脊髓损伤后氧化应激相关基因及分子机制：基于GEO数据库的数据分析及验证

doi:10.12307/2025.912

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (32): 6893-6904.doi: 10.12307/2025.912

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脊髓损伤后氧化应激相关基因及分子机制：基于GEO数据库的数据分析及验证

王子恒，吴霜

贵州医科大学附属医院康复医学科，贵州省贵阳市 550000

收稿日期:2024-07-13 接受日期:2024-10-31 出版日期:2025-11-18 发布日期:2025-04-26
通讯作者: 吴霜，博士生导师，主任医师，主任，贵州医科大学附属医院康复医学科，贵州省贵阳市 550000
作者简介:王子恒，1998年生，贵州省遵义市人，硕士，主要从事神经康复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区项目(82060419，82260452)：项目负责人：吴霜；贵州省科技计划项目[黔科合基础-ZK(2022)重点045]：项目负责人：吴霜

Oxidative stress-related genes and molecular mechanisms after spinal cord injury: data analysis and verification based on GEO database

Wang Ziheng, Wu Shuang

Department of Rehabilitation Medicine, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China

Received:2024-07-13 Accepted:2024-10-31 Online:2025-11-18 Published:2025-04-26
Contact: Wu Shuang, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Rehabilitation Medicine, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
About author:Wang Ziheng, MS, Department of Rehabilitation Medicine, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Regional Project), Nos. 82060419 and 82260452 (both to WS); Guizhou Provincial Science and Technology Plan Project, No. ZK(2022)045 (to WS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物信息分析：通过信息科学的方法和技术，探究生物体系和过程中的信息存储、内涵及传递，并分析生物分子数据，为理解生命复杂性提供新视角。此次研究利用了两种机器算法(最小绝对收缩和选择算法和支持向量机递归特征消除)鉴定出与氧化应激相关的生物标志物。最小绝对收缩和选择算法在变量选择、正则化、降低过拟合及高维数据处理上表现出色，而支持向量机递归特征消除则适用于多种数据类型并提升模型可解释性，结合两种算法，可提高生物标志物鉴定的准确性和可靠性。
脊髓损伤：可源自创伤、疾病或先天性因素，此损伤会阻碍损伤部位以下的感觉与运动功能，极大地削弱患者的活动能力、自理能力和工作能力。当前，氧化应激相关基因在脊髓损伤进展中的具体作用仍不明确。故而深入探究氧化应激相关基因在脊髓损伤演变过程中的角色，并明晰其背后的分子机制，对于促进脊髓损伤治疗手段的进步具有至关重要的意义。

背景：在脊髓损伤中，氧化应激的生物学意义尚未得到系统研究。
目的：探讨氧化应激相关基因在脊髓损伤发展过程中的作用并阐明相关的分子机制。
方法：从基因表达综合数据库(GEO)获取了GSE151371数据集，并从GeneCards数据库中筛选出了与氧化应激高度相关的基因集(包含相关得分≥7的899个基因)。首先，对脊髓损伤患者和健康对照组的样本进行了差异表达基因分析，之后将这899个氧化应激基因与差异表达基因进行交叉比对，识别出与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因。采用最小绝对值收缩和选择算子以及支持向量机递归特征消除算法，基于与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因推导出潜在的生物标志物，对这些生物标志物进行了基因本体论和京都基因与基因组百科全书富集分析，以探究其在生物学过程中的作用及参与的信号通路。此外，构建了一个竞争性内源性RNA网络，对免疫微环境进行了深入分析，并预测了与这些生物标志物相关的转录因子，探索了可能的潜在治疗药物。从贵州医科大学附属医院收集了8例急性期脊髓损伤患者和7例对照组的15份血液样本进行RT-qPCR分析，评估生物标志物在脊髓损伤和对照样本之间的表达情况。
结果与结论：①脊髓损伤和对照样本之间有2 511个差异表达基因，通过交叉分析氧化应激基因和差异表达基因，得到了151个与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因；通过最小绝对值收缩和选择算子及支持向量机递归特征消除算法鉴定出6个生物标志物，分别为S100A9、PLAU、CASP4、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B，它们共同参与了对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化还原酶活性、氧化磷酸化等；②6个信使RNA (mRNA)、8个微小RNA(miRNA)和50个长链非编码RNA (lncRNA)构成了mRNA-miRNA-lncRNA网络，包括S100A9-hsa-mir-16-5p-HCG18、CYP1B1-hsa-mir-429-KCNQ1OT1等关系对；③在脊髓损伤和对照样本之间，9种免疫细胞的浸润水平明显不同，如浆细胞、静息的自然杀伤细胞、M0巨噬细胞等；④预测的前5个转录因子是FOSB、ZNF581、SP110、NFIL3和BATF2，其中ZNF581和NFIL3在脊髓损伤和对照样本之间的表达差异显著；⑤基于6个生物标志物预测了多种药物，分子对接结果显示 β-萘黄酮与CYP1B1的靶蛋白具有良好的结合活性，它们形成的相互作用对包括DB01373-S100A9、DB01065-CYP1B1等；⑥在临床RT-qPCR验证中，S100A9、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B在脊髓损伤组和对照组之间显示出显著差异，而PLAU和CASP4在脊髓损伤组中呈上升趋势；⑦此次研究识别了6个关键生物标志物，包括S100A9、PLAU、CASP4、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B，然后基于6个生物标志物预测了100种小分子药物，对国人的健康管理和疾病防治具有重要的借鉴意义，为国人在脊髓损伤治疗方案选择上提供了新的思路。
https://orcid.org/0009-0005-6672-5033(王子恒)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 氧化应激, 差异表达基因, 生物信息学, 生物标志物, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: The biological significance of oxidative stress in spinal cord injury has not been systematically investigated.
OBJECTIVE: To investigate the role of oxidative stress-related genes in the development of spinal cord injury and to elucidate the related molecular mechanisms.
METHODS: The GSE151371 dataset was obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) database and selected a gene set highly relevant to oxidative stress from the GeneCards database (including 899 genes with relevance scores of no less than 7). Firstly, we performed differential expression gene analysis on samples from spinal cord injury patients and healthy controls. Subsequently, we cross-referenced these 899 oxidative stress genes with the differential expression genes to identify oxidative stress-related genes closely associated with spinal cord injury (spinal cord injury-reactive oxygen species-related genes). Then, the Least Absolute Shrinkage and Selection Operator and Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination algorithms were used to derive potential biomarkers based on the spinal cord injury-reactive oxygen species-related genes. Following this, Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses on these biomarkers were conducted to explore their roles in biological processes and the signaling pathways they participate in. Additionally, we constructed a competing endogenous RNA network and performed an in-depth analysis of the immune microenvironment. We predicted transcription factors related to these biomarkers and explored potential therapeutic drugs. Finally, fifteen blood samples from eight patients with acute spinal cord injury and seven controls were collected from Affiliated Hospital of Guizhou Medical University for reverse transcription quantitative polymerase chain reaction analysis to evaluate the expression of biomarkers between spinal cord injury and control samples.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were 2 511 differential expression genes between spinal cord injury and control samples. Cross-analysis of oxidative stress genes and differential expression gene resulted in 151 spinal cord injury-reactive oxygen species-related genes. Least Absolute Shrinkage and Selection Operator and Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination identified six biomarkers-S100A9, PLAU, CASP4, GAPDH, CYP1B1, and HSPA1B-involved in activities such as nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidoreductase activity and oxidative phosphorylation. (2) Six messenger RNAs (mRNAs), eight microRNAs (miRNAs), and 50 long noncoding RNAs (lncRNAs) formed the mRNA-miRNA-lncRNA network, including relationships such as S100A9-hsa-mir-16-5p-HCG18 and CYP1B1-hsa-mir-429-KCNQ1OT1. (3) Infiltration levels of nine immune cells, including plasma cells, resting natural killer cells, and M0 macrophages, showed significant differences between spinal cord injury and control samples. (4) The top five predicted transcription factors were FOSB, ZNF581, SP110, NFIL3, and BATF2, with ZNF581 and NFIL3 showing significant expression differences between spinal cord injury and control samples. (5) The study predicted a variety of drugs based on the six biomarkers, and the molecular docking results showed that β-naphthoflavone had good binding activity to the target protein of CYP1B1. The interaction pairs they formed included DB01373-S100A9 and DB01065-CYP1B1. (6) In reverse transcription quantitative polymerase chain reaction verification, S100A9, GAPDH, CYP1B1, and HSPA1B showed significant differences between spinal cord injury and control groups, while PLAU and CASP4 showed an increasing trend in spinal cord injury group. (7) This study identified six key biomarkers, including S100A9, PLAU, CASP4, GAPDH, CYP1B1, and HSPA1B, and subsequently predicted 100 small-molecule drugs based on these biomarkers. These findings provide valuable insights for health management and disease prevention among the Chinese population, offering new perspectives for spinal cord injury treatment options.

Key words: spinal cord injury, oxidative stress, differentially expressed gene, bioinformatics, biomarker, engineered tissue construction

中图分类号:

王子恒, 吴霜. 脊髓损伤后氧化应激相关基因及分子机制：基于GEO数据库的数据分析及验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(32): 6893-6904.

Wang Ziheng, Wu Shuang. Oxidative stress-related genes and molecular mechanisms after spinal cord injury: data analysis and verification based on GEO database[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(32): 6893-6904.

图/表（结果） 14

2.1 与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因的鉴定和功能注释分析从GSE151371数据库(脊髓损伤和对照样本)中筛选出2 511个差异表达基因，其中包括1 236个上调基因和1 275个下调基因(图1A，B)。将氧化应激基因与差异表达基因相交，得到了151个与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因(图1C)。然后，对151个与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因参与了1 606个GO条目，包括抗氧化活性、过氧化物质基质、对氧化应激的响应、对活性氧的响应、活性氧代谢过程等(图1D)。与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因富集在104个KEGG通路中，包括化学致癌-活性氧、神经营养因子信号通路、多种疾病神经退行性通路等(图1E)。
2.2 生物标志物的获得和分析使用glment包对151个基因进行LASSO和SVM-RFE分析，分别获得了15和21个基因(图2A-C)，将LASSO和SVM-RFE获得的基因取交集获得了6个生物标志物，分别是S100A9、PLAU、CASP4、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B(图2D)。从箱线图中可以看出，所有生物标志物在脊髓损伤组和对照组之间的表达差异显著(图2E)。同样，RT-qPCR结果显示，脊髓损伤组和对照组之间S100A9、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B存在显著差异，而PLAU和CASP4在脊髓损伤中呈上升趋势(图3)。相关性分析表明，生物标志物之间呈显著正相关，其中S100A9和CYP1B1的正相关性最高(图2F)。单基因集富集分析显示，生物标志物共同参与的GO条目包括抗原处理与呈递、内体膜、作用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的氧化还原酶活性、mRNA结合、组蛋白结合、电子转移活性等，KEGG通路包括氧化磷酸化等(图2G)。
2.3 免疫浸润分析为了展示训练集中脊髓损伤和对照组之间免疫细胞含量的差异，构建了免疫细胞浸润水平丰度，如图4A所示，22种免疫细胞在脊髓损伤和对照样本之间存在差异。在两组之间，9种免疫细胞的浸润水平显著不同，包括浆细胞、休息状态的自然杀伤细胞和M0型巨噬细胞等(图4B)。之后分析了基因与差异细胞的相关性，结果表明，6个生物标志物与浆细胞和γδT细胞呈显著正相关，与记忆休息状态的CD4 T细胞和静止状态的CD4 T细胞呈负相关(图4C)。
2.4 转录因子生物标志物的鉴定为了研究生物标志物的上游调控机制，使用spearman分析构建基因与转录因子的相关性。预测的前5个转录因子为FOSB、ZNF581、SP110、NFIL3和BATF2，其中FOSB、ZNF581和NFIL3与部分生物标志物显著相关，例如，FOSB与S100A9、CYP1B1呈显著负相关，而NFIL3与S100A9、PLAU、CASP4和CYP1B1呈显著正相关(图5A-C)。
2.5 mRNA-miRNA-lncRNA网络及药物预测为了揭示不同RNA分子之间通过竞争性结合miRNA来调控彼此表达的复杂网络，此次研究从miRDB和miRNet数据库预测的miRNAs中取交集后得到了42个相交的miRNAs(其中有8个miRNAs的调控目标数量大于2)，见图6A。通过对StarBase和LncBase Predicted数据库预测的lncRNAs取交集，获得了292个相交的lncRNAs，其中包括50个调控目标数量大于2的lncRNAs(图6B)。然后用6个mRNAs、8个miRNAs和50个lncRNAs形成了mRNA-miRNA-lncRNA网络，包括S100A9-hsa-mir-16-5p-HCG18、CYP1B1-hsa-mir-429-KCNQ1OT1、CASP4-hsa-mir-23b-3p-SNHG16等关系对(图6C)。此外，基于生物标志物，在DrugBank 数据库预测了100种小分子药物，并且它们形成的相互作用对包括DB01373-S100A9、DB01065-CYP1B1和DB00594-PLAU等(图7A)。在DGIdb数据库预测了119个小分析药物(图7B)，将2个数据库6个生物标志物预测的药物分别取交集，只有CYP1B1取到了3个交集药物，分别是β-萘黄酮(BETA-NAPHTHOFLAVONE)、阿莫地喹(AMODIAQUINE)、

柚皮素(NARINGENIN)(图7C)；其余基因均无交集药物。对β-萘黄酮与CYP1B1做分子对接，结果显示，活性成分与蛋白之间的对接亲和力为-50 kJ/mol，表明该成分与靶蛋白具有良好的结合活性(表2，图7D)。

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引言

脊髓损伤是全球严重的健康问题[1]，通常由初始的机械性损伤触发，随后引发一系列病理生理过程，这些过程会加剧损伤程度并导致神经功能的进一步恶化[2]。每年新增病例超过250万例，随着交通事故和极限运动的增加，脊髓损伤的发生率正在上升[3]。因此，脊髓损伤对患者及其家庭和社会都产生了严重的影响[4]。脊髓损伤的病理过程涉及原发性损伤和继发性损伤[5]。原发性损伤是指由外部因素引起的脊髓损伤，如高处跌落、交通事故和体育活动[6]；继发性损伤包括炎症和组织损伤，可能导致多种并发症[7]。由于脊髓损伤的复杂性，现有治疗方法和药物有限[8]。尽管已有多种治疗策略在研究中，但尚未找到一种能够全面且有效地促进脊髓损伤后神经细胞再生的治疗方法。因此，深入研究神经细胞再生的机制，开发新的治疗策略，是当前脊髓损伤研究的重要方向。
根据对脊髓损伤研究的当前进展，继发性损伤涉及的复杂病理生理机制包括炎症、缺血、离子不平衡、氧化应激和胶质瘢痕，进一步导致严重的组织损伤，损害神经可塑性，并阻碍功能恢复，其中氧化应激，即体内氧化反应过度的状态，通过氧化膜脂、蛋白质变性、DNA破坏和诱导内质网应激等途径促使细胞凋亡[9]，从而影响细胞或组织[10-11]。研究表明，脊髓损伤后红细胞泄漏导致过多的铁生成[12]，破坏细胞铁代谢，促进活性氧化物质的产生，活性氧和氧化应激的形成及后续增加是与脊髓损伤相关的重要事件。越来越多的研究表明，阻断氧化应激反应对于脊髓损伤的治疗和管理至关重要[13-14]。例如，氧化应激可能通过影响线粒体自噬来影响脊髓损伤[15]，这是维持体内线粒体稳态的重要机制[16]。有证据表明，减少氧化应激并促进线粒体自噬可以减少神经细胞凋亡，并在脊髓损伤后进一步恢复神经功能[16-17]。然而，目前国内对脊髓损伤的研究多集中在急性期的外科干预和康复治疗，针对氧化应激相关分子机制的深入研究仍然有限。氧化应激相关基因在脊髓损伤发展中的作用尚不清楚。探讨氧化应激相关基因在脊髓损伤发展过程中的作用并阐明相关的分子机制对于推动脊髓损伤治疗的进展至关重要，同时能为国内患者开发个性化治疗方案，减轻组织损伤。
此次研究旨在通过生物信息学分析，调查脊髓损伤中氧化应激相关基因的作用和功能。通过差异表达分析筛选出相关的氧化应激基因，并利用最小绝对值收缩和选择算子(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator，LASSO)和支持向量机递归特征消除(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination，SVM-RFE)分析确定其生物标志物并进行验证，并对这些标志物进行了基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。此外，构建了竞争性内源性RNA(Competing Endogenous RNA，ceRNA)网络，并对免疫微环境进行了分析。最后，预测了生物标志物的转录因子及潜在的治疗药物。通过深入了解这些基因的作用机制，希望为中国脊髓损伤患者制定更具针对性的治疗策略提供重要支持，进而提升患者的生活质量及康复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 数据获取从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds，由美国国家生物技术信息中心创建)中下载脊髓损伤患者 mRNA 数据(GSE151371)，该数据集包括10例无中枢神经系统病理史(Control)的健康对照和38例有创伤性急性期脊髓损伤患者的测序样本[18]。在GeneCards数据库(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/，由以色列魏茨曼科学研究院开发)中下载氧化应激基因集，选择“Relevancescore”≥ 7的基因与差异表达基因取交集，得到与脊髓损伤相关的氧化应激相关基因。
1.2 与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因的筛选在使用 DESeq2 软件包进行分析时[19]，选择了脊髓损伤组和对照组之间的差异表达基因，条件为 P.adj < 0.05 且|logFC| > 1。将这些差异表达基因与 899 个氧化应激基因取交集后，得到了氧化应激相关基因。随后，对这些氧化应激相关基因进行了GO和KEGG的富集分析，以深入了解它们在功能和通路上的特征。
1.3 通过机器学习方法选择生物标志物首先，通过glmnet软件包对与脊髓损伤紧密关联的氧化应激相关基因进行了LASSO操作[20]，以获取相应的基因，并绘制了交叉验证误差图和基因系数图来展示结果。接下来，采用SVM-RFE(递归特征消除)来评估每个基因的重要性。通过每次迭代组合的误差率和准确率，筛选出误差率最低点上的基因。最后，通过LASSO和SVM-RFE获得的基因取交集，得到生物标志物。此外，对GSE151371数据集中脊髓损伤和对照样本的生物标志物表达进行了分析。基于spearman分析，利用corrplot软件包计算了生物标志物之间的相关性[21]。
1.4 单基因集富集分析通过分子标志数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp，由美国麻省理工学院和哈佛大学联合创立的博德研究所开发)获取了c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt和GOc5.all.v7.1.symbols.gmt基因集。之后，通过 Pearson 相关性计算了生物标志物与GSE151371数据集中所有基因之间的相关系数，并按从大到小的顺序排名。此外，对每个生物标志物进行了基于clusterProfiler软件包的GO和KEGG富集分析[22]，设置P.adjust < 0.05。
1.5 构建ceRNA网络首先，通过miRDB(https://mirdb.org/，由美国密苏里大学的计算生物学和生物信息学实验室开发)和miRNet(https://www.mirnet.ca/，由加拿大滑铁卢大学开发)数据库预测生物标志物靶向的微小RNA(microRNAs，miRNAs)，通过取2个数据库预测的miRNAs的交集获得相交的miRNAs，选择那些具有> 2的调控目标数量的miRNAs用于长链非编码 RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)的预测。接着利用StarBase (https://starbase.sysu.edu.cn/，由中国上海交通大学转化医学研究院创建)和LncBase Predicted(www.microrna.gr/LncBase，由希腊阿森斯大学DIANA实验室开发)数据库预测miRNAs靶向的lncRNAs，通过取2个数据库预测的lncRNAs交集得到相交的lncRNAs，筛选出那些调控目标数量> 2的lncRNAs用于构建ceRNA网络。
1.6 免疫微环境分析通过RNA转录本相对子集的细胞类型鉴定算法，分析了脊髓损伤和对照样本之间的22种免疫细胞比例。随后，通过Wilcoxon检验比较了脊髓损伤和对照样本之间免疫细胞浸润水平的差异，并筛选出具有显著差异的免疫细胞进行与生物标志物的相关性分析。
1.7 转录因子和潜在治疗药物的预测为了探讨生物标志物的上游调控机制，使用在线工具CHEA3(https://maayanlab.cloud/chea3/)预测它们的转录因子，并利用Spearman分析转录因子(前5位)与生物标志物之间的相关性。此外，通过DrugBank数据库(https://www.drugbank.com/，由加拿大阿尔伯塔大学创建)和DGIdb数据库(https://www.dgidb.org/，由美国华盛顿大学创建)分别预测了生物标志物的潜在治疗药物，随后对生物标志物在2个数据库中预测的药物分别取交集，再将交集药物在DGIdb数据库中按照interaction score进行排名，选择排名最高的药物进行分子对接。从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载生物标志物编码的蛋白质三维结构，关键活性成分的分子配体三维结构从 PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索。最后，将蛋白质和配体上传到cb-dock2在线网站(https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)中做分子对接，并计算结合自由能。
1.8 RT-qPCR 从贵州医科大学附属医院收集了8例急性期脊髓损伤患者和7例对照组(健康人)的15份血液样本进行RT-qPCR分析，此次研究已获得贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(批准号：2023185K)，试验对象均知情同意并签署知情同意书。首先，使用TRizol试剂(Ambion，Austin，USA)获得了15个样本的总RNA，并使用NanoPhotometer N50对总RNA进行浓度检测。随后，利用SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit试剂盒(Servicebio，中国武汉)进行反转录合成cDNA。将上述反转录产物cDNA用ddH2O(无RNase/DNase)稀释5-20倍后取3 μL与5 μL 2xUniversal Blue SYBR Green qPCR Master Mix和各1 μL上下游的特异性引物混合，进行RT-qPCR。反应过程如下：在95 ℃下预变性1 min。然后在95 ℃上变性20 s，在55 ℃下退火20 s，然后在72 ℃下延伸30 s，重复该过程40次。最后，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，以GAPDH作为标准化参考。见表1。

讨论

大多数脊髓损伤是由机械性损伤引起的，尽管致病因素已经很清楚，但由于复杂的分子机制，有效的治疗方法一直是神经保护和脊髓损伤再生的难题[23]。氧化应激是脊髓损伤继发性损伤的重要组成部分，引起组织损伤并减缓神经再生速率[24]。研究表明，氧化应激在脊髓损伤的病理生理过程中起关键作用，并通过GO富集分析揭示了应对活性氧挑战和氧化应激的关键生物学过程，这一发现与此次研究成果高度一致[25]。此次研究通过筛选确定了6个关键生物标志物(S100A9、PLAU、CASP4、GAPDH、CYP1B1和HSPA1B)，并探索了它们涉及的GO和KEGG通路。此外，作者发现脊髓损伤组和对照组之间9种免疫细胞浸润水平存在显著差异。在此基础上，作者进一步利用DrugBank和DGIdb两大数据库，筛选了多种具有潜在治疗价值的药物；随后，将2个数据库的交集药物与先前确定的生物标志物进行了分子对接分析，以深入探究其作用机制。此次研究不仅验证了现有文献中的相关发现，更为未来开发针对性的抗氧化治疗策略奠定了坚实的基础，为脊髓损伤治疗开辟了新的研究方向。
Calprotectin(S100A9)是一种与活化中性粒细胞相关的促炎报警蛋白，在炎症刺激下迅速释放，并作为损伤相关分子模式[26-27]。研究发现，S100A9在心肌损伤过程中起到了关键作用，它能够引发线粒体功能障碍，并通过NADPH氧化酶家族途径促进氧化应激，从而加剧心肌的受损状况[28]。此外，还可以通过促进活性氧的生成以及激活补体蛋白C3和C5，进而产生过敏毒素C3a和C5a，诱导了心肌细胞的凋亡[29]。值得一提的是，相较于其他已有研究，此次研究采用了机器学习技术，成功筛选出脊髓损伤中与氧化应激相关的生物标志物S100A9，这一发现为探索S100A9在脊髓损伤中的具体作用机制提供了新的视角。PLAU，也称u-PA，能将非活性纤溶酶原转化为活性丝氨酸蛋白酶纤溶酶，促进细胞迁移、增殖和组织重塑用[30]。因此，PLAU被认为是与癌症转移相关的重要因素之一[30-31]，其特定抑制剂Withaferin A对肿瘤活性氧凋亡产生显著影响[32]。因此作者推测PLAU在脊髓损伤中具有重要作用，其在脊髓损伤中的作用可能与活性氧相关。HSPA1B[热休克蛋白家族A(Hsp70)成员1B]是一个编码蛋白的基因，通过蛋白酶体的蛋白降解和PAK-2p34激活调节先天免疫系统，与蛋白质降解相关[33-34]，它已被确认为是与炎症、恶性肿瘤、纤维化和自免疫性疾病等病理状况相关的潜在生物标志物或免疫调节因子。
此次研究对一些生物标志物进行了单样本基因集富集分析，确定了它们常涉及的免疫和炎症反应相关通路，推测这些生物标志物可能影响脊髓损伤组织的免疫和炎症水平，这些生物标志物都影响抗原处理和呈递[35]。S100A9蛋白与特定细胞质囊泡相关，可能通过内质溶酶体途径分泌[36]。CYP1B1在电子转移和氧化还原反应中起重要作用[37-39]，并与活性氧、NADPH和S100A9关系密切[40]。S100A9蛋白促进N1中性粒细胞的趋化和酶活性，这些细胞的特征是NADPH氧化酶亚基表达增加[41]。赖氨酸甲基转移酶2C通过调节组蛋白影响基因转录，同时也影响S100A9的分泌[42]。
此次研究采用先进的生物信息学技术，构建了一个包含6个关键mRNA、8个重要miRNA和50个lncRNA的复杂相互作用网络。例如，S100A9-hsa-miR-16-5p-HCG18这一ceRNA网络在脊髓损伤中显示出潜在重要作用。hsa-miR-16-5p是一种广泛研究的miRNA，通过靶向白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎症相关基因抑制炎症反应，并通过靶向BCL2等抗凋亡基因促进细胞凋亡[43-45]。HCG18是一种长链非编码RNA，通过ceRNA机制与hsa-miR-16-5p结合[46-47]，减轻其对S100A9的抑制，从而提高S100A9的表达。S100A9的上调通过激活TLR4-NF-κB信号通路，促进炎症因子的释放，增强炎症反应，并影响细胞内的氧化还原状态，进而影响细胞存活和凋亡。因此，这一网络调控机制在脊髓损伤中可能会加剧炎症反应和氧化应激，从而影响损伤修复过程，为临床提供了新的研究视角和靶点。对比以往研究，此次研究揭示的关系对在疾病中的作用尚未有文献报道，这一发现填补了现有研究的空白，并为脊髓损伤治疗开辟了新的探索途径。作者计划在未来的实验研究中严格验证这一网络，以确保其在脊髓损伤治疗中的应用价值，从而为脊髓损伤的精准医疗开辟新道路。
基于富集分析结果，此次研究发现了生物标记物在氧化磷酸化、神经营养因子信号通路、抗氧化活性和炎症反应等氧化应激相关通路中的显著富集，这些通路在脊髓损伤后的生物学响应中起着关键作用。氧化磷酸化是线粒体内产生ATP的关键过程，脊髓损伤后线粒体功能障碍可能导致活性氧过度产生，加剧氧化应激，损伤神经细胞的存活和功能[48]。此次研究结果表明，氧化磷酸化通路中相关基因的表达显著变化，提示氧化应激通过影响能量代谢和线粒体功能在脊髓损伤病理过程中发挥重要作用。此外，神经营养因子信号通路在神经细胞的生存和再生中起重要作用[49]。此次实验结果显示，脊髓损伤后该通路中的关键基因出现显著调控变化，表明氧化应激可能通过此途径影响修复过程。抗氧化酶系统是细胞抵御氧化应激的主要防线，通过清除活性氧保护细胞免受氧化损伤[50]。富集分析结果显示，脊髓损伤后抗氧化酶基因的表达发生显著变化，提示这些基因在应对脊髓损伤引发的氧化应激中发挥重要作用，进一步研究这些基因的调控机制，有望为脊髓损伤的治疗提供新的策略。综上所述，富集分析结果揭示了脊髓损伤后氧化应激反应的分子基础，指出了关键通路和基因的作用，并为未来治疗提供了潜在靶点。进一步的功能和机制研究将有助于深入了解这些通路和基因的具体作用，推动脊髓损伤治疗研究的发展。
为了更准确地评估免疫细胞浸润对脊髓损伤的影响，作者使用RNA转录本相对子集的细胞类型鉴定法分析评估了组织表达谱中的免疫细胞浸润，发现浆细胞、T细胞CD8、初级T细胞CD4、记忆休息T细胞CD4、记忆活化T细胞CD4、γδ T细胞、静息自然杀伤细胞、巨噬细胞M0和静息树突状细胞的浸润水平显著(adj.P < 0.05)不同，这暗示了它们与脊髓损伤的发生和进展有关。T淋巴细胞在脊髓损伤中被激活，并在神经炎症、神经退行性和修复的下游级联中发挥重要作用[51]。在脊髓损伤期间，促炎细胞(Th1和Th17)与抗炎细胞(Th2和调节性T细胞)之间的平衡被破坏，导致自适应免疫反应偏向促炎Th1和Th17表型，进而释放许多炎症因子，如干扰素γ、肿瘤坏死因子β和白细胞介素17[23，52-53]，这导致了Fas介导的细胞凋亡增强[54]。此外，这两种细胞通过B淋巴细胞促进自身抗体的合成和释放，进一步促进神经元的髓鞘脱失和轴突损伤[23，54]。自然杀伤细胞是对各种入侵者，包括病毒和细菌抗原的第一道防线[55]，其特征是具有高细胞毒潜力、迅速激活、细胞因子分泌和对其他与适应性免疫有关的免疫活跃细胞的重要调节效应[56]。已经证明，在脊髓损伤后的24 h内自然杀伤细胞被激活[57]，并且还有报道称，脊髓损伤患者在脊髓损伤后的第2周到30年后仍然存在自然杀伤细胞缺陷[58-60]。巨噬细胞和树突状细胞也被认为可能参与脊髓损伤的过程[61]。在病理学上，在脊髓损伤后，血脊髓屏障的破裂导致许多外周巨噬细胞渗入受伤区域并在新生血管周围积聚[62]。此外，巨噬细胞专门用于识别、吞噬和降解病原体、凋亡细胞和组织碎[63]。
槲皮素(DB04216)是一种广泛分布于植物中的黄酮醇，具有抗氧化作用。研究发现，槲皮素通过抑制M1型巨噬细胞/微胶质极化[64]，从而减少炎性递质的释放，有助于减轻脊髓损伤过程中的炎症反应，因此可能是脊髓损伤治疗的潜在靶点。此外，在脊髓损伤模型中，槲皮素能显著下调 Id2 和转铁蛋白的表达，同时显著上调 GPX4 和 PTGS2 的表达，从而可通过抑制Id2/转铁蛋白通路防止胶质细胞前体细胞的铁突变[65]，也可通过减少神经细胞凋亡和促进神经再生，对脊髓损伤后神经保护有一定的促进作用[66]。另外，银杏叶提取物(DB01381)具有抗氧化和抗炎作用，能够减少自由基的产生和神经细胞的氧化损伤，从而有助于保护脊髓损伤过程中的神经元，并能够促进神经再生和修复[67]。
此次研究虽然通过生物信息学分析揭示了潜在的治疗药物，但仍存在若干局限性：首先，研究基于血清样本，缺乏直接的脊髓组织数据，尽管收集的血清样本为急性期脊髓损伤且和数据库病程一致，但这些血清样本的采集时间可能存在不一致，从而会造成样本间的差异性，最终可能影响预测结果的准确性；其次，预测的药物作用尚未经过动物模型或临床试验的验证，其临床应用性尚待评估。最近的研究表明，氧化应激相关基因在脊髓损伤的不同阶段具有不同的表达模式，一些基因在急性期和亚急性期可能持续表达，作为氧化应激的关键调节因子[68]。脊髓损伤早期的氧化应激反应往往更加剧烈，而氧化应激产物的浓度与其生物效应之间存在着剂量依赖关系。研究显示，低水平的氧化应激能够为受损组织和细胞提供一定的保护作用，促进修复和再生[69]。然而，高水平的氧化应激会通过多种机制导致炎症事件加剧和细胞死亡[70-71]，例如介导炎性小体激活、靶向IκB的降解以及核因子κB易位到细胞核并激活炎症[70-72]。炎症细胞可以释放肿瘤坏死因子并诱导线粒体活性氧生成，反过来，通过上调诱导型一氧化氮合酶、NADPH氧化酶和其他酶的表达导致分泌更多的活性氧[73]，导致损伤进一步加重。这种动态变化提示未来需要在研究设计中纳入更多的采样时间点，以捕捉氧化应激在脊髓损伤发展过程中的复杂变化和机制。研究显示，中国患者在脊髓损伤后早期的氧化应激反应尤为强烈。中国人口密度较大，工业化和城市化水平较高，空气污染和生活方式的改变可能导致基线氧化应激水平较高[74]。因此，脊髓损伤后，活性氧的产生可能会更迅速和更强烈,这与作者通过生物信息学筛选出的关键基因在氧化应激和炎症中的重要作用一致。此外，中国人群中存在的特定基因多态性可能会进一步影响脊髓损伤后的恢复能力和对氧化应激的反应。例如，超氧化物歧化酶2在中国人群中具有较高的携带率，影响了超氧化物歧化酶的抗氧化能力，从而加剧了脊髓损伤后的氧化应激反应[75]。谷胱甘肽过氧化物酶1基因中的Pro198Leu多态性(rs1050450)已被证实在中国人群中与抗氧化防御机制减弱有关，这可能导致脊髓损伤后氧化应激的加剧[76]。尽管此次研究的数据库样本主体为美国人群，但作者采集了中国人群的样本进行了RT-qPCR验证，且多数基因的验证结果呈现阳性，这一发现预示着此次研究成果可能具备一定的普遍适用性。然而，值得注意的是，仍有部分基因在两组样本间未展现出显著差异，这可能反映了样本间的差异性。因此，为了更全面地验证这些结果的可靠性，未来研究需进一步扩大样本的地理分布和人群多样性，获取更多具有代表性的脊髓组织样本，并开展多中心临床试验，以确保研究结论的广泛适用性和准确性。同时，也需要进一步的动物模型等实验研究和多中心临床试验来验证这些药物在脊髓损伤治疗中的实际效果。这些努力旨在提高研究可信度，并为脊髓损伤治疗提供更强的科学依据和新的策略。
结论：此次研究采用LASSO logistic回归和SVM-RFE算法等先进技术，成功识别了与氧化应激相关的生物标志物，并运用RNA转录本相对子集的细胞类型鉴定法分析了免疫细胞浸润情况。通过构建ceRNA网络，深入探讨了S100A9、PLAU、CASP4、GAPDH、CYP1B1、HSPA1B这6个关键生物标志物在脊髓损伤中的作用及其与氧化应激和免疫炎症的关系。特别地，S100A9可能通过TLR4信号途径影响氧化应激，PLAU参与细胞迁移和组织重塑，而HSPA1B则可能是免疫调节的关键分子。RNA转录本相对子集的细胞类型鉴定分析揭示了脊髓损伤组织中免疫细胞浸润的多样性。此外，从DrugBank数据库中筛选出100种靶向这些标志物的药物，为脊髓损伤的治疗提供了新思路。此次研究为理解脊髓损伤的病理机制、制定治疗策略提供了重要信息，并为未来研究奠定了坚实基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脊髓损伤后氧化应激相关基因及分子机制：基于GEO数据库的数据分析及验证

Oxidative stress-related genes and molecular mechanisms after spinal cord injury: data analysis and verification based on GEO database

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