痛安汤对膝骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞极化的作用机制

doi:10.12307/2025.727

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5621-5631.doi: 10.12307/2025.727

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

痛安汤对膝骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞极化的作用机制

陈一鑫，陆延，张璇，陈小莉，谭良源，徐张杰，陈望龙，苏少亭，梁基耀，周红海

1广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药防治医学分子生物重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530023；3广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；4广西生物力学与损伤修复重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530200；5广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2024-06-03 接受日期:2024-08-27 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-26
通讯作者: 周红海，博士，教授，广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；广西生物力学与损伤修复重点实验室，广西壮族自治区南宁市530200 共同通讯作者：陆延，博士，副教授，广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；广西生物力学与损伤修复重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530200
作者简介:陈一鑫，男，广西壮族自治区灵山县人，壮族，2015年广西中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事四肢关节及脊柱退行性疾病的中医药防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82460939)，项目名称：基于“六不通”理论探讨GSK-3β/Nrf2/GPX4信号轴介导的膝骨关节炎软骨细胞铁死亡机制及痛安汤干预的效应研究，项目负责人：周红海；广西研究生教育创新计划项目(YCBZ2023153)，项目负责人：陈一鑫；广西中医药大学引进博士科研启动基金项目(2022BS012)，项目负责人：陆延；国医大师韦贵康学术思想与临床诊疗传承发展研究(2022V001)，项目负责人：周红海；广西自然科学基金项目(2021GXNSFAA196033)，项目负责人：张璇

Mechanism by which Tongan Decoction regulates synovial macrophage polarization in rats with knee osteoarthritis

Chen Yixin1, 2, Lu Yan3, 4, Zhang Xuan3, Chen Xiaoli5, Tan Liangyuan3, Xu Zhangjie1, Chen Wanglong1, Su Shaoting3, Liang Jiyao3, #br# Zhou Honghai3, 4

1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Molecular Biology of Traditional Chinese Medicine and Preventive Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 4Guangxi Key Laboratory of Biomechanics and Injury Repair in Traditional Chinese Medicine Orthopedics and Traumatology, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 5Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-06-03 Accepted:2024-08-27 Online:2025-09-18 Published:2025-02-26
Contact: Zhou Honghai, MD, Professor, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Biomechanics and Injury Repair in Traditional Chinese Medicine Orthopedics and Traumatology, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Co-corresponding author: Lu Yan, MD, Professor, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Biomechanics and Injury Repair in Traditional Chinese Medicine Orthopedics and Traumatology, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Yixin, MS, Attending physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Molecular Biology of Traditional Chinese Medicine and Preventive Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82460939 (to ZHH); Guangxi Postgraduate Education Innovation Program, No. YCBZ2023153 (to CYX); Guangxi University of Chinese Medicine Introducing Doctoral Research Initiation Fund, No. 2022BS012 (to LY); Research on the Academic Thought and Clinical Diagnosis and Treatment Inheritance and Development of Wei Guikang, Master of National Medical Science, No. 2022V001 (to ZHH); Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2021GXNSFAA196033 (to ZX)
How to cite this article: Chen Yx, Lu Y, Zhang X, Chen Xl, Tan Ly, Xu Zj, Chen Wl

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
巨噬细胞极化：巨噬细胞受到外界刺激后表现出特定功能表型(促炎性M1型巨噬细胞、抗炎性M2型巨噬细胞)，这种对遇到的微环境刺激和信号做出反应的过程称为巨噬细胞极化。M1巨噬细胞分泌白细胞介素1β等促炎细胞因子，M2巨噬细胞分泌白细胞介素10等抗炎细胞因子。
高通量测序：能同时检测多条序列，机制是：将DNA随机打断成无数小片段(250-300 bp)，通过建库把这些DNA片段富集起来，然后放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段独立附着的区域，可以一次检测所有附着的DNA序列，最后将小片段拼接成长片段。高通量测序的特点是一次能够检测大量序列，显著提高了测序效率。

背景：国医大师韦贵康所创痛安汤治疗膝骨关节炎的疗效显著，但作用机制尚不明确。
目的：探讨痛安汤通过调控大鼠滑膜巨噬细胞极化治疗膝骨关节炎的作用机制。
方法：①通过miRNA高通量测序与PCR分析正常大鼠与膝骨关节炎大鼠膝关节滑膜组织中差异miRNA表达，通过数据库预测miR-27a靶基因，采用荧光素酶实验检测miR-27a与靶基因结合情况。②采用随机数字表法将68只SD大鼠随机分为正常对照组(n=16)、模型组(n=16)、miR-27a过表达组(n=12)、痛安汤组(n=12)、痛安汤+miR-27a抑制组(n=12)。除正常对照组外，其他4组通过膝关节腔注射碘乙酸钠的方法建立右侧膝骨关节炎模型，造模后第2天，miR-27a过表达组、痛安汤+miR-27a抑制组右侧膝关节腔内分别注射
miR-27a模拟物、miR-27a抑制物，1次/d，连续注射5 d；造模后第15天，痛安汤组、痛安汤+miR-27a抑制组给予痛安汤灌胃，其他3组给予生理盐水灌胃，1次/d，连续14 d。灌胃干预结束后，分别进行行为学检测、X射线片检查、膝关节滑膜组织与软骨组织苏木精-伊红染色以及膝关节滑膜组织的免疫荧光染色、RT-PCR、Western blot检测。
结果与结论：①miRNA高通量测序显示膝骨关节炎大鼠滑膜组织中miR-27a低表达，miR-27a的靶基因为核因子κB，荧光素酶实验显示二者能够相互结合。②行为学检测显示，miR-27a过表达或痛安汤可缓解膝骨关节炎大鼠的关节功能障碍，miR-27a抑制可拮抗痛安汤的作用。X射线片与苏木精-伊红染色结果显示，miR-27a过表达或痛安汤可减轻膝骨关节炎程度，miR-27a抑制削弱了痛安汤的治疗作用。RT-PCR与Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，模型组白细胞介素10表达均降低(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13、白细胞介素1β、核因子κB表达均升高(P < 0.05)；miR-27a过表达或痛安汤可不同程度地逆转膝骨关节炎造模导致的上述指标变化，而miR-27a抑制会削弱痛安汤的作用。免疫荧光染色结果显示，模型组CD86蛋白表达高于正常对照组(P < 0.05)，CD206蛋白表达低于正常对照组(P < 0.05)；miR-27a过表达组、痛安汤组CD86蛋白表达低于模型组(P < 0.05)，CD206蛋白表达高于模型组(P < 0.05)；痛安汤+miR-27a抑制组CD86高于痛安汤组(P < 0.05)，CD206蛋白表达低于痛安汤组(P < 0.05)。③结果表明，痛安汤通过促进miR-27a表达、抑制核因子κB表达来调控巨噬细胞极化，改善膝关节功能，进一步治疗膝骨关节炎。
https://orcid.org/0009-0006-6968-5118(陈一鑫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, 巨噬细胞极化, 滑膜炎, 微小RNA, 痛安汤, 碘乙酸钠, 核因子κB, 高通量测序, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Developed by the esteemed Chinese medicine master Wei Guikang, Tongan Decoction has proven highly effective in treating knee osteoarthritis. However, the mechanism of action is yet unclear.
OBJECTIVE: To elucidate how Tongan Decoction modulates synovial macrophage polarization as a therapeutic strategy for knee osteoarthritis in a rat model.
METHODS: (1) We employed high-throughput microRNA sequencing and polymerase chain reaction to analyze the differentially expressed miRNA in synovial macrophages of normal and knee osteoarthritis rats. Predicted target genes of miR-27a were identified using bioinformatics databases, with subsequent validation through luciferase assays. A total of 68 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (n=16), model group (n=16), miR-27a overexpression group (n=12), Tongan Decoction group (n=12), and Tongan Decoction+miR-27a inhibition group (n=12). The miR-27a overexpression group and the Tongan Decoction+miR-27a inhibition group were injected with miR-27a mimic and miR-27a inhibitor in the right knee joint cavity, respectively, once daily for 5 continuous days. On the 15th day after modeling, the Tongan Decoction group and the Tongan Decoction+miR-27a inhibition group were given Tongan Decoction by gastric lavage, and the other three groups were given saline by gastric lavage, once daily for 14 continuous days. After administration, behavioral tests, X-rays, hematoxylin-eosin staining of synovial and cartilage tissues of the knee joint and immunofluorescence staining of synovial tissues of the knee joint, RT-PCR, and Western blot were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: High-throughput sequencing of miRNA showed low expression of miR-27a in synovial tissues of rats with knee osteoarthritis. The target gene of miR-27a was nuclear factor κB, and luciferase assay showed that the two could bind to each other. Behavioral assays showed that miR-27a overexpression or Tongan Decoction alleviated joint dysfunction in rats with knee osteoarthritis, and miR-27a inhibition antagonized the effect of Tongan Decoction. X-ray films and hematoxylin-eosin staining showed that miR-27a overexpression or Tongan Decoction reduced the degree of knee osteoarthritis and miR-27a inhibition weakened the therapeutic effect of Tongan Decoction. The results of RT-PCR and western blot assay showed that compared with the normal control group, the expression of interleukin 10 was reduced in the model group (P < 0.05), and the expression of matrix metalloproteinase 13, interleukin 1β, and nuclear factor κB was elevated in the model group (P < 0.05). miR-27a overexpression or Tongan Decoction could differently reverse the changes in the above-mentioned indexes, while miR-27a inhibition weakened the effect of Tongan Decoction. Immunofluorescence staining results showed that CD86 protein expression in the model group was higher than that in the normal control group (P < 0.05), and CD206 protein expression was lower than that in the normal control group (P < 0.05); miR-27a overexpression group and Tongan Decoction had lower CD86 protein expression than that in the model group (P < 0.05), and higher CD206 protein expression than that in the model group (P < 0.05); in the Tongan Decoction+miR-27a inhibition group, CD86 protein expression was higher (P < 0.05) and CD206 protein expression was lower than that in the Tongan Decoction group (P < 0.05). Tongan Decoction mitigates knee osteoarthritis by upregulating miR-27a expression and suppressing nuclear factor κB activity, which improves knee joint function and further treats knee osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: knee osteoarthritis, macrophage polarization, synovitis, microRNAs, Tongan Decoction, iodoacetic acid, nuclear factor κB, high-throughput sequencing, engineered tissue construction

中图分类号:

陈一鑫, 陆延, 张璇, 陈小莉, 谭良源, 徐张杰, 陈望龙, 苏少亭, 梁基耀, 周红海. 痛安汤对膝骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞极化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5621-5631.

Chen Yixin, Lu Yan, Zhang Xuan, Chen Xiaoli, Tan Liangyuan, Xu Zhangjie, Chen Wanglong, Su Shaoting, Liang Jiyao, Zhou Honghai. Mechanism by which Tongan Decoction regulates synovial macrophage polarization in rats with knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5621-5631.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 68只SD大鼠全部进入结果分析。
2.2 miR-27a在膝骨关节炎模型中低表达并与Lequesne评分负相关模型组大鼠右侧膝关节滑膜组织大体观，见图1A。主成分分析显示模型组和正常对照组的样本分散，两组之间差异明显(图1B)。以校正P < 0.05和log2 FC的绝对值> 1为标准筛选差异基因，经过分析总共筛选出235个差异基因，其中下调最显著的基因为miR-27a(图1C)，并且RT-PCR检测结果证实模型组大鼠右侧膝关节滑膜组织中miR-27a表达低于正常对照组(P < 0.001)，见图1D。Lequesne行为学评分明显高于正常对照组(P < 0.001)，见图1E。Pearson分析结果显示miR-27a与Lequesne行为学评分负相关(OR=-0.701，P=0.003)，见图1F。
2.3 核因子κB是miR-27a的靶基因且两者相关影响 miR-27a与核因子κB具有结合区域(图2A)，双荧光素酶活性实验验证两者的结合关系，在转染miR-27a野生型细胞中，核因子κB过表达组荧光素酶活性低于阴性对照组(图2B)，可见miR-27a与核因子κB具有结合作用。

2.4 痛安汤介导miR-27a/核因子κB信号通路调控滑膜巨噬细胞极化治疗膝骨关节炎的机制
2.4.1 行为学及巨噬细胞极化相关因子表达检测结果 Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，模型组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β蛋白表达均升高(P < 0.001)，白细胞介素10蛋白表达降低(P < 0.001)；与模型组比较，miR-27a过表达组、痛安汤组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β蛋白表达均降低(P < 005或P < 0.01或P < 0.001)，白细胞介素10蛋白表达升高(P < 0.05或P < 0.001)；与痛安汤组比较，痛安汤+miR-27a抑制组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β蛋白表达均升高(P < 0.05或P < 0.01)，白细胞介素10蛋白表达降低(P < 0.05)，见图3A，B。
模型组大鼠右下肢Lequesne评分高于正常对照组(P < 0.001)，miR-27a过表达组、痛安汤组大鼠右下肢Lequesne评分均低于模型组(P < 0.01，P < 0.05)，痛安汤+miR-27a抑制组大鼠右下肢Lequesne评分高于痛安汤组(P < 0.05)，见图3C。

RT-PCR检测结果显示，与正常对照组比较，模型组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β mRNA表达均升高(P < 0.01或P < 0.001)，miR-27a、白细胞介素10 mRNA表达均降低(P < 0.01，P < 0.001)；与模型组比较，miR-27a过表达组、痛安汤组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β mRNA表达均降低(P < 005或P < 0.01或P < 0.001)，miR-27a、白细胞介素10 mRNA表达均升高(P < 0.05或P < 0.01)；与痛安汤组比较，痛安汤+miR-27a抑制组基质金属蛋白酶13、核因子κB、白细胞介素1β mRNA表达均升高(P < 0.05)，miR-27a、白细胞介素10 mRNA表达均降低(P < 0.01，P < 0.05)，见图3D-H。
结果表明，痛安汤调控巨噬细胞极化相关因子白细胞介素10、白细胞介素1β、核因子κB、基质金属蛋白酶13依赖miR-27a。
2.4.2 右膝关节X射线片检查结果各组大鼠右膝关节X射线片见图4。正常对照组大鼠膝关节面光滑，间隙无狭窄，无骨赘增生；模型组大鼠膝关节面粗糙、不平整，关节间隙狭窄，关节边缘骨赘增生，符合膝骨关节炎改变特征；miR-27a过表达组及痛安汤组大鼠膝关节面平较光滑、轻度粗糙，关节边缘骨赘轻度增生；痛安汤+miR-27a抑制组大鼠膝关节面较为粗糙、欠平整，关节边缘骨赘轻度增生；造模4组大鼠膝关节间隙狭窄情况无明显差异。

2.4.3 右膝关节滑膜组织苏木精-伊红染色结果各组大鼠右膝关节滑膜组织苏木精-伊红染色结果，见图5。正常对照组滑膜组织中成纤维细胞形态分布均匀、排列整齐且薄，无增生的血管及炎症细胞；模型组滑膜组织中成纤维细胞增多，细胞形态不均匀、排列紊乱，血管增生，散在较多炎性细胞浸润；miR-27a过表达组滑膜滑膜组织中成纤维细胞稍有增多，形态较为均匀，可见极少量炎性细胞浸润与血管增生；痛安汤组滑膜组织中成纤维细胞少量增加，小部分细胞形态不均匀，可见少量炎性细胞浸润；痛安汤+miR-27a抑制组滑膜组织中成纤维细胞增加，大部分细胞形态不均匀，可见较多炎性细胞浸润与少量血管增生。

2.4.4 右膝关节软骨组织苏木精-伊红染色各组大鼠右膝关节软骨组织苏木精-伊红染色结果，见图6。正常对照组软骨表面光滑，细胞排列整齐分布均匀、形态规则，基质染色均匀，潮线清晰完整；模型组软骨表面不平整，细胞数量明显减少且排列紊乱、形态不规则，基质染色重度减少，潮线不整齐或中断；miR-27a过表达组软骨表面尚光滑，细胞数量减少、形态欠规则，基质染色轻度减少，潮线完整；痛安汤组软骨表面尚光滑，细胞数量

轻度减少、形态欠规则，基质染色轻度减少，潮线尚完整；痛安汤+miR-27a抑制组软骨表面不光滑，软骨细胞减少、形态不规则，基质染色中度减少，潮线欠完整。
2.4.5 右膝关节滑膜组织巨噬细胞免疫荧光染色结果
巨噬细胞M1疫荧光染色结果：CD86是巨噬细胞M1极化的免疫荧光标志物。各组大鼠右膝关节滑膜组织巨噬细胞M1免疫荧光染色结果，见图7。模型组CD86免疫荧光共染阳性表达高于正常对照组、miR-27a过表达组、痛安汤组，痛安汤+miR-27a抑制组CD86免疫荧光共染阳性表达高于高于痛安汤组。结果表明痛安汤调控巨噬细胞M1极化依赖miR-27a。
巨噬细胞M2免疫荧光染色结果：CD206是巨噬细胞M2极化的免疫荧光标志物。各组大鼠右膝关节滑膜组织巨噬细胞M2免疫荧光染色结果，见图8。模型组CD206免疫荧光共染阳性表达低于正常对照组、miR-27a过表达组、痛安汤组，痛安汤+miR-27a抑制组CD206免疫荧光共染阳性表达低于痛安汤组。结果表明痛安汤调控巨噬细胞M2极化依赖miR-27a。
M1/M0和M2/M0巨噬细胞平均吸光度值比较结果：各组大鼠膝关节滑膜组织M1/M0和M2/M0巨噬细胞平均吸光度值比较，见图9。模型组M1/M0巨噬细胞平均

吸光度值明显高于正常对照组(P < 0.001)，miR-27a过表达组、痛安汤组M1/M0巨噬细胞平均吸光度值均低于模型组(P < 0.001，P < 0.05)，痛安汤+miR-27a抑制组M1/M0巨噬细胞平均吸光度值高于痛安汤组(P < 0.05)。模型组M2/M0巨噬细胞平均吸光度值明显低于正常对照组(P < 0.001)，miR-27a过表达组、痛安汤组M2/M0巨噬细胞平均吸光度值均高于模型组(P均< 0.05)，痛安汤+

miR-27a抑制组M2/M0巨噬细胞平均吸光度值低于痛安汤组(P < 0.05)。结果表明痛安汤通过miR-27a调控巨噬细胞极化。

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引言

膝骨关节炎是一种发病率较高的慢性退行性疾病，多发生于中老年人群[1]，早期常出现关节疼痛、肿胀、僵硬等症状，随着病情加重出现关节活动受限、畸形、行走困难，最后导致残疾，严重影响患者的生活质量[2-4]。目前的研究尚不能完全阐明膝骨关节炎的病理生理机制，从而限制了有效药物或治疗手段的研发。中医认为膝骨关节炎属于“痹证”，“虚、邪、瘀”是其主要病因病机，国医大师韦贵康认为“不通”是膝骨关节炎发病基础，治疗以“六通”(正则通、动则通、顺则通、松则通、调则通、荣则通)论证。国医大师韦贵康所创经验方痛安汤具有活血化瘀、通利筋脉、理气定痛功效[5]，治疗膝骨关节炎的临床疗效显著[6]，但作用机制尚不明确。
近期《Cell》《Nature》等权威杂志刊登指出微小RNA(microRNA，miRNA)是疾病治疗的重要靶点[7-8]。因此，此次研究通过高通量测序筛选出膝骨关节炎差异性表达miRNA，其中miR-27a的差异表达较明显，查阅相关文献进一步寻找与骨关节炎相关的miRNA，发现miR-27a能够调控骨关节炎滑膜炎症[9]。滑膜炎症是骨关节炎发病机制中的一个关键因素，与软骨退化、临床症状、放射学分级和活动功能密切相关[10]。巨噬细胞是滑膜组织主要的免疫细胞，是调控骨关节炎炎症状态的关键细胞[11]，当巨噬细胞被激活和极化为M1型后可产生细胞因子和趋化因子，导致关节滑膜炎症反应并促进软骨基质降解、破坏[12]。研究证实，可以通过调控miR-27a表达促使巨噬细胞向不同方向极化来调节免疫反应[13]。因此，课题以 miR-27a为骨关节炎的研究靶标，寻找miR-27a的目的基因，分析其与滑膜巨噬细胞极化的关系，研究痛安汤对骨关节炎模型大鼠滑膜组织miR-27a及其靶基因的作用，明确痛安汤调控骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞极化抑制滑膜炎症是否与miR-27a有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法检验。
1.2 时间及地点实验于2023年5月至2024年2月在广西中医药大学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性SD大鼠68只，8周龄，SPF级，体质量(280±6) g，从长沙市天勤生物技术有限公司购入，许可证号：SCXK(湘)2022-001。饲养环境：每笼两三只，饲养房间温度设置为23-25 ℃，湿度为(55±10)%，环境干净清洁，通风好，白昼/黑夜=1/1循环，自由进食及饮水。大鼠适应性饲养7 d后再进行实验。
实验方案已获得广西中医药大学实验动物福利伦理委员会批准(批准号为：DW20230830-144)。大鼠均在麻醉下进行造模及取材。实验过程按照《关于动物伦理与福利的作者指南共识》相关意见来对待动物。
1.3.2 主要药物及试剂痛安汤(丹参18 g、两面针12 g、白芍12 g、煅龙骨15 g、三七9 g、降香9 g、炙甘草5 g)饮片由广西中医药大学第一附属医院药房购进，经广西中医药大学第一附属医院药剂科鉴定合格；痛安汤药液由广西中医药大学第一附属医院中药制剂室制备，煎煮方法：将痛安汤药材先清水浸泡30 min，大火煮沸后文火煎煮30 min，煎成生药量为1 g/mL的药液，放入冰箱冷藏备用。以人和动物体表面积折算等效剂量比值表方法换算，经过换算后以6.25 g/kg 剂量进行痛安汤灌胃。
碘乙酸钠(12512，美国 Sigma 公司)；Trizol(15596026，北京索莱宝公司)；CD86抗体、白细胞介素1β抗体(K010082P、K009661P，北京索莱宝公司)；CD206抗体、F4/80抗体、基质金属蛋白酶13抗体、核因子κB p65抗体(AG2660、AG4753、AF7479、AN365，上海碧云天生物技术有限公司)；白细胞介素10抗体(PAA056Ra01，武汉博士德生物工程有限公司)；异氟烷(R510-22-10，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(C0105S，上海碧云天生物技术有限公司)；PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047Q，日本Takara)；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(638313，美国Clontech)；TaqMan™ MicroRNA Assay(4440888，美国Thermo Fisher Scientific)；miR-27a模拟物、miR-27a抑制物(北京博奥森生物技术有限公司)。
1.3.3 主要仪器 50 µL HAMILTON汉密尔顿微量注射器；动物用便携式X光诊断设备(型号：HF400VA，日本米卡萨X光股份有限公司)；实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480® Ⅱ，罗氏公司)；荧光扫描分析仪(型号4000MM Pro，Carestream)；全自动石蜡切片机、组织包埋机(型号：HM355S、Histocentre3，赛默飞世尔)；通用水平电泳槽、通用电泳仪、凝胶成像系统(型号：Sub-Cell GT、PowerPac Universal、GelDoc XR+，美国伯乐)；荧光显微镜(型号：BX53，奥林巴斯)；小动物专用麻醉机(型号：CDS9000，美国Harvard)。
1.4 方法
1.4.1 实验分组及干预采用随机数字表法将68只SD大鼠随机分为正常对照组(n=16)、模型组(n=16)、miR-27a过表达组(n=12)、痛安汤组(n=12)、痛安汤+miR-27a抑制组(n=12)。除正常对照组外，其他4组通过膝关节腔注射碘乙酸钠的方法建立右侧膝骨关节炎模型。造模后第2天，miR-27a过表达组、痛安汤+miR-27a抑制组右侧膝关节腔内分别注射5 μL的miR-27a模拟物、miR-27a抑制物(20 μmol/L)，1次/d，连续注射5 d；造模后第15天，痛安汤组、痛安汤+miR-27a抑制组给予6.25 g/kg痛安汤灌胃，其他3组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续14 d。
1.4.2 膝骨关节炎模型的制备结合文献[14]及前期预实验，碘乙酸钠膝关节腔注射造模更适合膝骨关节炎滑膜病理生理学研究，因此，此次实验采用碘乙酸钠膝关节腔注射方法构建膝骨关节炎模型。大鼠造模前12 h禁食，置入气体麻醉专用塑料盒，2%-3%浓度异氟烷气体麻醉后对大鼠右膝进行脱毛处理，将大鼠仰卧位固定于操作台上，体积分数75%乙醇消毒，使右膝屈曲90°，以髌韧带中点为进针点，进针角度与胫骨平台面平行，针下有落空感且回抽无血时证明穿刺成功，用汉密尔顿微量注射器将碘乙酸钠(1 mg 碘乙酸钠溶于30 μL生理盐水)注入大鼠膝关节腔，注射完后缓慢出针，棉球按压2 min止血，屈伸活动大鼠膝关节使药物均匀浸润完整个关节腔。正常对照组大鼠右膝关节腔注射30 μL生理盐水。
造模14 d后，随机选取模型组及正常对照组各4只大鼠，在气体麻醉下进行右膝正侧位X射线片检查，若膝关节内侧间隙狭窄、模糊，膝关节表面欠光滑，证明膝骨关节炎造模成功[15]。

1.4.3 取材造模14 d后，对正常对照组、模型组大鼠进行右下肢Lequesne评分(行为学检测)。评分完成后，随机选择正常对照组、模型组大鼠各4只，气体麻醉后处死，取右侧膝关节滑膜组织，分别进行miRNA芯片测序分析、RT-PCR检测miR-27a的表达。
药物灌胃结束后次日，对5组大鼠进行右下肢Lequesne行为学评分。行为学评分完成后进行右下肢X射线片检查。5组完成X射线片检查后，快速去除右膝关节周围肌肉及皮肤，用手术刀片于膝关节髌骨两侧、股骨下端切开关节囊，有齿镊钳夹髌骨上端向下翻开，使关节腔充分暴露，使用手术刀片切断髌韧带近端，翻开髌韧带及髌骨，即可充分暴露滑膜组织(微黄色半透明的薄膜组织)，使用手术刀片轻轻分离，同时沿关节囊股骨边缘环形切开关节取出股骨髁软骨。每组取4只大鼠的软骨和滑膜组织，用多聚甲醛固定液固定24 h，软骨组织用清水洗涤后放入10% EDTA溶液脱钙2周(每3 d更换脱钙液)，石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色与免疫荧光染色；将每组剩余8只大鼠的滑膜组织快速放入液氮中，然后转移至-80 ℃冰箱保存，RT-PCR检测miR-27a、核因子κB、白细胞介素10、白细胞介素1β与基质金属蛋白酶13 mRNA表达，Western blot检测核因子κB、白细胞介素10、白细胞介素1β与基质金属蛋白酶13蛋白表达。
1.4.4 miRNA 的芯片测序分析将右膝关节滑膜组织打磨成浆，运用TRizol液从滑膜组织中提取RNA，检测待测样本合格后制备文库，并且检测文库质量，采取荧光标记引物以扩增，将磁珠与双链PCR产物结合变性，采用IllumiCode序列测序。使用htseq-count软件剔除比对质量低于10的reads RNA，即可得到最终RNA，最后核算RNA的count矩阵，过滤掉在大多数组织中不表达的RNA并进行标准化处理，然后进行最终的数据分析。
1.4.5 目标 miRNA 靶基因预测运用miRDB数据库(http://www.mirdb.org/)联合TargetScan数据库(http://www.targetscan.org/mamm_31/)预测miR-27a的靶基因。
1.4.6 荧光素酶报告基因检测采用HEK293T细胞进行荧光素酶活性检测miR-27a与核因子κB的关系，运用psi-CHECK2载体构建突变质粒或者野生型荧光素酶报告基因，运用Invitrogen(Lipofectamine 2000)将荧光素酶载体(pcDNA3.1-核因子κB)和miR-27a阴性对照、过表达共转染至HEK293T细胞中，然后加入10 ng的海肾荧光素酶报告基因(对照剂)，48 h后收集细胞，进行细胞裂解后使用荧光素酶报告基因系统测定荧光素酶活性。
1.4.7 膝关节影像学检查药物灌胃结束后次日，5%异氟烷过量吸入麻醉处死大鼠，迅速离断5组大鼠右下肢，行右膝关节正侧位X 射线片检查，参数：电压120 kV，电流100 mA。
1.4.8 行为学评分采用Lequesne评分进行行为学检测。Lequesne评分总分11分，分值越高反映关节炎程度越重、功能障碍越明显。评分标准[16]：①膝关节局部疼痛刺激反应：0分为无异常反应，1分为有患肢收缩反应，2分为患肢收缩痉挛伴有舔吮等轻度全身反应，3分为患肢剧烈反应常伴有异常叫声；②关节活动范围(伸直0°)： 0 分> 90°，1分为> 45°且≤90°，2 分为15°-45°，3分为< 15°；③步行功能：0 分为正常行走，1分为轻度跛行，2分为跛行明显，3分为步行困难不能行走；④关节肿胀：0 分为无肿胀，1 分为轻度肿胀，2分为肿胀明显。
1.4.9 苏木精-伊红染色取膝关节滑膜及软骨组织，石蜡切片(切片厚度均为3 µm)脱蜡后，按顺序于二甲苯 Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇 Ⅰ、二甲苯Ⅱ、不同体积分数乙醇、超纯水中浸泡。用Harris苏木精染液浸染切片，冲洗、分化后返蓝，切片放入伊红染液浸染，最后脱水透明，中性树胶封固，置于显微镜下观察。
1.4.10 Western blot检测取滑膜组织进行研磨，使用RIPA裂解液于冰上裂解15 min，直至组织完全消化，低温离心后取上清(蛋白样品)，检测蛋白浓度。制备10%分离胶，压胶后将梳子置入凝胶，每个泳道加入待测组织蛋白样品，在电压80 V下进行电泳，直至溴酚蓝跑至胶底部；电泳完取出凝胶，将蛋白质转移到PVDF膜上，用TBST洗膜3次，每次10 min；对PVDF膜封闭1 h，分别加入一抗(核因子κB p65、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13、白细胞介素10、GAPDH抗体，稀释比例均为1∶1 000)于4 ℃孵育过夜；第2天收集一抗，用TBST洗膜3次，每次10 min，添加二抗(稀释比例均为1∶5 000)室温下摇晃孵育1 h；用TBST洗膜，重复4次，每次3 min，加入显色剂一起孵育，最后进行胶片显像，利用Image J图像软件检测各条带灰度值。

1.4.11 RT-PCR检测称取0.1 g大鼠滑膜组织进行剪碎研磨，采用Trizol法提取总RNA，使用片段分析仪检测RNA浓度和纯度。按照转录试剂盒要求在65 ℃下将总RNA反转录为cDNA，之后进行模版扩增，扩增按以下进行：95 ℃预变性30 s；95 ℃退火20 s，60 ℃延伸20 s，进行40个循环。最后用标准熔解曲线程序解析。引物序列见表1。

1.4.12 免疫荧光染色将滑膜组织切片(切片厚度均为3 µm)，经脱蜡、抗原修复后，加入柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)孵育，经过2个循环的恒温水浴(每循环包括5 min煮沸和5 min暂停)后，用体积分数10%山羊血清在37 ℃下孵育30 min；在4 ℃下分别加入一抗CD86、CD206、F4/80(稀释均为1∶500)孵育过夜，然后在37 ℃下与带有荧光标记的二抗(1∶2 000)孵育1 h；清洗3遍后用DAPI复染细胞核，封固，巨噬细胞M1型采用F4/80+CD86双染进行定位，巨噬细胞M2型采用F4/80+CD206双染进行定位，置于荧光显微镜获取荧光图像，利用Image J图像软件检测阳性细胞数量，计算F4/80分别与CD86及CD206共染平均吸光度值。

1.5 主要观察指标造模14 d后，正常对照组、模型组大鼠右下肢Lequesne评分、滑膜组织miRNA芯片测序分与miR-27a表达；miR-27a的靶基因预测结果；光素酶实验检测miR-27a与核因子κB的关系；药物灌胃结束后，5组大鼠右下肢Lequesne评分，X射线片，滑膜组织与软骨组织苏木精-伊红染色，滑膜组织CD86、CD206免疫荧光染色，滑膜组织miR-27a、核因子κB、白细胞介素10、白细胞介素1β与基质金属蛋白酶13表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0进行统计分析，计量资料先检测方差，方差齐、符合正态分布用x±s表达，多组比较用单因素方差分析，两组比较用t检验；方差不齐不满足正态分布时，计量资料以中位数、四分位间距来描述，两组比较用Kruskal-Wallis检验。运用Pearson统计法研究miR-27a与Lequesne行为学评分的相关性。P < 0.05判定为差异有显著性意义。统计学方法经广西中医药大学统计学专家审核。

讨论

目前普遍认为膝骨关节炎的主要机制是滑膜炎症、关节软骨降解破坏、软骨下骨硬化塌陷[17]，大多数研究主要集中在软骨退变方面展开，截至目前仍没有一个抑制软骨退变的方案获得临床认可。膝骨关节炎是一个病理机制复杂的疾病，只针对软骨单一处理的方法很难阻止其发展。滑膜炎症在膝骨关节炎发生发展中起着关键作用，其实在膝骨关节炎疾病的进展过程中，甚至在软骨发生退变之前滑膜就已经发生显著变化，这些变化的主要特征是单核细胞浸润和滑膜内层炎症细胞因子的产生[18]。
研究表明，滑膜炎几乎存在于膝骨关节炎发病的所有阶段，并且与患者疼痛症状及关节功能障碍密切相关[19]。此次实验通过碘乙酸钠膝关节腔注射方法制作膝骨关节炎大鼠模型，苏木精-伊红染色病理切片提示除了软骨损伤外，滑膜组织也出现炎症表现，这种炎症主要表现为成纤维细胞增生、表面细胞多层结构、炎性细胞浸润、血管增生及扩张等，这些符合膝骨关节炎的病理改变。
巨噬细胞是滑膜关节内主要的免疫细胞，也是膝骨关节炎病理过程中引起炎症反应的主要先天免疫效应细胞。滑膜巨噬细胞在促炎和抗炎表型之间的转变(巨噬细胞极化)一定程度上决定着膝骨关节炎滑膜炎的发展方向[20]。
在膝骨关节炎中巨噬细胞可分为3种状态：第1种为未激活的巨噬细胞M0，F4/80是其主要标志分子；第2种为M1型巨噬细胞，由辅助性T细胞诱导，CD86是其主要标志分子；第3种为M2型巨噬细胞，由Th2相关细胞因子诱导，CD206是其主要标志分子。M1型巨噬细胞可释放白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等炎性因子起到促炎作用，白细胞介素1β可刺激细胞外基质降解相关酶，如基质金属蛋白酶13的表达，导致软骨降解破坏，从而加快膝骨关节炎的进展 [21]。M2型巨噬细胞通过释放白细胞介素10、转化生长因子β等抗炎因子促进滑膜及软骨组织修复，起到抗炎及保护软骨的作用[22-23]。通过调控滑膜巨噬细胞极化(抑制M1极化、提高M2极化)对改善滑膜组织的免疫微环境进而治疗膝骨关节炎具有重要意义。此次实验结果显示，膝骨关节炎模型组大鼠滑膜组织M1型巨噬细胞标志物CD86免疫荧光显著升高，M1释放的白细胞介素1β表达量也升高，并伴有基质金属蛋白酶13降解酶表达量显著增加，提示膝骨关节炎中M1型巨噬细胞极化时不仅有滑膜炎症的产生，同时也出现软骨被降解破坏；模型组M2型巨噬细胞标志物CD206免疫荧光显著降低，其释放的抑炎因子白细胞介素10表达量显著低于正常对照组；痛安汤干预后CD86免疫荧光降低，CD206免疫荧光显著降升高，其相关因子也随之改变，证明痛安汤能通过调控巨噬细胞极化改善膝骨关节炎。
miRNA可通过影响mRNA降解或翻译来调节基因表达[24]。《Cell Metabolism》杂志上发表的一篇文章提到，miRNA能够调节巨噬细胞极化的多种转录因子和信号通路的表达，这使其成为调控免疫反应的重要靶标[25]。miRNA可以通过调控某些炎症信号通路参与膝骨关节炎的发生发展，miRNA可能具有治疗膝骨关节炎的潜力[26]。研究发现，miRNA能够通过调控巨噬细胞极化来影响膝骨关节炎的进程，例如：LI等[27]研究发现，miR-155-5p能够通过介导滑膜巨噬细胞M1极化诱发关节滑膜炎症；QIAN等[28]研究发现，通过过表达miR-26b-5p能够促使M1型巨噬细胞复极化为M2型，减轻小鼠滑膜炎症和软骨退变；ZHANG等[29]研究发现，miR-492 mimic可以逆转环状RNA(hsa-circ-0005567)过度表达对巨噬细胞极化的影响。miR-27a在膝骨关节炎中的调控作用及应用价值方面也越来越被重视，它可能成为膝骨关节炎治疗的一个潜在靶标[30]。研究证实，在膝骨关节炎患者中miR-27a是低表达的[31]，miR-27a可调控炎症因子抑制膝骨关节炎中滑膜血管增生、减轻滑膜炎症反应[9]。此次实验通过高通量测序发现，模型组中大鼠滑膜组织中miR-27a低表达，并且miR-27a表达与Lequesne评分呈负相关，荧光双染图表现为M1巨噬细胞标志物CD86升高的同时，也发现相关因子的蛋白及基因表达升高。这些结果进一步证实了miR-27a参与膝骨关节炎发病过程，并且具有调控滑膜巨噬细胞极化的作用。为了进一步阐明miR-27a调控滑膜巨噬细胞极化的作用机制，此次实验应用miRDB数据库联合TargetScan数据库对miR-27a的靶点进行预测，发现miR-27a的靶基因是核因子κB，荧光素酶基因实验进一步验证了它们能够相互结合。
核因子κB是一组可以被促炎细胞因子激活的转录因子，炎症信号通过激活IκB激酶导致IκB 降解，随后核因子κB复合物被转移到细胞核，进而启动靶基因的转录[32]。膝骨关节炎滑膜病变表现为慢性低度炎症，核因子κB信号通路已被确定为这种慢性炎症反应的关键参与者[33]。LU等[34]研究发现，辛夷脂素能够通过抑制P65/核因子κB信号传导抑制M1型巨噬细胞极化来减轻滑膜炎症，从而改善膝骨关节炎。SHI等[35]研究发现，与单独使用U50488H(κ-阿片激动剂)相比，U50488H联合核因子κB抑制剂时则表现出更强的抑制膝骨关节炎滑膜炎症和M1巨噬细胞极化的能力。核因子κB信号通路的激活可以进一步诱导炎症递质和基质分解代谢酶的产生，如基质金属蛋白酶、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β等，促进软骨细胞凋亡和细胞外基质降解[36]。此次实验结果显示，miR-27a过表达组核因子κB mRNA表达降低，同时伴有M1巨噬细胞标志物CD86荧光吸收度减少、白细胞介素1β及基质金属蛋白酶13的降低，而M2型巨噬细胞标志物CD206荧光吸光度值及白细胞介素10表达升高，表现为抗炎优势；而当miR-27a抑制时，结果则相反，核因子κB mRNA表达升高，表现出炎症发展优势，这表明miR-27a通过介导核因子κB调控滑膜巨噬细胞极化来影响膝骨关节炎的发生与发展。
膝骨关节炎中医学称之为“痹证”，国医大师韦贵康所创经验方痛安汤治疗膝骨关节炎疗效显著。课题组一直致力于膝骨关节炎的中医药研究[37-40]，前期临床研究发现痛安汤能减轻膝骨关节炎的临床症状。为了深入揭示痛安汤对膝骨关节炎滑膜巨噬细胞极化调控作用机制，此次实验从miR-27a出发，观察痛安汤对膝骨关节炎大鼠miR-27a、核因子κB的影响，实验证实痛安汤可促进膝骨关节炎大鼠滑膜组织 miR-27a表达、抑制核因子κB表达，调控滑膜巨噬细胞极化来抑制滑膜炎症。痛安汤由丹参、三七、降香、两面针、白芍、煅龙骨、炙甘草7味中药组成，其中丹参、三七为君药，三七的主要有效成分为槲皮素，丹参的主要有效成分为木犀草素。HU等[41]通过用槲皮素处理RAW 264.7细胞，发现M2巨噬细胞标记物Arg1的表达明显升高，在膝骨关节炎模型大鼠关节腔注射槲皮素后滑膜中M2型巨噬细胞升高、基质金属蛋白酶13表达降低，表明槲皮素能够通过促使巨噬细胞向M2型极化抑制滑膜炎症、促进软骨修复。木犀草素是属于黄酮类化合物，应用于膝骨关节炎中起到抗炎、调节巨噬细胞极化的作用[42-43]。此次实验结果显示，当抑制miR-27a表达时，痛安汤抑制核因子κB和调控M2巨噬细胞极化的作用减弱，对大鼠膝骨关节炎的改善程度也降低，说明痛安汤治疗膝骨关节炎依赖miR-27a、核因子κB。
该研究也存在一定的局限性：没有使用基因敲除小鼠，无法更好地阐释痛安汤在调控滑膜巨噬细胞极化中的作用机制；年龄和性别也是膝骨关节炎的重要因素，此次实验只使用8周龄雄性SD大鼠制作膝骨关节炎模型，需要进一步探索以确定痛安汤对老年雌、雄性大鼠膝骨关节炎的作用；实验只观察痛安汤2周的干预作用，未来应进行更长期的干预研究，以评估痛安汤在更长时间内的疗效和安全性；痛安汤作为中药方剂，具有多靶点、多途径的特点，未来研究需要从滑膜纤维化、滑膜铁死亡等多方面多角度探讨痛安汤的其他潜在作用机制。
综上所述，痛安汤促进 miR-27a 表达、抑制核因子κB表达，通过调控巨噬细胞极化修复膝骨关节炎关节免疫微环境，抑制膝骨关节炎的滑膜炎症。miR-27a/核因子κB调控巨噬细胞极化的机制可为膝骨关节炎的治疗提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

痛安汤对膝骨关节炎大鼠滑膜巨噬细胞极化的作用机制

Mechanism by which Tongan Decoction regulates synovial macrophage polarization in rats with knee osteoarthritis

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