支架之间的相互作用；此外，这种结构还可能提高物质交换的效率，因为更密集的网状结构有助于增加表面积和缩短扩散路径。

2.2 两种支架中人脐静脉内皮细胞的活性死活染色结果显示两种支架上的细胞生存状态基本一致，定量分析结果显示两种支架内的活细胞比例比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2，结果表明细胞在两组水凝胶支架中均能够保持较高的存活率。另外，两种支架中的细胞呈现出均匀且立体的分布状态，这种分布模式进一步证明了打印的水凝胶支架具有良好的细胞相容性，不会对细胞产生毒性影响。

2.3 两种支架中人脐静脉内皮细胞的伸展及形态细胞骨架染色结果显示，人脐静脉内皮细胞在两种支架中均呈现出良好的伸展状态，呈梭形，这是内皮细胞健康生长和正常功能的典型标志，并且在HAMA/DS水凝胶支架中细胞似乎伸展得更为充分，见图3，表明HAMA/DS水凝胶支架可能提供了更优越的细胞生长环境，有助于细胞更好地黏附和伸展。

2.4 两种支架中人脐静脉内皮细胞的增殖情况随着培养时间的延长，3组细胞的增殖能力逐渐增强。培养1 d后，3组细胞的增殖能力比较差异无显著性意意义(P > 0.05)；培养3，5 d后，HAMA组和HAMA/DS组细胞增殖能力均显著高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)，并且HAMA/DS组细胞增殖能力高于HAMA组，见图4。结果表明，两种支架均可促进人脐静脉内皮细胞的增殖，并且HAMA/DS水凝胶支架的促进作用更显著，可能归因于HAMA/DS水凝胶支架中脱细胞皮肤的加入为细胞提供了更丰富的生长因子和更适宜的微环境，从而进一步促进了细胞的增殖。

2.5 两种支架对人脐静脉内皮细胞迁移及划痕愈合的影响如图5所示，与对照组相比，两种支架均显著促进了更多人脐静脉内皮细胞迁移至Transwell下室，表明两种支架对细胞迁移具有积极影响；并且两种支架中HAMA/DS水凝胶支架显示出更强的促进细胞迁移的作用，说明加入脱细胞皮肤基质显著增强了甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶对细胞迁移的支持。划痕愈合实验结果显示，两种支架均可促进细胞划痕愈合，并且HAMA/DS水凝胶支架促进细胞划痕愈合效果更强，见图6，这进一步验证了透明质酸在促进人脐静脉内皮细胞迁移中的作用。

2.6 两种支架对人脐静脉内皮细胞成管的影响如图7所示，与对照组相比，两种支架均显示出更多的血管形成，表明两种支架都具有促进血管生成的潜力，从而有助于血管网络的重建和修复；进一步分析发现，HAMA/DS组人脐静脉内皮细胞成管数量明显多于HAMA组，进一步证实了HAMA/DS水凝胶支架在促进血管生成方面的优越性，这种增强效果可能归因于脱细胞皮肤基质的加入为细胞提供了更为丰富的生长因子和细胞外基质支持，从而促进了血管的生成。

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引言

皮肤是人体中最大的器官，具备重要的屏障功能，能够防御各种病原体的侵袭，并抵御紫外线照射、机械伤害及热损伤[1]；此外，皮肤还具有阻止体内水分和营养物质流失、调节体温等多种功能。常见的皮肤损伤类型包括擦伤、烧伤和撕裂伤等，这些损伤会破坏皮肤的屏障功能，增加感染和炎症的风险。由于皮肤的自我修复能力有限，当创面较大时(例如Ⅲ度烧伤或全皮层损伤)皮肤组织难以自行愈合，因此，植皮或使用组织工程皮肤来促进皮肤再生变得尤为重要[2-3]。然而，供体皮肤的短缺、继发性损伤及感染风险等问题限制了皮肤移植的广泛应用。相比传统治疗方法，组织工程皮肤为处理皮肤缺损提供了一种新的选择[4-5]。
皮肤组织工程的最终目标是实现正常的皮肤解剖结构再生[6]，恢复其天然形态和功能，为创面提供所需的氧气，维持适宜的湿度，并防止继发感染[7]。组织工程材料可以作为创面的临时保护层加速愈合过程，恢复皮肤的机械稳定性和弹性，从而实现全层皮肤的再生[2]。在组织工程中，三维打印支架起着独特的作用，其小孔径和较大的表面积有助于细胞之间的相互作用和新生功能组织的形成[8-9]。
许多研究报道了使用不同生物材料的挤出式生物打印支架，在皮肤再生中表现出良好的促进效果[10]。数字光处理生物打印技术以快速、大规模生产、精准和良好的生物相容性受到关注，但其具体生物学效果仍需进一步探讨[11]。在数字光处理3D生物打印过程中，光敏聚合物通过光逐层固化形成三维结构，利用平台的移动，每个固化层与前一层结合，从而构成完整的三维结构[12]，这种技术通过精确模仿自然组织的几何形状展现了3D打印在组织工程中的重要价值。
脱细胞皮肤细胞外基质因卓越的生物相容性和结构特性在皮肤组织工程中备受关注[13]。细胞外基质富含胶原蛋白、弹性蛋白及黏多糖等天然生物分子，这些成分不仅为细胞的存活、增殖和分化提供了理想的三维环境[14]，而且在脱细胞过程中细胞核和免疫原性组分被去除，有效降低了免疫排斥风险，同时保留了细胞黏附因子和生长因子[15]，这对于促进组织的修复具有重要意义。尽管细胞外基质在组织工程中表现出色，但3D打印性能差和降解速率快可能限制了它在组织工程应用中的效果。透明质酸作为一种存在于人体结缔组织中的多糖，具有支持细胞附着、增殖与迁移的能力，其优越的保湿性能有助于维持皮肤的水合状态，从而促进细胞生长和组织修复[16]。透明质酸形成的三维网络结构为种子细胞提供了物理支持，能够模拟自然皮肤的基质环境[17]；此外，通过调整透明质酸的浓度和交联度可以优化其打印性能，使透明质酸在3D打印皮肤组织工程中广泛用作生物墨水[18]。然而，透明质酸的机械强度相对较低，并且在高浓度下可能影响细胞的长期黏附和功能。
鉴于细胞外基质和透明质酸各自的优势与局限性，将两者复合使用可能成为一种理想的解决方案。通过结合细胞外基质的生物活性与透明质酸的保湿性能和打印性能，有望开发出一种更加高效且适应性强的生物墨水，用于3D打印皮肤组织工程。因此，此次研究探讨细胞外基质与透明质酸复合成分作为3D生物打印墨水的潜在效果及其在皮肤组织工程中的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备，体外细胞观察实验，多组间比较进行单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年 5月在顺义妇儿医院的皮肤疾病研究中心进行。
1.3 材料人脐静脉内皮细胞购自瑞士巴塞尔的LONZA公司；甲基丙烯酸酐和透明质酸购自中国阿拉丁生物试剂有限公司；DMEM/F-12培养基、胎牛血清和双抗购自美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶购自美国Sigma公司；苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂购自苏州永沁泉智能设备有限公司；核酸酶溶液、核糖核酸酶A及绿色微丝荧光探针染色工作液、结晶紫染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；死/活(Live/Dead)染色试剂盒购自美国Invitrogen公司；Transwell孔板购自美国康宁生物公司；基质凝胶TM基底膜基质购自美国BD生物科学公司；CCK-8试剂盒购自日本TOYOBO公司；DAPI染液购自中国百瑞极公司；投影式光固化生物3D打印机购自中国苏州永沁泉智能设备有限公司；冷冻干燥机、扫描电镜购自日本Hitachi公司；酶标仪购自美国BioTek公司；激光共聚焦显微镜、体式显微镜购自日本Nikon公司。
1.4 实验方法
1.4.1 脱细胞皮肤细胞外基质的制备参考文献[18]中的方法，同时对脱细胞皮肤细胞外基质的制备工艺进行了优化。将新鲜猪皮充分切碎后置于低渗Tris-HCl缓冲液中，经过6次冻融循环(冷冻至-80 ℃，随后室温解冻)。将样品转移至37 ℃恒温环境中，加入0.25%胰蛋白酶溶液进行消化处理，每4 h更换新鲜酶液，持续24 h。采用高渗Tris-HCl缓冲液洗涤后，加入含有50 U/mL脱氧核糖核酸酶和1 U/mL核糖核酸酶的低渗Tris-HCl缓冲液，在37 ℃条件下继续搅拌4 h，以彻底去除核酸成分。使用1% Triton X-100溶液处理24 h，充分溶解细胞膜结构并去除残留的细胞内容物。为去除残留试剂，样品先后经过低渗Tris-HCl缓冲液连续清洗3 d和流水冲洗3 d。最终，将制备完成的脱细胞皮肤细胞外基质储存于4 ℃环境中，供后续实验使用。
1.4.2 数字光处理3D打印水凝胶支架的制备
生物墨水的制备：将配制好的2%透明质酸钠水溶液在4 ℃下搅拌过夜，随后按2.5 mL∶100 mL比例加入甲基丙烯酸酐，用NaOH调节pH值至8.5左右，继续在4 ℃下搅拌过夜。用无水乙醇进行沉淀，再用去离子水透析3 d，得到透明质酸凝胶生物墨水。将透明质酸凝胶与脱细胞皮肤细胞外基质分别冷冻干燥、研磨并筛分，取适量粉末分别配置成10%和5%的PBS溶液，按照体积比1∶1混合，过滤除菌并加入无菌光引发剂，制备出甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤生物墨水。
3D打印水凝胶支架：使用CAD软件设计所需的支架形状，设置参数如下：支架直径3 mm、高度1.5 mm、孔径500 μm、孔间距450 μm。通过Magics软件进一步优化支架的内部结构，确保支架具有良好的机械强度。随后利用3D-Bioplotter软件读取上述保存的数据文件，转码生成用于3D打印的STL文件。然后采用数字光处理技术进行生物支架的3D打印，设置打印参数如下：光强度10 mW/cm²、曝光时间10 s、基层数5层、基层曝光12 s，分别打印透明质酸水凝胶支架(记为HAMA水凝胶支架)和透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架(记为HAMA/DS水凝胶支架)。
1.4.3 支架的表征采用体式显微镜分别对两种支架进行大体观的拍摄后，使用2.5%戊二醛溶液固定4 h，以确保样品形态的稳定。固定后的支架用PBS洗涤3次，每次15 min，以去除多余的固定剂。使用梯度浓度乙醇(体积分数30%，50%，70%，90%，100%)进行脱水处理，每次20 min。脱水后，将两种支架进行冷冻干燥处理，冻干后进行真空喷金处理，置于离子溅射仪中金喷镀2.0-3.0 min，通过扫描电镜对样品进行观察并拍照，使用Image J软件分析孔径大小。
1.4.4 支架的细胞相容性检测分别用两种生物墨水打印负载人脐静脉内皮细胞的水凝胶支架，细胞浓度为2×107 L-1，打印方法同1.4.2。含细胞支架放入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗DMEM/F-12培养基的孔板内，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，隔天更换新的培养基。
支架中细胞增殖检测：以孔板内平板培养的人脐静脉内皮细胞作为对照组。培养第1，3，5天，取出孔板，每孔加入1 mL新鲜培养基，继而加入100 µL CCK-8试剂，轻轻摇匀，将支架放回细胞培养箱在37 ℃下孵育2 h。孵育结束后，将培养基转移至96孔板，使用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度值。
支架中细胞活性检测：培养第7天，用PBS轻轻洗涤支架3次，每次5 min，以去除培养基和任何松散的细胞。将支架置于含有10 μL 活细胞染料(AM)和10 μL 死细胞染料(PI)的1 mL无血清DMEM/F-12培养基中，置于37 ℃下避光孵育30 min。孵育结束后，再次用PBS洗涤支架3次，每次5 min，以去除多余的染色液。将支架转移至载玻片上，覆盖上盖玻片，使用共聚焦荧光显微镜在488 nm(AM，绿色)和543 nm(PI，红色)激发光下观察并拍照，记录细胞存活和死亡情况。使用Image J软件分析活细胞比例。
支架中细胞形态观察：培养第7天，将支架固定在40 g/L多聚甲醛溶液中15 min，确保细胞结构的稳定性和完整性；用PBS洗涤3次，每次5 min；用0.1% Triton X-100通透处理10 min，以提高细胞膜的通透性，再次用PBS洗涤3次，每次5 min；加入10 μL荧光标记的绿色微丝荧光探针溶液和10 μL DAPI染色液，置于37 ℃避光孵育30 min；用PBS洗涤3次，每次5 min，以去除多余的染色液；将支架转移到载玻片上，覆盖盖玻片，使用荧光显微镜在488 nm(绿色微丝荧光探针，绿色)和405 nm(DAPI，
蓝色)激发光下观察并拍照，记录细胞骨架和核的形态。
1.4.5 支架功能性细胞实验
支架浸提液的制备：称量两种支架各1 g分别置于50 mL 离心管，向离心管内加入20 mL DMEM/F-12培养基作为浸提介质，置于37 ℃培养箱中浸提24 h，得到支架浸提液。
Transwell实验检测支架对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响：将两种支架分别放置在Transwell小室的下室中，同时添加600 μL DMEM/F-12培养基；上室每孔加入100 μL的人脐静脉内皮细胞悬浮液，细胞浓度为2×108 L-1。将Transwell小室置入37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中孵育24 h。孵育结束后，使用乙醇棉签轻轻去除上室未迁移的细胞，用40 g/L多聚甲醛固定下室迁移的细胞15 min。固定结束后，用PBS洗净固定液，使用0.1%结晶紫溶液对细胞染色10 min，用PBS洗去结晶紫染料，通过显微镜观察并记录染色的迁移细胞，使用图像分析软件对迁移细胞数量进行计数。
划痕实验检测支架对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响：将第3代人脐静脉内皮细胞接种于24孔板内，细胞密度为5×104/孔，用200 μL无菌枪头于每个孔内垂直划2条直线，将脱落的细胞用PBS清洗干净，在孔板内分别加入DMEM/F-12培养基(阴性对照)、HAMA水凝胶支架浸提液、HAMA/DS水凝胶支架浸提液，体积600 μL，分别于培养刚开始(0 h)和24 h时在显微镜下观察并拍照，利用Image J图像软件测量划痕愈合面积。
小管形成实验检测支架对人脐静脉内皮细胞成管的影响：在96孔板底部种板35 μL基质凝胶，转移到细胞培养箱中固化30 min；使用DMEM/F-12培养基(阴性对照)、HAMA水凝胶支架浸提液、HAMA/DS水凝胶支架浸提液重悬第3代人脐静脉内皮细胞，以1.5×104/孔的密度接种于上述96孔板内，孵育12 h后于显微镜下观察并拍照。
1.5 主要观察指标两种支架对人脐静脉内皮细胞增殖、活性、迁移与成管的影响。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计分析。所有数据以x±s形式表示。对于多组间数据的比较，采用单因素方差分析(ANOVA)进行初步检验。若方差分析显示有统计学差异，则进一步进行组间两两比较，采用独立样本t检验，同时结合Bonferroni校正以控制多重比较的误差率。设定P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经首都医科大学附属北京儿童医院统计学专家审核。

讨论

皮肤作为人体最大的器官具有典型的空间分层三维结构，包括表皮、真皮和皮下组织[19-20]，复杂的结构给皮肤创面修复和治疗带来了挑战，因此，越来越多的研究倾向于使用与人体生理结构相似的三维组织工程皮肤来替代受损或病变的皮肤组织[21]。通过在体外构建三维功能性皮肤组织模型，研究者们能够再现原生皮肤的生理特性，进而开发出新型、高效的皮肤替代物，提升治疗效果[22]，这些替代物不仅在结构上接近天然皮肤，而且在功能上也能够支持细胞的正常生长和分化[23]。目前，市场上皮肤组织工程模型种类繁多，主要包括表皮皮肤替代物、真皮皮肤替代物以及双层皮肤替代物等，这些模型各自具有独特的结构和功能特点，旨在模拟人体皮肤的不同层次以满足特定的临床需求。表皮皮肤替代物主要用于覆盖创面，提供物理屏障，促进细胞增殖和分化，加速愈合过程。真皮皮肤替代物则侧重于恢复皮肤的深层结构，包括提供支持、促进血管生成和细胞外基质的再生。而双层皮肤替代物结合了表皮和真皮的特点，能够在创面愈合的多个阶段发挥作用，提供更全面的治疗效果[24-26]。这些模型在临床应用中展示了良好的效果，为皮肤损伤和疾病的治疗提供了新的解决方案[3]。近年来，组织工程的研究重点已经非常强调创造增强创面愈合和再生修复特性的结构，目标是设计引导细胞行为以有效修复受损皮肤的支架[4，27]。细胞不仅需要一个支持结构来栖息和繁殖，而且还需要信号来引导至最佳再生环境，这些信号涉及信号分子和支架物理特性的复杂相互作用[28]。
在皮肤组织工程中，与其他传统技术(如冷冻干燥、微粒浸出和静电纺丝技术)相比[11]，3D生物打印可为细胞黏附和生长提供稳定的多孔内部结构[10，29]。在组织工程中使用的各种3D支架中，水凝胶支架因独特的特性而具有特殊意义，例如细胞外基质的自然模拟、保湿性、孔隙率、生物相容性、生物降解性和生物相容性[30-31]。YING等[32]开发了一种基于胶原蛋白的可注射水凝胶敷料，显著加快了血管的形成、上皮化、胶原蛋白沉积和创面愈合的自然过程；还有研究报道了基于透明质酸和ε-聚赖氨酸的静电自组装水凝胶敷料，可以通过杀死细菌、下调炎症、促进胶原蛋白沉积、增强角质形成细胞迁移和血管生成等方式有效加速创面愈合[33]，但这些方法均缺乏有效空间结构。数字光处理打印是紫外线支持的3D生物打印系统之一，它通过光聚合以逐层的方式创建三维水凝胶[34]。数字光处理3D生物打印机能够提供高分辨率和快速打印速度，使用液体溶液和无喷嘴系统分层组装形成支架，有助于减少打印过程中的细胞损伤。用于皮肤组织工程的生物墨水应具有可打印性、机械性能和生物相容性。AJITERU等[35]报道基于甲基丙烯酸酯丝素蛋白的数字光处理3D打印水凝胶支架，能够模拟生理三维空间，对小鼠成肌细胞具有明显的促分化作用。最近的研究表明，数字光处理3D打印HAMA水凝胶支架具有良好的生物相容性[36]。此次研究首次尝试将皮肤细胞外基质与透明质酸复合为3D打印生物墨水，探究其打印水凝胶支架的可能性。
天然组织由多种类型的细胞组成，这些细胞的相互作用和协同功能维持了组织的典型表型[37]，而组织中的血管网络对于向细胞提供营养至关重要[38]。此次研究打印出的两种水凝胶支架均具有均匀分布的多孔结构，这与CHOI等[39]报道的数字光处理3D打印人造皮肤模型一致，显示出此次实验制备的水凝胶支架有利于细胞黏附与生长，同时便于物质交换。死活染色结果进一步证明制备的水凝胶支架具有良好的细胞相容性，有利于活细胞的存活，这是组织工程支架尤为重要的特性之一[40]；此外，细胞骨架染色结果还展现出支架上的细胞有良好的伸展性，也说明支架利于细胞黏附及基本形态的维持，有助于细胞发挥组织修复作用[41]。
此次实验进一步评估了两种水凝胶支架对皮肤再生关键细胞——血管内皮细胞功能的影响。CCK-8细胞增殖检测结果显示，这两种水凝胶支架均显著促进了人脐静脉内皮细胞的增殖，表现出优于对照组的增殖能力。细胞增殖是组织修复和再生的基础[42]，而支架材料的优良性能可有效提升这一过程；此外，支架材料对细胞迁移的促进作用也是其在组织修复中的重要机制。Transwell迁移实验和划痕愈合实验结果均表明，两种水凝胶支架均能显著促进人脐静脉内皮细胞的迁移，说明这些支架材料能够有效加速创面愈合。在皮肤组织工程中，水凝胶的血管化被认为是移植物存活和组织修复的关键过程，为促进组织工程移植物的血管化，研究者们引入了多种方法，如制造多孔结构、引入促血管生成因子以及接种血管内皮细胞或干细胞等[43]。体外细胞成管实验显示，两种水凝胶支架均能有效促进人脐静脉内皮细胞的管形成能力。血管内皮细胞形成血管是血管生成的重要环节，支架的优良特性能为这些细胞提良好的生长环境。
特别值得注意的是，实验中发现脱细胞皮肤的存在进一步增强了人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，这一现象可能与脱细胞皮肤中保留的天然生物分子信号有关，这些信号能够提升细胞功能[44]。有研究指出，脱细胞真皮细胞外基质衍生的水凝胶能够显著诱导细胞浸润，并增强人脐静脉内皮细胞的管形成能力，这与此次实验的结果一致[15]，这种生物材料通过模拟天然的细胞外基质环境，提供了必要的生物化学和机械刺激，从而促进血管化和组织修复过程。然而，目前的研究主要集中在体外细胞实验，缺乏动物实验验证，计划在后续研究中进行动物实验，以进一步评估材料的生物相容性和功能性，并且材料性能的长期稳定性需要进一步研究，以确保材料在实际应用中的稳定性。虽然初步实验结果表明HAMA/DS水凝胶支架具有良好的应用前景，但其临床转化仍需更多的机制研究和验证。
综上所述，基于数字光处理3D打印的HAMA/DS水凝胶支架具有优良的生物相容性，形成的三维多孔结构有利有效支持人脐静脉内皮细胞的生长，脱细胞皮肤基质的复合能有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及成管能力。因此，HAMA/DS水凝胶支架作为一种新型的皮肤组织工程支架，展示了良好的临床应用前景，然而，其在体内对皮肤损伤修复的具体效果仍需通过更多的研究和实验来验证和优化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

3D打印甲基丙烯酰化透明质酸/脱细胞皮肤水凝胶支架的细胞相容性

Cytocompatibility of 3D printed methyl acrylated hyaluronic acid/decellularized skin hydrogel scaffolds

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