负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架修复牙槽骨缺损

doi:10.12307/2026.514

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (2): 329-337.doi: 10.12307/2026.514

• 组织工程口腔材料 tissue-engineered oral materials • 上一篇下一篇

负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架修复牙槽骨缺损

白相宇1，霍峰1，郝妍1，王泽成2，郭晓宇3

承德医学院附属医院，1口腔科，3住培办公室，河北省承德市 067000；2围场满族蒙古族自治县医院口腔科，河北省承德市 067000

收稿日期:2024-10-21 接受日期:2024-11-30 出版日期:2026-01-18 发布日期:2025-06-16
通讯作者: 霍峰，硕士，主任医师，承德医学院附属医院口腔科，河北省承德市 067000
作者简介:白相宇，男，1989年生，河北省承德市人，满族，硕士，主治医师，主要从事牙周病研究。
基金资助:
河北省承德市科技支撑项目(202401A005)，项目负责人；白相宇

Platelet-derived growth factor BB-loaded chitosan/reduced graphene oxide scaffold for repairing alveolar bone defects

Bai Xiangyu1, Huo Feng1, Hao Yan1, Wang Zecheng2, Guo Xiaoyu3

1Department of Stomatology, 3Office of Resident Training, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China; 2Department of Stomatology, Weichang Manchu and Mongolian Autonomous County Hospital, Chengde 067000, Hebei Province, China

Received:2024-10-21 Accepted:2024-11-30 Online:2026-01-18 Published:2025-06-16
Contact: Huo Feng, MS, Chief physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Bai Xiangyu, MS, Attending physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
Hebei Province Chengde City Science and Technology Support Project, No. 202401A005 (to BXY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血小板衍生生长因子：在器官胚胎发生与发育、创伤愈合过程中发挥着重要作用，是成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞等分裂增殖时的重要促细胞分裂原。研究显示血小板衍生生长因子BB可刺激间充质干细胞的增殖与成骨分化，加快成骨样细胞的钙化进程；可促进成骨细胞的迁移，促进新骨形成；可促进人牙槽骨缺损修复及牙周软组织再生；此外，血小板衍生生长因子BB还具有趋化活性与促血管生成活性，可发挥促骨损伤修复作用。
还原氧化石墨烯：在氧化石墨烯表面生成氧官能团的情况下，可以采用还原剂将氧化物还原为羟基或醇基，从而得到还原氧化石墨烯。还原氧化石墨烯在导电性和机械强度方面比氧化石墨烯有更好的性能。

背景：研究显示血小板衍生生长因子BB可刺激间充质干细胞的增殖与成骨分化，加快成骨样细胞的钙化进程，但其临床应用存在半衰期短、易分解等问题，将生长因子负载到适宜的生物材料支架上可使其缓慢持续释放，维持有效的作用浓度，成为目前研究的热点话题。
目的：利用壳聚糖/还原氧化石墨烯支架负载血小板衍生生长因子BB，观察该支架修复大鼠牙槽骨缺损的作用。
方法：①分别制备壳聚糖/还原氧化石墨烯支架(记为CS/rGO支架)与负载不同质量浓度(5，10，15，20 mg/L)血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架(分别记为CS/rGO/PDGF-BB-5、CS/rGO/PDGF-BB-10、CS/rGO/PDGF-BB-15、CS/rGO/PDGF-BB-20支架)。将5组支架分别与大鼠牙周膜干细胞共培养，通过CCK-8实验与Transwell小室实验分别检测细胞增殖与迁移情况，筛选适宜的生长因子负载质量浓度进行后续实验。将CS/rGO支架(或浸提液)、CS/rGO/PDGF-BB-15支架(或浸提液)分别与大鼠牙周膜干细胞共培养，检测细胞成骨分化与成血管能力。②在16只SD大鼠双侧上颌第一磨牙前制备牙槽骨缺损模型，随机分4组干预：空白对照组不进行任何干预，单纯支架组植入CS/rGO/PDGF-BB-15支架，对照组植入CS/rGO支架与大鼠牙周膜干细胞复合物，实验组植入CS/rGO/PDGF-BB-15支架与大鼠牙周膜干细胞复合物，每组4只。术后12周，通过Micro CT扫描与苏木精-伊红染色观察牙槽骨缺损骨修复情况。
结果与结论：①CS/rGO/PDGF-BB-5、CS/rGO/PDGF-BB-10、CS/rGO/PDGF-BB-15、CS/rGO/PDGF-BB-20支架均可促进大鼠牙周膜干细胞的增殖与迁移，其中CS/rGO/PDGF-BB-15支架促细胞增殖与迁移作用最显著，使用该支架进行后续实验。与CS/rGO支架比较，CS/rGO/PDGF-BB-15支架可促进大鼠牙周膜干细胞的成骨与成血管分化。②Micro CT扫描与苏木精-伊红染色结果显示，实验组牙槽骨缺损修复效果最好，可见大量新生骨组织与血管形成。③负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架可通过促进大鼠牙周膜干细胞的增殖、迁移、成血管与成骨分化，进而有效促进大鼠牙槽骨缺损的修复。
https://orcid.org/0009-0008-9065-939X(白相宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 牙槽骨缺损, 支架, 壳聚糖, 还原氧化石墨烯, 血小板衍生生长因子BB, 工程化口腔材料

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that platelet-derived growth factor BB can stimulate the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and accelerate the calcification process of osteoblast-like cells. However, its clinical application has problems such as short half-life and easy decomposition. Loading the growth factor onto a suitable biomaterial scaffold can enable its slow and continuous release and maintain an effective concentration, which has become a hot topic in current research.
OBJECTIVE: To observe the effect of chitosan/reduced graphene oxide scaffolds loaded with platelet-derived growth factor BB on the repair of alveolar bone defect in rats.
METHODS: (1) Chitosan/reduced graphene oxide scaffolds (referred to as CS/rGO scaffolds) and chitosan/reduced graphene oxide scaffolds loaded with different mass concentrations (5, 10, 15, and 20 mg/L) of platelet-derived growth factor BB (referred to as CS/rGO/PDGF-BB-5, CS/rGO/PDGF-BB-10, CS/rGO/PDGF-BB-15, and CS/rGO/PDGF-BB-20 scaffolds) were prepared respectively. The five groups of scaffolds were co-cultured with rat periodontal ligament stem cells. The cell proliferation and migration were detected by CCK-8 assay and Transwell chamber assay, respectively, to screen the appropriate growth factor loading mass concentration for subsequent experiments. CS/rGO scaffolds (or extracts) and CS/rGO/PDGF-BB-15 scaffolds (or extracts) were co-cultured with rat periodontal ligament stem cells, and the osteogenic differentiation and angiogenic ability of the cells were detected. (2) The alveolar bone defect model was prepared in front of the bilateral maxillary first molars of 16 SD rats, and the rats were randomly divided into 4 intervention groups: the blank control group did not receive any intervention, the simple scaffold group was implanted with CS/rGO/PDGF-BB-15 scaffold, the control group was implanted with CS/rGO scaffold and rat periodontal ligament stem cell complex, and the experimental group was implanted with CS/rGO/PDGF-BB-15 scaffold and rat periodontal ligament stem cell complex, with 4 rats in each group. Twelve weeks after surgery, the bone repair of the alveolar bone defect was observed by Micro CT scanning and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CS/rGO/PDGF-BB-5, CS/rGO/PDGF-BB-10, CS/rGO/PDGF-BB-15, and CS/rGO/PDGF-BB-20 scaffolds could promote the proliferation and migration of rat periodontal ligament stem cells. Among them, the CS/rGO/PDGF-BB-15 scaffold had the most significant effect on promoting cell proliferation and migration, and this scaffold was used for subsequent experiments. Compared with the CS/rGO scaffold, the CS/rGO/PDGF-BB-15 scaffold could promote the osteogenic and angiogenic differentiation of rat periodontal ligament stem cells. (2) Micro CT scanning and hematoxylin-eosin staining results showed that the experimental group had the best alveolar bone defect repair effect, and a large amount of new bone tissue and blood vessel formation could be seen. (3) The chitosan/reduced graphene oxide scaffold loaded with platelet-derived growth factor BB can effectively promote the repair of rat alveolar bone defects by promoting the proliferation, migration, angiogenic and osteogenic differentiation of rat periodontal ligament stem cells.

Key words: alveolar bone defect, scaffold, chitosan, reduced graphene oxide, platelet-derived growth factor BB, engineered dental material

中图分类号:

白相宇, 霍峰, 郝妍, 王泽成, 郭晓宇. 负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架修复牙槽骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(2): 329-337.

Bai Xiangyu, Huo Feng, Hao Yan, Wang Zecheng, Guo Xiaoyu. Platelet-derived growth factor BB-loaded chitosan/reduced graphene oxide scaffold for repairing alveolar bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(2): 329-337.

图/表（结果） 11

2.1 支架对大鼠牙周膜干细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示，随着培养时间的延长，各组细胞增殖能力呈增强趋势，与对照组比较，CS/rGO/PDGF-BB-5组、CS/rGO/PDGF-BB-10组、CS/rGO/PDGF-BB-15组、CS/rGO/PDGF-BB-20支架组细胞增殖能力均增强(P < 0.05)，并且以CS/rGO/PDGF-BB-15组细胞增殖能力最强，见图1。

2.2 支架对大鼠牙周膜干细胞迁移的影响 Transwell小室实验结果显示，与对照组比较，CS/rGO/PDGF-BB-5组、CS/rGO/PDGF-BB-10组、CS/rGO/PDGF-BB-15组、CS/rGO/PDGF-BB-20组细胞迁移数量显著增加(P < 0.05)，其中CS/rGO/PDGF-BB-15组细胞迁移数量最多，见图2。

2.3 支架的缓释性能检测结果综合细胞增殖与细胞迁移实验结果，后续实验均选择促进细胞增殖与迁移能力最强的CS/rGO/PDGF-BB-15支架。总共检测了42 d内的血小板衍生生长因子BB释放情况，结果显示：在前期的1-7 d内，CS/rGO/PDGF-BB-15支架释放了大量的血小板衍生生长因子BB，显示突释现象；在此后的时间段内，支架缓慢释放血小板衍生生长因子BB，见图3。

2.4 支架对大鼠牙周膜干细胞成骨分化的影响碱性磷酸酶染色结果显示，随着成骨诱导时间的延长，各组碱性磷酸酶阳性面积增加，其中CS/rGO/PDGF-BB-15组碱性磷酸酶阳性染色面积最大，见图4。碱性磷酸酶定量分析结果显示，相同成骨诱导培养时间下，CS/rGO/PDGF-BB-15组磷酸酶活性大于对照组、CS/rGO组(P < 0.05)，CS/rGO组碱性磷酸酶活性大于对照组(P < 0.05)，见图4。

茜素红染色结果显示，随着成骨诱导时间的延长，各组茜素红阳性染色面积增加，其中CS/rGO/PDGF-BB-15组茜素红阳性染色面积最大，见图5。茜素红染色定量分析结果显示，相同成骨诱导培养时间下，CS/rGO/PDGF-BB-15组钙结节沉积吸光度值大于对照组、CS/rGO组(P < 0.05)，CS/rGO组钙结节沉积吸光度值大于对照组(P < 0.05)，见图5。

2.5 支架对大鼠牙周膜干细胞血管形成的影响显微镜下可见3组均形成了毛细血管网络，其中CS/rGO/PDGF-BB-15组毛细血管网络最明显，见图6。各组毛细血管网络中小管节点数、小管节段数量、小管总长度与小管网格数量统结果，见表2。CS/rGO/PDGF-BB-15组毛细血管网络中小管节点数、小管节段数量、小管总长度与小管网格数量均多于对照组、CS/rGO组(P < 0.05)，对照组与CS/rGO组毛细血管网络中小管节点数、小管节段数量、小管总长度与小管网格数量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。

qRT-PCR检测结果显示，CS/rGO/PDGF-BB-15组血管内皮生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达均高于对照组、CS/rGO组(P < 0.05)，对照组与CS/rGO组血管内皮生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

2.6 支架修复大鼠牙槽骨缺损实验
2.6.1 实验动物数量分析 16只SD大鼠全部进入结果分析。
2.6.2 Micro CT扫描结果空白对照组可见明显的骨缺损痕迹，骨修复效果最差；其余3组均可见不同程度的骨缺损修复效果，其中实验组骨缺损修复效果最显著，并且还可见单纯支架组骨缺损修复效果要好于对照组，见图8。

量化分析结果显示，实验组骨体积分数、骨小梁数量大于空白对照组、对照组、单纯支架组(P < 0.05)，骨小梁间隙小于空白对照组、对照组、单纯支架组(P < 0.05)；单纯支架组骨体积分数、骨小梁数量大于空白对照组、对照组(P < 0.05)，骨小梁间隙小于空白对照组、对照组(P < 0.05)；对照组骨体积分数、骨小梁数量大于空白对照组(P < 0.05)，骨小梁间隙小于空白对照组(P < 0.05)；4组之间骨小梁厚度比较无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.6.3 苏木精-伊红染色结果空白对照组仅见少量的新骨形成，对照组、单纯支架组可见较多的新骨形成，并且对照组骨组织中可见新生血管分布，实验组可见大量的新骨形成，并且骨组织中可见大量的新生血管分布，见图9。

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引言

由创伤、炎症、牙周疾病或先天性骨开窗等原因造成的牙槽骨缺损是临床常见病，长期的牙槽骨缺损将导致牙齿松动、脱落甚至对颜面部美观造成影响[1]。目前主要通过自体骨移植、异体与异种骨移植与人工合成材料修复骨缺损[2]，但是上述方法存在自体骨量不足、异体骨移植后免疫排斥反应、异体骨移植伦理限制等问题[3]。因此，制备合适的人工合成材料一直是该领域的研究热点。近年来骨组织工程技术迅速发展，为骨缺损修复提供了新的思路与选择。
骨组织工程包括种子细胞、生物活性分子与生物材料支架三大要素[4]。生物材料支架需具有良好的生物相容性、降解性、机械强度等，可为种子细胞的生长提供三维结构空间，为血管的长入提供有利条件[4-5]。壳聚糖作为天然高分子材料具有良好的降解性、生物相容性、生物活性及安全性，但壳聚糖作为支架存在机械性能不足、降解速率过快等问题[6-7]。
还原氧化石墨烯作为石墨烯的衍生物之一，是将氧化石墨烯通过还原反应获得，具有较高的比表面积、机械性能与导电率等，并且较氧化石墨烯具有更好的生物安全性与稳定性，已被广泛应用于细胞培养、生物传感及骨组织工程中[8-9]。研究证实，相较于壳聚糖支架，壳聚糖/还原氧化石墨烯支架具有良好的吸水率、降解速率与机械性能，能促进人牙髓干细胞的增殖与黏附，可作为骨组织工程支架[10-11]。牙周膜干细胞是从牙周膜中分离出来的一类干细胞，可分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞，形成牙槽骨、牙周纤维及牙骨质结构[12]，可作为牙槽骨缺损修复的种子细胞。
血小板衍生生长因子在器官胚胎发生与发育、创伤愈合过程中发挥着重要作用，是成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和神经胶质细胞等分裂增殖时的重要促细胞分裂原[13]。研究显示，血小板衍生生长因子BB可刺激间充质干细胞的增殖与成骨分化，加快成骨样细胞的钙化进程[14-15]；可促进成骨细胞的迁移，促进新骨形成[16]；可促进人牙槽骨缺损修复及牙周软组织再生[17]；此外，血小板衍生生长因子BB还具有趋化活性与促血管生成活性[18]，发挥促骨损伤修复作用。
基于以上研究背景，此次实验利用壳聚糖/还原氧化石墨烯支架负载血小板衍生生长因子BB，观察该支架对大鼠牙周膜干细胞增殖、迁移及成骨、成血管分化的作用，以及在大鼠牙槽骨缺损修复中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞实验与动物实验，组间比较进行单因素方差分析及事后Turkey检验。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年10月在承德医学院附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞、试剂与仪器天然石墨粉(纯度> 99.98 %，泰州巨纳新能源有限公司)，壳聚糖(脱乙酰度95%，上海吉至生化科技有限公司)，血小板衍生生长因子BB(上海联迈生物工程有限公司)，抗坏血酸(廊坊鹏彩精细化工有限公司)，高锰酸钾(襄阳友德仕化工有限公司)，β-甘油磷酸钠(合肥博美生物科技有限责任公司)，大鼠牙周膜干细胞(上海康朗生物科技有限公司)，血小板衍生生长因子BB ELISA检测试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)，CCK-8试剂、胎牛血清、DMEM培养基(北京麦格生物医学有限公司)，碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶定量试剂盒(西安齐岳生物科技有限公司)，茜素红(湖北兴恒业科技有限公司)，苏木精-伊红染色试剂盒(西安齐岳生物科技有限公司)，磁力搅拌器(杭州秋籁科技有限公司)，倒置显微镜(4XCE，济宁市鑫兖矿山机械设备有限公司)，真空冷冻干燥机(北京亚星仪科科技发展有限公司)，Transwell小室(苏州青柠生物科技有限公司)，酶标仪(HBS-1101，南京德铁实验设备有限公司)，小动物Micro CT扫描仪(上海佰珐科学仪器有限公司)。
1.3.2 实验动物雄性SD大鼠16只，8周龄，SPF级，体质量(200±15) g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，使用许可证号：SYXK(京)2022-0004。动物实验已通过承德医学院附属医院伦理委员会审批(NO.CYFYLL2023714)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备壳聚糖/还原氧化石墨烯支架
制备氧化石墨烯：采用改良Hummers法制备氧化石墨烯[19]。在冰浴下称量1 g石墨加入25 mL浓硫酸中混匀，然后缓慢加入3.5 g高锰酸钾粉末并搅拌2 h，更换为 35 ℃水浴在加热状态下继续反应1.5 h；向混合溶液中加入60 mL去离子水，将水浴装置加热至98 ℃反应10 min，加入100 mL去离子水稀释混合溶液；加入过量的体积分数30%过氧化氢溶液，观察反应无气泡产生后静置并冷却反应液，用10%稀盐酸充分洗涤并离心，加入氯化钡溶液反应直至无沉淀产生为止；真空冷冻干燥24 h得到棕黄色粉末，溶于去离子水中超声剥离3 h，得到3 mg/mL氧化石墨烯分散液。
制备还原氧化石墨烯：采用化学还原法制备还原氧化石墨烯[19]。将抗坏血酸粉末加入氧化石墨烯分散液中，其中抗坏血酸与氧化石墨烯的质量比为10∶1，超声冰浴下分散1 h，室温下静置48 h；用去离子水充分洗涤反应液，直至溶液呈中性为止，真空冷冻干燥48 h，得到黑褐色絮状粉末。
制备壳聚糖/还原氧化石墨烯支架：在120 ℃、0.2 MPa高温高压下处理壳聚糖10 min；将0.2 g壳聚糖加入到9 mL HCl(0.1 mol/L)中，利用磁力搅拌器搅拌2 h，加入25 mg还原氧化石墨烯粉末，超声冰浴下分散1 h；将0.56 g β-甘油磷酸钠加入1 mL三蒸水中，超声冰浴下反应15 min，得到β-甘油磷酸钠溶液，逐滴加入壳聚糖/还原氧化石墨烯分散液中，置于37 ℃水浴箱内反应10 min，再置于-20 ℃冰箱内冷冻24 h，真空冷冻干燥48 h，得到壳聚糖/还原氧化石墨烯支架(记为CS/rGO支架)[19]。
1.4.2 制备负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架在制备CS/rGO支架的过程中，将不同质量的血小板衍生生长因子BB分别加入β-甘油磷酸钠溶液，使其终质量浓度分别为5，10，15，20 mg/L，同理制备壳聚糖/还原氧化石墨烯/血小板衍生生长因子BB支架，分别记为CS/rGO/PDGF-BB-5、CS/rGO/PDGF-BB-10、CS/rGO/PDGF-BB-15、CS/rGO/PDGF-BB-20支架。
1.4.3 大鼠牙周膜干细胞的培养复苏冻存的大鼠牙周膜干细胞悬液(1 mL)，加入4 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基混匀，1 000 r/min离心4 min后弃上清液，再加入2 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基混匀，于培养瓶中过夜后，观察细胞融合达到80%-90%后进行传代培养。取第3-5代大鼠牙周膜干细胞进行后续实验。
1.4.4 筛选适宜的血小板衍生生长因子BB负载质量浓度通过CCK-8实验与Transwell小室实验分别检测细胞增殖与迁移情况，筛选适宜的生长因子负载质量浓度进行后续实验。
支架对大鼠牙周膜干细胞增殖的影响：将5组支架经环氧乙烷灭菌(50 ℃，1 h)后分别置于96孔板内，将大鼠牙周膜干细胞悬液分别接种于96孔板内的各支架上，以未加入支架单独培养的细胞悬液为对照，细胞密度为1×103/孔，每组3复孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养。培养1，3，5，7 d后，向每孔内加入10%CCK-8试剂孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
支架对大鼠牙周膜干细胞迁移的影响：将大鼠牙周膜干细胞悬液分别接种于Transwell小室的上室中，细胞密度为1×106/孔，在Transwell小室的下室中分别放入CS/rGO、CS/rGO/PDGF-BB-5、CS/rGO/PDGF-BB-10、CS/rGO/PDGF-BB-15、CS/rGO/PDGF-BB-20支架，在下室均加入500 µL DMEM培养基，设置阴性对照(未加入支架，仅加入DMEM培养基)与阳性对照组(未加入支架，仅加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养。培养24 h后，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，擦除小室上层表面未迁移的细胞，滴加结晶紫染色液染色5 min，用PBS清洗后取下滤膜，置于载玻片上，显微镜下观察迁移至滤膜下表面的细胞并拍照，随机选取3个视野，利用Image J软件统计迁移至滤膜下表面的细胞数量。
1.4.5 检测支架的缓释性能将CS/rGO/PDGF-BB-15支架置于4 mL EP管内，向管内加入3 mL PBS(pH=7.4)，置于摇床内37 ℃下孵育，摇床振荡速率为80 r/min。设定不同的孵育时间点(第1，4，7，14，21，28，35，42天)，吸取PBS置于-20 ℃保存，同时添加新鲜的3 mL PBS(pH=7.4)。取冻存的PBS样本，采用ELISA法检测血小板衍生生长因子BB浓度，绘制血小板衍生生长因子BB缓释曲线，计算血小板衍生生长因子BB累计释放率。
1.4.6 支架对大鼠牙周膜干细胞成骨分化的影响将CS/rGO支架、CS/rGO/PDGF-BB-15支架分别置于6孔板内，每孔加入DMEM培养基，支架表面积与DMEM培养体积比为3 cm2/1 mL，于37 ℃下浸提2 d，通过细菌过滤器获得支架浸提液，置于4 ℃冰箱保存。
将大鼠牙周膜干细胞悬液分别接种于24孔板内，细胞密度为5×104/孔，培养24 h后弃原培养基，分3组处理：对照组更换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，CS/rGO支架组更换为含体积分数10%胎牛血清的CS/rGO支架浸提液，CS/rGO/PDGF-BB-15支架组更换为含体积分数10%胎牛血清的CS/rGO/PDGF-BB-15支架浸提液，每组进行成骨诱导(加入50 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸和10 nmol/L地塞米松)培养，每组3复孔。每3 d更换一次培养基。成骨诱导培养7，14 d进行碱性磷酸酶染色，显微镜下观察并拍照；进一步使用碱性磷酸酶定量试剂盒分析碱性磷酸酶活性。成骨诱导14，21 d进行茜素红染色，显微镜下观察并拍照；进一步量化分析钙结节沉积情况，每孔加入100 µL 10%氯化十六烷基吡啶孵育1 h，使用酶标仪在562 nm处检测吸光度值。
1.4.7 支架对大鼠牙周膜干细胞血管形成的影响将CS/rGO支架、CS/rGO/PDGF-BB-15支架经环氧乙烷灭菌(50 ℃，1 h)后分别置于12孔板内，将大鼠牙周膜干细胞悬液分别接种于12孔板内的各支架上，以未加入支架单独培养的细胞为对照，细胞密度为8×104/孔，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养。
培养4 d后收集各组细胞，计数细胞并稀释至1.5×108 L-1。制备基质胶，将100 µL各组细胞悬液缓慢接种于基质胶上，十字摇匀，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养。培养24 h后，显微镜下观察并拍照，利用Image J软件统计小管节点数、小管节段数量、小管总长度与小管网格数量。
培养4 d后收集各组细胞，弃培养基，用PBS清洗，加入TRIzol细胞裂解液冰上裂解10 min，提取细胞RNA，检测RNA纯度与浓度。将RNA反转录为cDNA，配置反应体系，进行PCR扩增反应：96 ℃预变性1 min；95 ℃10 s、60 ℃30 s、72 ℃32 s，扩增50个循环。采用qRT-PCR检测血管内皮生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达，以GAPDH为内参。引物序列见表1。

1.4.8 支架修复大鼠牙槽骨缺损实验将第3代大鼠牙周膜干细胞悬液分别接种于CS/rGO、CS/rGO/PDGF-BB-15支架共培养，细胞数量约1×105，细胞培养基为体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基。共培养2 d后用于牙槽骨缺损修复实验。腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉16只SD大鼠，仰卧位固定于手术台，在双侧上颌常规备皮、消毒、铺巾，分离上颌第一磨牙腭侧的牙龈与黏骨膜，在第一磨牙前用球钻做一大小为 2 mm×2 mm×1 mm 的牙槽骨缺损，随机分4组干预：空白对照组(n=4)不进行任何治疗，单纯支架组(n=4)植入CS/rGO/PDGF-BB-15支架，对照组(n=4)植入CS/rGO支架与大鼠牙周膜干细胞复合物，实验组(n=4)植入CS/rGO/PDGF-BB-15支架与大鼠牙周膜干细胞复合物，逐层缝合。术后连续3 d肌注青霉素钠4×104 U。
Micro CT扫描：术后12周，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，使用Micro CT扫描SD大鼠上颌骨(80 kV，100 μA，单次曝光时间50 ms，扫描分辨率25 μm，扫描角度间隔0.5°)并利用重建和分析软件Hiscan Analyzer software进行数据采集与分析。
苏木精-伊红染色：Micro CT扫描后于麻醉状态下处死大鼠，收集上颌骨置于10%EDTA(pH=7.4)中37 ℃振荡3个月以脱钙。常规脱水石蜡包埋后，在缺损处做连续切片(5 μm厚)，按苏木精-伊红染色试剂盒说明书染色以检测缺损处骨组织再生情况。
1.5 主要观察指标各组支架对大鼠牙周膜干细胞增殖、迁移、成骨分化及成血管的影响，以及各组大鼠牙槽骨缺损修复效果。
1.6 统计学分析利用SPSS 23.0软件进行统计处理，实验数据均以x±s格式表达，采用单因素方差分析及事后Turkey检验对实验结果进行分析，检验水准α=0.05，P < 0.05认定为差异有显著性意义。该文统计学方法已经承德医学院附属医院生物统计学专家审核。

讨论

生长因子作为大分子蛋白存在半衰期短、易分解等问题，将生长因子负载到适宜的生物材料支架上可使其缓慢持续释放，维持有效的作用浓度，成为目前研究的热点话题。LIU等[20]采用负载神经生长因子的壳聚糖支架修复成年大鼠坐骨神经长节段(20 mm)缺损，8周后可见明显的运动和感觉功能恢复，组织学观察显示再生的坐骨神经不仅与神经元重新连接，还重建了与中枢神经系统的神经回路，表明该新型仿生支架能够促进坐骨神经扩展缺损的再生和功能回路的重建。ZHOU等[21]利用氧化石墨烯薄片吸附转化生长因子β3并掺入胶原蛋白水凝胶中，结果显示氧化石墨烯薄片对转化生长因子β3的吸附率> 99%、释放率< 1.7%，表明氧化石墨烯薄片可以高效地在3D环境中递送生长因子，以引导相同支架中的细胞并诱导组织形成。SANMUGAM等[22]研究构建了壳聚糖/还原氧化石墨烯/氧化铈药物递送载体，结果显示该载体具有良好的理化性能，有利于NIH3T3细胞的黏附，并发挥金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用。以上研究结果说明，壳聚糖/还原氧化石墨烯支架适宜作为生长因子与药物的载体。结合以往文献与预实验结果[23]，此次实验将不同质量浓度(5，10，15，20 mg/L)的血小板衍生生长因子负载于壳聚糖/还原氧化石墨烯支架中，观察其对大鼠牙周膜干细胞增殖与迁移的影响，结果显示负载不同浓度血小板衍生生长因子的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架均可促进大鼠牙周膜干细胞的增殖与迁移，并且以负载15 mg/L血小板衍生生长因子BB组促进大鼠牙周膜干细胞增殖与迁移的作用最显著。以往研究已证实，血小板衍生生长因子BB可促进牙周膜干细胞的增殖与迁移[24]，此次实验获得了与以往研究结果一致的结论，说明将血小板衍生生长因子BB负载于壳聚糖/还原氧化石墨烯支架中依然可以发挥其生物学作用。Elisa检测结果显示，壳聚糖/还原氧化石墨烯支架早期可大量快速释放血小板衍生生长因子BB发挥生物学效应，后期缓慢持续释放血小板衍生生长因子BB，为充分发挥血小板衍生生长因子BB的生物学效应提供基础。
骨组织再生是涉及多方面的复杂过程，缺损区域及其周围干细胞的募集在损伤初期至关重要，随后是血管的形成，充足的干细胞与血液供应是生物材料与组织相互作用的关键，最后促进成骨[25]。牙槽骨内含有丰富的毛细血管，因此血管形成是骨组织修复的必要条件：氧气与营养物质可通过血液循环运输至缺损部位，同时带走代谢产物；间充质干细胞可通过血液循环聚集至缺损部位，参与骨组织的修复。KIM 等[26]研究显示，血小板衍生生长因子BB可促进骨髓来源内皮祖细胞的增殖、迁移与成血管能力。SU等[27]研究发现，来源于破骨前细胞的血小板衍生生长因子BB是骨关节炎发展过程中病理性软骨下骨血管生成的关键驱动因素。GUO等[28]研究结果证实，外源性给予血小板衍生生长因子BB可上调新生缺氧肺动脉高压大鼠增殖细胞核抗原表达，促进肺血管重构。此次实验结果显示，与对照组比较，CS/rGO支架对基质胶上大鼠牙周膜干细胞的血管网络形成与成血管基因表达无明显明显的影响，而CS/rGO/PDGF-BB-15支架可促进基质胶上大鼠牙周膜干细胞的血管网络形成与成血管基因表达，说明支架中的血小板衍生生长因子BB可促进大鼠牙周膜干细胞的成血管分化，获得了与以往研究一致的结论。除了促血管形成作用，血小板衍生生长因子BB还可促进干细胞的成骨分化。此次实验结果显示，与对照组比较，CS/rGO支架可促进大鼠牙周膜干细胞的成骨分化，而CS/rGO/PDGF-BB-15支架的促细胞成骨分化作用强于CS/rGO支架，说明血小板衍生生长因子BB协同壳聚糖/还原氧化石墨烯支架显著促进了大鼠牙周膜干细胞的成骨向分化。
为进一步评估CS/rGO/PDGF-BB-15支架的促骨形成作用，进行了大鼠牙槽骨缺损修复实验。Micro CT可以精确观察到骨再生过程中骨组织的微小变化，评估骨密度、软骨骨化情况来评估骨再生以及软骨中的钙质沉积变化情况。Micro CT扫描结果显示，CS/rGO/PDGF-BB-15支架的骨缺损修复作用强于CS/rGO支架联合大鼠牙周膜干细胞移植，分析认为可能是支架中的血小板衍生生长因子BB促进了外周干细胞的增殖、迁移与成血管分化，进而促进成骨；而CS/rGO/PDGF-BB-15支架联合大鼠牙周膜干细胞的骨缺损修复作用强于单纯的CS/rGO/PDGF-BB-15支架，说明支架中的血小板衍生生长因子BB促进了大鼠牙周膜干细胞的增殖、迁移与成血管、成骨分化，进而促进骨修复。苏木精-伊红染色进一步验证了Micro CT扫描结果。以往研究结果显示，血小板衍生生长因子BB可通过激活丝裂原活化蛋白激酶与磷脂酰肌醇3激酶信号通路、抑制p53/p21信号通路促进间充质干细胞的增殖[29-30]，通过Ras/ERK1/2信号通路调控精原干细胞的增殖[31]，通过Wnt/β-catenin信号通路调节干细胞的成骨分化[32]，通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路调控人脐静脉内皮细胞的迁移和血管生成[33]。
综上所述，负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架可通过促进大鼠牙周膜干细胞的增殖、迁移、成血管与成骨分化，进而有效促进大鼠牙槽骨缺损的修复。但是研究还有许多不足之处，例如：未进一步探寻血小板衍生生长因子的最佳负载浓度；对于动物实验仅设置了一个时间点，未动态观察骨修复效应，未进行血管形成的组织学观察；另外，未进一步分析血小板衍生生长因子BB的作用机制，这些将在后续实验中进行。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

负载血小板衍生生长因子BB的壳聚糖/还原氧化石墨烯支架修复牙槽骨缺损

Platelet-derived growth factor BB-loaded chitosan/reduced graphene oxide scaffold for repairing alveolar bone defects

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