胃癌类器官模型应用于个性化药物筛查的可行性

doi:10.12307/2025.532

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5345-5350.doi: 10.12307/2025.532

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

胃癌类器官模型应用于个性化药物筛查的可行性

范洪凯1，管瑛瑛2，王路敏3，曾凡伟4，尹毅锐1

复旦大学附属中山医院厦门医院，1普通外科，2病理科，3药剂科，福建省厦门市 361015；4厦门博创盛世生物技术有限公司，福建省厦门市 361100

收稿日期:2024-05-17 接受日期:2024-07-20 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-24
通讯作者: 尹毅锐，博士，副主任医师，复旦大学附属中山医院厦门医院普通外科，福建省厦门市 361015
作者简介:范洪凯，男，1985年生，山东省菏泽市人，汉族，2015年厦门大学毕业，硕士，主治医师，主要从事消化道肿瘤的临床与基础研究、类器官的培养及个性化药物筛选。
基金资助:
厦门市医疗卫生指导性项目(3502Z20209055)，项目负责人：范洪凯；福建省卫健委科技计划项目(2020QNB063)，项目负责人：尹毅锐

Feasibility of gastric cancer organoid models for personalized drug screening

Fan Hongkai1, Guan Yingying2, Wang Lumin3, Zeng Fanwei4, Yin Yirui1

1Department of General Surgery, 2Department of Pathology, 3Department of Pharmacy, Zhongshan Hospital (Xiamen Hospital), Fudan University, Xiamen 361015, Fujian Province, China; 4Xiamen BCSS Biotechnology Co., Ltd., Xiamen 361100, Fujian Province, China

Received:2024-05-17 Accepted:2024-07-20 Online:2025-09-08 Published:2024-12-24
Contact: Yin Yirui, MD, Associate chief physician, Department of General Surgery, Zhongshan Hospital (Xiamen Hospital), Fudan University, Xiamen 361015, Fujian Province, China
About author:Fan Hongkai, Master, Attending physician, Department of General Surgery, Zhongshan Hospital (Xiamen Hospital), Fudan University, Xiamen 361015, Fujian Province, China
Supported by:
Xiamen Medical and Health Guidance Project, No. 3502Z20209055 (to FHK); Fujian Provincial Health Commission Science and Technology Plan Project, No. 2020QNB063 (to YYR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肿瘤类器官：肿瘤组织在体外培养成功的三维立体结构体，能在体外模拟肿瘤的微环境及生物学特性，在肿瘤药物筛选中具有重要的应用前景。目前已经成功培养出多种肿瘤类器官，包括乳腺癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌等。
个性化药物：基于患者肿瘤组织进行药物敏感性检测，筛选出具有显著杀伤肿瘤细胞的药物。以此精准地为患者制订化疗方案，提高治疗效果，避免或减少耐药性的产生，减少患者因不断更换化疗药物引发的不良反应，减轻患者的经济负担。

摘要
背景：术后辅助化疗是治疗胃癌的常用方法，但患者对化疗的反应存在很大的差异，需要一种新的临床治疗前模型，来指导胃癌患者的个性化药物治疗。
目的：构建基于胃癌组织的类器官模型，探讨其在个性化药物筛查中的应用价值。
方法：收集20例胃癌患者术中切除的组织标本，消化分解后与基质胶混合种板，添加含有表皮生长因子和成纤维细胞生长因子10的类器官培养基进行培养。采用苏木精-伊红染色和免疫组化染色对胃癌类器官及原始肿瘤组织进行病理形态学及免疫分子标记同质性验证。通过对卡铂、伊立替康、氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇、表阿霉素等6种药物进行药物敏感性筛查，评估胃癌类器官模型用于药物筛查的可行性。
结果与结论：成功培养14例胃癌类器官，类器官的形态及生长特性存在个体性差异，所有类器官均可稳定传代、冻存、复苏。胃癌类器官保留了与原发肿瘤相同的形态学特征及免疫分子表达。6例类器官对6种化疗药物表现出了不同的药物敏感性，初步证实了胃癌类器官作为体外药物筛查模型具有可行性。

https://orcid.org/0009-0005-8153-1114 (范洪凯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 类器官, 3D培养模型, 化疗, 个体化治疗, 胃癌, 药敏

Abstract: BACKGROUND: Postoperative adjuvant chemotherapy is a common method for the treatment of gastric cancer, but the curative effect of chemotherapy in different patients varies considerably. A new pre-clinical treatment model is needed to guide personalized drug therapy for patients with gastric cancer.
OBJECTIVE: To construct organoid model based on gastric cancer tissue and investigate its application in personalized drug screening.
METHODS: The tissue samples of 20 patients with gastric cancer were collected, digested and decomposed, mixed with matrix glue, and cultured with organoid medium containing epidermal growth factor and fibroblast growth factor 10. Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical method were used to verify the homogeneity of pathological morphology and immune molecular markers of gastric cancer organoids and original tumor tissues. The feasibility of the established gastric cancer organoid model for drug screening was evaluated through drug sensitivity screening of six drugs including carboplatin, irinotecan, fluorouracil, oxaliplatin, paclitaxel, and epirubicin.
RESULTS AND CONCLUSION: Fourteen organoids of gastric cancer cases were successfully cultured. There were individual differences in morphology and growth characteristics of organoids. All organoids could be stably passed through, froze and resuscitated. Gastric cancer organoids retained the same morphological features and immunomolecular expression as primary tumor tissues. Six organoids showed different drug sensitivities to six chemotherapy drugs, which initially confirmed the feasibility of gastric cancer organoids as a drug screening model in vitro.

Key words: organoids, 3D culture model, chemotherapy, personalized therapy, gastric cancer, drug sensitivity

中图分类号:

范洪凯, 管瑛瑛, 王路敏, 曾凡伟, 尹毅锐. 胃癌类器官模型应用于个性化药物筛查的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5345-5350.

Fan Hongkai, Guan Yingying, Wang Lumin, Zeng Fanwei, Yin Yirui. Feasibility of gastric cancer organoid models for personalized drug screening[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5345-5350.

图/表（结果） 5

2.1 胃癌类器官模型的建立 获取20例手术切除的胃癌患者少许肿瘤组织，经过剪切、消化、过滤等处理后，制成胃癌细胞或组织悬液。将胃癌细胞或组织悬液进行类器官的培养、传代、建库。最终类器官培养成功14例，同时进行类器官与原发肿瘤形态学、免疫组化层次的同质性鉴定。培养成功的胃癌类器官可持续生长分裂，形成胃癌3D细胞团(图1)，并可以持续传代生长7代以上。表1展示了20例患者的基本信息。

2.2 胃癌类器官的组织学特征 将胃癌类器官切片与原发肿瘤组织切片进行苏木精-伊红染色。胃癌类器官的形态学特征表现出与原发肿瘤具有同质性(图2)。不同患者的肿瘤组织学形态不同，6例为线管样结构(肠型)，3例为实性片样结构(弥漫型)，11例两种形态均存在(混合型)。图2展示了胃癌患者及3例胃癌类器官肿瘤的结构。来源不同患者胃癌组织培养成功的类器官存在组织学上的差异。

2.3 胃癌类器官的免疫组织化学染色 C-met、Her-2、P53和Ki-67是胃癌细胞临床诊断和实验室检测的主要分子标志物。分别对类器官和原发肿瘤进行免疫组化分析对比，发现胃癌类器官表达了与原发肿瘤相同的分子标记(图3)。

2.4 胃癌类器官的药物敏感性检测结果 图4展示了6例胃癌(胃癌组织来源患者编号FDZS-Y066，FDZS-Y078，FDZS-Y079，FDZS-Y083，FDZS-Y096，FDZS-Y097)类器官用奥沙利铂、表阿霉素、氟尿嘧啶、卡铂、伊立替康、紫杉醇6种药物作用后的细胞活力变化，结果发现不同患者来源胃癌组织培养成功的类器官对相同药物的敏感性不同，同一患者来源胃癌组织培养成功的类器官对不同药物的敏感性也不同。FDZS-Y078类器官对表阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂、紫杉醇表现出了极度的敏感性。而FDZS-Y097类器官对5-氟尿嘧啶表现出不敏感性，随着药物浓度的增加，细胞存活率无明显降低。其余类器官随着药物浓度的变化表现出了不同的细胞抑制性。

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引言

据世界卫生组织发布的全球癌症统计报告显示，胃癌的全球发病率位列第5位，致死率位列第4位[1]。基于外科手术的综合治疗模式仍是目前胃癌的主要治疗手段，但其效果并不尽人意。术后辅助化疗作为胃癌综合治疗的常用方法之一，其疗效和副反应因人而异。为患者寻找合适的个性化药物，需要一种体外药物筛选模型，在胃癌患者药物治疗前筛选出有效的敏感药物，进而行精准的个性化药物治疗。
传统的2D肿瘤细胞系和人源肿瘤异种移植模型(patient-derived xenografts，PDX)在临床药物筛查方面已广泛应用。但是2D空间培养的肿瘤细胞系难以模拟原发肿瘤的立体结构和微环境，其药物敏感性筛选结果与临床用药结果仍然存在巨大差异，无法作为临床药物筛选的最佳模型。人源肿瘤异种移植模型是通过将恶性肿瘤患者的肿瘤细胞或者肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内[2-3]，对小鼠进行药物干预后观察移植肿瘤的生长情况，以确定不同药物的敏感性，在一定程度上保留了原发肿瘤的结构特点，弥补了2D肿瘤细胞系的缺点，是肿瘤学研究中评估药物敏感性较好的临床模型[4]。但人源肿瘤移植模型的缺点是建立模型耗时较长、费用相对昂贵、建模成功率较低，同时种属存在差异，不适合进行高通量药物的筛查[3]。
类器官又称为培养皿中的“器官”，是一种在体外培养而成的具有来源器官特征的三维立体的多细胞复合体结构[5-6]。癌症患者来源肿瘤类器官(patients derived organoids，PDOs)模型的出现，为研究肿瘤的药物敏感性提供了新的模型载体。肿瘤类器官模型可以保留肿瘤组织的生物学特性，传代培养后仍具有稳定的表型及遗传特征，同时培养周期相对较短，可作为目前研究肿瘤药物敏感性的理想模型。目前，相关的科研团队已成功构建多种癌症来源的肿瘤类器官，包括肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等。此研究通过获取手术后胃癌组织构建胃癌类器官模型，在体外进行药物敏感性检测，为胃癌患者提供个性化药物筛选模型。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 单中心观察性研究。
1.2 时间及地点 实验于2023年11月至2024年3月在厦门博创盛世生物技术有限公司实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 胃癌组织 2023年11月至2024年3月在复旦大学附属中山医院厦门医院普通外科收集20例胃癌患者的肿瘤组织标本，病理均为腺癌。获取的胃癌肿瘤组织分别进行类器官培养和肿瘤组织病理形态学及免疫组化研究。该研究获得复旦大学附属中山医院厦门医院伦理委员会批准(伦理编号：B2023-129R)。所有患者均签署《生物样本及健康信息捐赠者知情同意书》。
1.3.2 主要试剂与材料 24，48，96孔细胞培养板(NEST，中国)；1.5，15，50 mL离心管(NEST，中国)；2.5，6，10 cm细胞培养皿(NEST，中国)；移液器(Thermo Fisher，美国)；无菌吸头(NEST，中国)；无菌镊子、无菌组织剪、70 μm和100 μm细胞过滤器(NEST，中国)；原代组织保存液、肿瘤类器官基础培养基、肿瘤类器官完全培养基、组织解离液、类器官消化液(模基生物，中国)；红细胞裂解液(Abcam，英国)；润洗液(STEMCELL Technologies，加拿大)；基质胶(BD Matrige，美国)；胎牛血清(Thermo Fisher，美国)；1×DPBS(Biosharp，中国)；Ki-67抗体、C-met抗体、P53抗体、Her-2抗体(Abcam，英国)；奥沙利铂、表阿霉素、氟尿嘧啶、卡铂、伊立替康、紫杉醇(沪慧生物科技有限公司)。
1.3.3 实验设备 生物安全柜(ESCO，美国)；细胞培养箱(赛默飞，美国)；低温水平式离心机(Eppendorf，德国)；倒置显微镜(ZEISS，德国)；病理组织漂烘仪(郝思琳，中国)；石蜡切片机(Leica，德国)；全自动脱水机(Epredia，美国)。
1.4 方法
1.4.1 胃癌类器官培养 获取新鲜的胃癌组织后，在低温状态下运送至实验室，在洁净的生物安全柜内进行类器官培养的相关实验操作。①将肿瘤组织转移至清洗液(无菌磷酸盐缓冲液)中，用无菌镊子夹住充分荡洗。②将肿瘤组织用无菌的组织剪剪碎为0.5-2 mm2大小。③将剪碎的组织用50倍肿瘤组织体积的原代组织消化液重悬，转移至15 mL离心管内，在37 ℃、100 r/min恒温摇床中水平振荡消化15-30 min，每隔10 min观察组织消化情况，待组织块明显分散，悬液较浑浊时，取适量组织消化悬液镜检，待悬液中有较多肿瘤细胞团即可终止消化，用移液器吹打组织消化悬液至无明显组织碎块，在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清至终体积分数达2%-5%以缓解消化作用(适量增加防止再次消化)，同时轻轻吹打5-10次。④用100 μm细胞过滤器将上述组织悬液进行过滤，以收集不同大小的肿瘤细胞或组织碎片，将过滤液转移至离心管中，4 ℃、250×g离心力离心3 min，吸去上清液，保留沉淀(反复三四次)。⑤将清洗后的细胞沉淀用少量含有抗生素的PBS或肿瘤类器官基础培养基重悬，取少量悬液进行活细胞检测和计数，并按照(1-5)×108 L-1的细胞浓度加入基质胶(> 70%)并在冰上混匀。⑥用移液器吸取基质胶和细胞的混合液移至24孔培养板中，放入37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育20 min，待基质胶凝固不再流动后，沿孔壁缓慢加入肿瘤类器官完全培养基。⑦原代培养三四天换液1次，每天于倒置显微镜下观察肿瘤类器官的生长状态，每3 d于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中类器官的形态和分布。⑧传代时，吸弃旧培养基，收集类器官混合物，消化、清洗、离心后，将细胞沉淀加入基质胶中混匀，用移液器将基质胶和类器官混合液加入24孔培养板中传代培养。
1.4.2 胃癌组织及类器官苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色 ①新鲜的胃癌组织于体积分数10%中性甲醛中固定24 h，PBS洗涤，然后用体积分数70%乙醇进行脱水处理，将脱水后的胃癌组织浸蜡后，放入融化的固体石蜡中，凝固后组织包埋在固体石蜡中，修整蜡块，用切片机将蜡块切成厚度4-6 μm的切片，用镊子展平组织切片，置于恒温水面，待切片充分展平后，放置在载玻片的中间处，置入60-65 ℃烤箱内烤片20 min，脱去组织间隙的石蜡。②将培养3代以上的胃癌类器官用100 g/L多聚甲醛固定约12 h，用1%琼脂糖包裹，脱水、石蜡包埋后进行切片处理。③将胃癌原发肿瘤组织和胃癌类器官切片后进行苏木精-伊红染色，脱水后使用中性树胶固定，倒置显微镜下观察原发肿瘤细胞和类器官肿瘤细胞形态差异。同时对原发胃癌肿瘤组织和类器官进行免疫组化染色，包括P53抗体、C-met抗体、Her-2抗体和Ki-67抗体。
1.4.3 药物敏感性实验 收集传代为第3-6代的类器官组织，用类器官消化液消化，(250-300)×g离心3 min，以每孔1 000个细胞密度接种到96孔板中，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养48 h，加入等体积的临床常用化疗药物，使其终浓度在一定梯度：氟尿嘧啶(浓度分别为0.81，2.43，7.29，21.87，65.61 μmol/L)、奥沙利铂(浓度分别为2.43，7.29，21.87，65.61，196.83 μmol/L)、表阿霉素(浓度分别为0.09，0.27，0.81，2.43，7.29 μmol/L)、伊立替康(浓度分别为0.243，0.729，2.187，6.561，19.683 μmol/L)、紫杉醇(浓度分别为0.024 3，0.072 9，0.218 71，0.656 11，1.968 3 μmol/L)和顺铂(浓度分别为2.43，7.29，21.87，65.61，196.83 μmol/L)。设置只加入培养基的对照组。孵育96 h后，吸除孔板上层培养基，采用Cell Titer-Glo®细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。根据检测结果绘制6种常用化疗药物的剂量-效应曲线，依据变化的曲线状态判别胃癌肿瘤类器官对相应化疗药物的敏感程度。
1.5 主要观察指标 ①类器官培养成功情况；②类器官的生长状态及形态变化；③培养成功后，通过苏木精-伊红染色及免疫组化染色对类器官进行鉴定；④培养成功的类器官对相应化疗药物的敏感程度。

1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料采用M(范围)表示，计数资料采用例数表示；曲线图采用Graphpad Prism 9版本制作。P值采用双侧性，P < 0.05为差异有显著性意义；统计学方法通过复旦大学附属中山医院厦门医院公共卫生科审核。

讨论

肿瘤异质性表现在肿瘤内部癌细胞的差异，癌症患者的整体治疗预后受肿瘤异质性的影响[7-8]。胃恶性肿瘤患者对化疗药物的耐药性与肿瘤内部的异质性关系密切[9]。耐药在临床上表现千差万别，癌症患者几乎对所有药物都表现出耐药性，包括化疗药物、靶向药物、免疫药物等，筛选出对患者敏感的药物至关重要。构建一种个体化药物筛选模型，在体外筛选对患者敏感的药物，是为患者制订个性化治疗方案的重要一环。
类器官是体外培养获得的3D立体结构，在结构和功能上保留了原发组织的特性，能很好地模拟原器官组织的微环境特点，极大地保留了原发肿瘤的特征。与传统的2D肿瘤细胞系相比，3D细胞培养能够更好地模拟体内细胞的微环境，包括细胞相互之间的作用、细胞与细胞外基质的相互作用及细胞对氧气和营养物的获取[10-11]。与人源肿瘤异种移植模型相比，类器官可以更准确地模拟人源性器官的特定功能和疾病状态，而且操作简便，减少了伦理和福利的相关考量；同时类器官培养周期短，可在短时间内进行药物的筛查，根据药物敏感性指导患者临床用药，实现患者化疗药物应用的个体化[12]。
类器官技术的出现在细胞培养领域具有划时代的意义，极大地提高了细胞培养的成功率，是一种革命性的细胞培养方法。相关研究领域的科研人员已成功培养出不同肿瘤来源的类器官，包括消化系统肿瘤 (胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌) [13-18]、呼吸系统肿瘤 (肺癌) [19]、泌尿系肿瘤(前列腺癌)等[20]。肿瘤类器官的培养是研究癌症发生发展和药物研发的宝贵平台[21]，目前肿瘤类器官的培养仍以手术切下来的标本为主。还有研究甚至运用胃癌患者的腹水成功培养了类器官[22-23]。虽然肿瘤类器官可以一定程度上还原原发肿瘤的发生发展，然而胃癌组织具有高度异质性，同时类器官仍然是体外模型，仍无法模拟肿瘤微环境成分之间的相互作用，其药物治疗反应及预后千差万别。
肿瘤类器官的相关研究近年来成为学者探讨的热点。曾云丽等[14]通过1 231例结直肠癌类器官培养经验发现，结直肠癌类器官的培养成功率与取材部位、取材方式及新辅助治疗相关；吴铭等[24]通过取材切除的肿瘤组织成功培养乳腺癌类器官，表现出了良好的药物筛选效果；WATANABE等[16]建立了胰腺癌类器官平台，并证实了其在体外药物筛选中的应用价值；胡蕾等[22]通过胃癌腹水成功建立了类器官模型，并通过2种化疗药物证实了其作为体外药物筛选模型的应用价值；LI等[23]通过获取晚期胃癌患者的腹水培养类器官，证实了其在体外进行药物筛选的可行性；SCHMÄCHE等[21]研究通过内镜获取食管胃结合部肿瘤组织构建类器官模型，证明了基于患者的类器官阈值可以用于预测食管胃结合部癌症患者对新辅助化疗的反应。该研究基于获取的手术切除肿瘤组织，在体外短期内成功培养出3D肿瘤类器官模型，能较好地呈现出原发肿瘤的病理学特点和分子表达。在体外进行药物筛选时，足够多的肿瘤类器官可同时进行多种药物的筛选实验，一定程度上缩短了患者等待药物敏感性筛查的时间。实验结果显示胃癌类器官对不同药物均表现出个性化、异质性的特点，表明类器官模型可用于肿瘤患者个性化药物筛查[23，25]。如若要进一步验证类器官指导临床药物使用价值，需同时进行肿瘤类器官和患者的临床药物敏感性实验。
该研究在胃癌类器官药物筛查方面取得了有一定价值的实验结果，但仍有待完善之处。首先，样本量相对较少，没能在基因水平进一步验证肿瘤类器官与原发肿瘤的同质性；其次，仅进行了少量常用药物的敏感性筛选，可在此基础上进一步完善药物筛选种类，增加免疫药物和靶向药物的筛查。
综上所述，该研究成功建立了胃癌类器官模型，通过病理形态学验证了类器官与原发肿瘤的同质性，在此基础上进行了临床化疗药物的体外筛选，为胃癌患者个性化治疗指明了一个方向。近年来，肿瘤类器官成为一种新型的可精准预测药物敏感性的实验模型，可用于体外研究患者肿瘤的异质性和药物反应，能为癌症患者提供精准的治疗策略[26-28]，其作为药物筛选平台指导临床个性化用药具有潜在的可行性。未来需要招募更多的临床癌症患者进行前瞻性临床研究，以造福更多患者。
胃癌类器官在个性化治疗方面表现出极大的优势，但仍有一定的不足：首先，类器官的培养在不同肿瘤之间成功率表现差异大；其次，肿瘤类器官缺乏肿瘤发生发展的成纤维细胞和免疫细胞等，无法做到完美地模拟微环境。随着类器官技术的进一步发展，未来类器官技术不仅在肿瘤治疗方面表现出超凡的应用价值，在非肿瘤患者中也会得到更大的发展前景。类器官技术可能与其他学科融合发展，如生物工程学、计算机技术、3D打印技术等，以解决人类在技术水平上的困境。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

胃癌类器官模型应用于个性化药物筛查的可行性

Feasibility of gastric cancer organoid models for personalized drug screening

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