体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响

doi:10.12307/2025.517

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5304-5310.doi: 10.12307/2025.517

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体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响

熊挺淋1，张丽莎1，王德伟1，曹海平1，杨燕2

1南充市中心医院心内科•川北医学院第二临床医学院，四川省南充市 637000；2四川驰鼎盛通生物科技有限公司，四川省成都市 610041

收稿日期:2024-03-28 接受日期:2024-06-03 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-17
通讯作者: 张丽莎，副主任医师，南充市中心医院心内科•川北医学院第二临床医学院，四川省南充市 637000
作者简介:熊挺淋，男，1986年生，重庆市人，汉族，2012年重庆医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事心肌细胞再生研究及冠心病介入治疗。
基金资助:
四川省科学技术厅重点研发项目(2019YFS0314)，项目负责人：杨燕

Effect of culture time in vitro on maturity of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Xiong Tinglin1, Zhang Lisha1, Wang Dewei1, Cao Haiping1, Yang Yan2

1Department of Cardiology of Nanchong Central Hospital • Second Clinical Medical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 2Sichuan Chidingshengtong Biotechnology Co., Ltd., Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2024-03-28 Accepted:2024-06-03 Online:2025-09-08 Published:2024-12-17
Contact: Zhang Lisha, Associate chief physician, Department of Cardiology of Nanchong Central Hospital • Second Clinical Medical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Xiong Tinglin, Master, Associate chief physician, Department of Cardiology of Nanchong Central Hospital • Second Clinical Medical College of North Sichuan Medical College, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
Key Research & Development Project of Sichuan Provincial Department of Science and Technology, No. 2019YFS0314 (to YY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

诱导多能干细胞：是类似胚胎干细胞的多能性细胞，解决了胚胎干细胞用于移植治疗时存在的伦理及免疫排斥难题，其向心肌细胞的定向分化为心肌细胞再生研究提供了可能。
心肌细胞：是一种终末分化细胞，目前已证实包括诱导多能干细胞在内的干细胞能够定向分化为心肌细胞。

摘要
背景：研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞，但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。
目的：探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。
方法：使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化，分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞；采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平；LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度；MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量，JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。
结果与结论：与第20天的分化心肌细胞相比，第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P < 0.05)；多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P < 0.05)；第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平，SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P < 0.05)；与第20天的分化心肌细胞相比，第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高，线粒体分布密度更大，且功能性线粒体数量增加(P < 0.05)。结果表明：延长诱导分化时间，可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。

https://orcid.org/0000-0003-0846-4515 (熊挺淋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 诱导多能干细胞, 分化心肌细胞, 线粒体, 心脏基因, 心脏蛋白, 成熟度

Abstract: BACKGROUND: It has been proved that induced pluripotent stem cells can differentiate into cardiomyocytes, but there are few reports on the maturity of differentiated cardiomyocytes.
OBJECTIVE: To explore the effect of prolonging the induced differentiation time on the morphology, sarcomere length, binuclear cell content, cardiac gene expression, cardiac protein expression, and mitochondrial function of cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.
METHODS: Bone morphogenetic protein 4, CHIR 99021, and IWR1 were used to induce pluripotent stem cells to differentiate into cardiomyocytes, and differentiated cardiomyocytes were collected on days 20 and 40 respectively. The expression levels of cardiac genes and proteins in differentiated cardiomyocytes were detected by RT-PCR and immunofluorescence, respectively. LAS X image analysis software was used to analyze the morphology and sarcomere length of differentiated cardiomyocytes. MitoTracker Green FM mitochondrial staining was used to detect total mitochondria. JC-1 mitochondrial staining was used to detect mitochondrial membrane potential.
RESULTS AND CONCLUSION: Differentiated cardiomyocytes on day 40 had longer cell circumference and sarcomere length, and larger cell area than those on day 20 (P < 0.05). The proportion of multinucleated cells rose sharply from about 16% on day 20 to about 29% on day 40 (P < 0.05). Differentiated cardiomyocytes on day 40 had gene expression levels that were more similar to those of the primary cardiomyocytes, and the expression levels of SERCA2A, Cx-43, and α-MHC genes were significantly higher than on day 20 (P < 0.05). Compared with the differentiated cardiomyocytes on day 20, the expression density of TNNT2 and α-MHC protein was relatively higher, the distribution density of mitochondria was larger, and the number of functional mitochondria was greater on day 40 (P < 0.05). The results show that prolonging the induced differentiation time can increase the maturity of differentiated cardiomyocytes by increasing the length of sarcomere and the number of functional mitochondria, as well as improving the expression levels of cardiac genes and proteins.

Key words: induced pluripotent stem cell, differentiated cardiomyocyte, mitochondria, cardiac gene, cardiac protein, maturity

中图分类号:

熊挺淋, 张丽莎, 王德伟, 曹海平, 杨燕. 体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5304-5310.

Xiong Tinglin, Zhang Lisha, Wang Dewei, Cao Haiping, Yang Yan. Effect of culture time in vitro on maturity of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5304-5310.

图/表（结果） 2

2.1 不同时间点分化心肌细胞形态比较 LAS X图像分析软件分析第20天和第40天的分化心肌细胞免疫荧光图像的形态差异，共测量70个细胞。平均细胞周长从第20天时的(152.55±18.48) μm增加至第40天时的(182.71±21.59) μm，差异有显著性意义(P < 0.05)。同样，随着培养时间的延长，平均细胞面积从第20天时的(1 146.09±194.51) μm2显著增加到第40天时的(1 752.46±254.77) μm2 (P < 0.05)，见图2。
2.2 不同时间点分化心肌细胞肌节长度比较 通过α-actin免疫荧光染色和LAS X图像分析软件来测量分化心肌细胞的肌节长度。第40天时分化心肌细胞有更高的密度和更明显的肌原纤维条纹排列，然而第20天时分化心肌细胞具有不规则的亚细胞组织和较低的肌原纤维密度。更成熟的分化心肌细胞进一步证据是肌节长度的显著延长，从第20天的(1.58±0.22) μm延长到第40天时的(1.96±
0.28) μm，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。
2.3 不同时间点分化心肌细胞中多核细胞含量比较 在成熟过程中，分化心肌细胞逐渐失去增殖能力，因此DNA复制不再与细胞分裂(胞质分裂)相关，更多的分化心肌细胞变成多核并通过间隙连接，形成功能性合胞体。α-actin和Hoechst 34580免疫荧光染色后随机观察200个分化心肌细胞，多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P < 0.05)，见图4。
2.4 不同时间点分化心肌细胞中基因表达 见图5。第20天和第40天时分化心肌细胞中TNNT2、Nkx2.5基因表达水平没有差异，其表达水平虽明显高于诱导多能干细胞(P < 0.05)，但明显低于原代心肌细胞(P < 0.05)，其中TNNT2对心肌细胞的自发搏动至关重要。
TNNI1基因在诱导多能干细胞和原代心肌细胞在几乎不表达，其在第40天的分化心肌细胞中的表达水平明显低于第20天的分化心肌细胞(P < 0.05)；而TNNI3基因在原代心肌细胞中的表达水平明显高于各时间点的分化心肌细胞和诱导多能干细胞(P < 0.05)，其在第40天的分化心肌细胞中的表达水平稍高于第20天的分化心肌细胞，但差异无显著性意义(P > 0.05)。
随着培养时间的延长，β-MHC基因的表达水平逐渐下降，其在第20天分化心肌细胞中的表达水平明显高于第40天分化心肌细胞和原代心肌细胞(P < 0.05)；然而α-MHC基因表达水平出现了完全相反的结果，在原代心肌细胞中的表达水平明显高于各时间点的分化心肌细胞和诱导多能干细胞(P < 0.05)，第40天分化心肌细胞中的表达水平明显高于第20天分化心肌细胞(P < 0.05)。
体外细胞分化培养过程中，检测到编码内向整流钾通道Kir2.1(KCNJ2)的基因表达水平升高，但差异无显著性意义(P > 0.05)，原代心肌细胞中的表达量明显高于分化心肌细胞和诱导多能干细胞(P < 0.05)。
诱导多能干细胞和第20天分化心肌细胞的Cx-43基因表达水平几乎相同且明显低于第40天分化心肌细胞和原代心肌细胞(P < 0.05)，表明经过1个多月的心肌分化后，分化心肌细胞中的Cx-43表达量增加了2倍多，达到了原代心肌细胞的表达水平。
肌浆网Ca2+-ATP酶基因(SERCA2a)在心肌细胞钙稳态的调节中起重要作用，其在原代心肌细胞的表达水平明显高于分化心肌细胞和诱导多能干细胞(P < 0.05)，随着体外培养时间的延长，其表达水平也明显升高(P < 0.05)。
2.5 不同时间点分化心肌细胞中心脏蛋白表达 体外培养第20天和第40天的分化心肌细胞均阳性表达NKX2.5、TNNT2、α-MHC和CX-43心脏蛋白。NKX2.5和CX-43蛋白的表达水平在两个时间点都是相似的，而TNNT2和α-MHC蛋白的表达水平在第40天时相对较高，见图6。

2.6 不同时间点分化心肌细胞中线粒体染色 MitoTracker Green FM染色显示，第20天分化心肌细胞中的大部分线粒体以细胞核为中心分布，见图7A，随着分化心肌细胞肥大的增加，第40天分化心肌细胞中的线粒体在细胞中呈均匀分布，且分布密度更大，见图7B。JC-1 线粒体膜电位荧光探针染色结果显示，第20天分化心肌细胞中主要表现出低膜电位的绿色荧光，见图7C，而第40天分化心肌细胞中主要表现出高膜电位的红色荧光，见图7D，表明功能性线粒体数量增加。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外观察性实验，细胞功能检测数据采用配对样本t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年11月至2022年11月在川北医学院实验动物中心和南充市中心医院组织工程与干细胞研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞和实验动物 小鼠诱导多能干细胞购自中国科学院动物研究所北京干细胞库并保存在液氮中。小鼠胚胎成纤维细胞为课题组自行制备。出生1-3 d昆明乳鼠由川北医学院实验动物中心提供，实验动物机构许可证号：SCXK(川)2018-18。
实验方案符合南充市中心医院伦理委员会制定的相关规定，伦理审批号：2020年审(148)号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂与仪器 β-巯基乙醇购自Hyclone公司；MitoTracker Green FM购自CST公司；骨形态发生蛋白4购自Prospec公司；CHIR 99021购自北京诺为生物公司；Hoechst 34580和IWR1购自Sigma公司；JC-1 线粒体膜电位荧光探针购自YEASEN公司；RNase-free水购自北京百奥莱博科技有限公司；α-actin、NKX2.5、TNNT2、α-MHC和CX-43单克隆抗体购自Santa Cruz公司；TRITC标记和FITC标记的IgG荧光二抗购自Santa Cruz公司；丝裂霉素C和白血病抑制因子购自上海欣百诺公司；Gold view和Triton X-100购自Genview公司；TRIzol溶液购自Life Technologies公司；RNAiso Plus反转录试剂盒购自TaKaRa公司；S1000TM Thermal cycler反转录系统购自BIO-RAD公司；荧光显微镜购自Olympus公司；LAS X图像分析软件购自Leica公司。
1.4 实验方法
1.4.1 诱导多能干细胞培养 诱导多能干细胞接种在事先经丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上，基础培养基为DMEM-H，包含体积分数10%胎牛血清、1 000 IU/mL白血病抑制因子、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，一两天换1次基础培养基；根据饲养层细胞老化和诱导多能干细胞生长情况决定，一般3-7 d开始传代，用0.05%胰酶消化，细胞悬液接种在新的不含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养板，30 min后吸取上清液并接种到新的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，一部分保存于液氮中备用，一部分继续传代培养。
1.4.2 原代心肌细胞培养 取新生昆明乳鼠心脏，放在预冷的无菌PBS中，去除心包，将心脏剪成1 mm3的组织碎块，然后用Ⅱ型胶原酶消化2次，每次15 min，再用0.1%胰酶消化3次，每次6 min，收集上述消化液并用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-H培养基中和，然后10 000 r/min离心1 min，用培养基重悬细胞后置于培养皿中差异贴壁1 h分离培养心肌细胞，培养基为DMEM-H、体积分数10%胎牛血清、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
1.4.3 诱导心肌细胞分化 诱导多能干细胞在90%左右聚集度时，胰酶消化后用基础培养基制成单细胞悬液，在培养皿中培养1 h(差速贴壁去除小鼠胚胎成纤维细胞)，吸取细胞悬液接种于无菌培养皿中，加入新的分化培养基(DMEM-H、体积分数10%胎牛血清、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸)，其中添加25 ng/mL骨形态发生蛋白4和5 mmol/L CHIR 99021，以激活WNT信号通路诱导细胞分化，3 d后弃掉旧的分化培养基，加入添加了10 mmol/L IWR1的分化培养基以抑制WNT信号通路，7 d后弃掉旧的分化培养基，加入添加了5 mmol/L胰岛素的分化培养基以促进细胞增殖，第12天时改用添加了4 mmol/L乳糖的无糖分化培养基继续培养4 d，第16天时更换为生长培养基(DMEM-H、体积分数10%胎牛血清、0.1 mmol/L L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸)继续培养至第40天，每天更换生长培养基。在分化培养的第20天和第40天收集分化心肌细胞。细胞在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。诱导分化方案见图1。

1.4.4 细胞总RNA提取 使用TRIzol法提取细胞的总RNA，具体方法为：每孔加入0.5 mL的TRIzol溶液，吹打混匀以裂解细胞，室温下静置5 min，加入0.1 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温下静置3 min，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液至新管中，加入0.25 mL异丙醇，室温下静置10 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃上清后加入0.5 mL体积分数75%乙醇，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温下静置10 min后加入200 μL RNase-free水并吹打数次，60 ℃静置10 min使RNA充分溶解，最后将提取的细胞总RNA保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.5 RT-PCR 使用RNAiso Plus反转录试剂盒以及S1000TM Thermal cycler反转录系统将总RNA反转录成cDNA。PCR过程使用25 µL扩增体系，条件为：94 ℃变性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s，循环30次。目的基因的引物序列和产物大小见表1，β-actin作为内参。PCR产物用2%琼脂糖做凝胶电泳分离条带，然后用Gold view显色，结果采用quantity one凝胶电泳仪进行图像分析和数据处理。

1.4.6 免疫荧光 收获的细胞用PBS洗涤3次，然后用40 g/L多聚甲醛在室温条件下固定30 min，0.1% Triton X-100穿孔10 min，PBS洗3次，加入1%牛血清白蛋白封闭30 min，甩掉封闭液，用PBS稀释的单克隆一抗(α-actin、NKX2.5、TNNT2、α-MHC和CX-43抗体，1∶100)在37 ℃条件下孵育2 h，PBS洗3次，再用PBS稀释的IgG荧光二抗(1∶100)在37 ℃条件下孵育2 h，PBS洗3次，最后用1 μmol/L Hoechst 34580染细胞核，抗淬灭剂封固。用荧光显微镜照相及LAS X图像分析软件分析图像，包括分化心肌细胞形态和肌节长度。
1.4.7 线粒体染色 MitoTracker Green FM对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位，作为定量线粒体总量的检测方法。分化心肌细胞接种在事先被Geltrex包被的盖玻片上，用MitoTracker Green FM在37 ℃条件下孵育30 min，然后用PBS洗2次，细胞核用1 μmol/L Hoechst 34580染色，在荧光显微镜下观察和照相。
JC-1 线粒体膜电位荧光探针对线粒体进行免疫荧光染色，检测线粒体膜电位。弃掉细胞培养基，然后加入1.5 μmol/L JC-1工作液完全覆盖细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱孵育15 min，弃掉JC-1工作液，PBS快速清洗2次，再加入2 mL PBS；细胞核用1 μmol/L Hoechst 34580染色，最后在荧光显微镜下观察和照相。
1.5 主要观察指标 分化心肌细胞的形态、肌节长度、多核细胞含量、心脏基因和蛋白表达、线粒体功能。

1.6 统计学分析 使用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料用x±s表示，两组间比较采用配对样本t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过川北医学院第二临床医学院统计学专家审核。

讨论

对于动物和人的胚胎干细胞和诱导多能干细胞，体外定向心肌分化的诱导因素已被许多研究证实，包括使用小分子和小分子调节相关途径等来促进心肌细胞的分化[5，17-18]，但目前很少有报道功能成熟的分化心肌细胞，也无法产生大量可用于临床的分化心肌细胞。目前的研究表明，诱导多能干细胞衍生的心肌细胞有类似胎儿细胞的特征，例如具有收缩性和类似胚胎的电生理特点[19-20]，尽管影响成熟度的因素仍不完全明确，但所选细胞系、培养方式和不同培养条件等似乎对成熟度有影响。因此该研究采用已知分化效率最高的WNT信号通路诱导多能干细胞向心肌细胞分化，并延长诱导分化时间，观察分化心肌细胞的成熟度。研究结果表明，诱导多能干细胞体外定向心肌诱导分化培养时间延长至40 d，分化心肌细胞从形态结构、细胞功能、心脏基因、心脏蛋白和线粒体功能方面增加了分化心肌细胞成熟度。
与20 d时的分化心肌细胞相比，40 d时的分化心肌细胞不仅细胞周长和面积更大，而且具有更多成熟度高的圆柱形细胞，与刚出生后几个月的心肌细胞特点相似[21-22]，而且40 d时显示出更高的多核细胞比例，表明增殖能力下降和功能性合胞体的形成，这也与之前的研究结果一致[23]。体外延长培养至40 d后，分化心肌细胞排列呈肌纤维样，相邻肌纤维形成更规则的纹状体，其肌节长度延长超过20%，这种肌节长度的延长也与以前的研究相同，肌节的延长可以提高心肌收缩能力[21]。
分化心肌细胞与原代心肌细胞在基因表达方面存在一定的差异，包括TNNT2、Nkx2.5、KCNJ2、α-MHC、TNNI3和SERCA2a，这说明在实验条件下的分化心肌细胞与天然心肌细胞发育的差距，但上述基因表达水平明显高于诱导多能干细胞，表明体外诱导过程中的持续心脏分化。KCNJ2基因编码的是一个完整的膜蛋白和内向整流型钾通道，其功能是让钾内流，它可能参与心肌细胞动作电位波形和兴奋性[24]，该研究中2个时间点的分化心肌细胞中KCNJ2基因表达水平无明显差异性，表明在诱导分化40 d内分化心肌细胞的钾通道水平都较低，未来的实验需要延长更久的诱导时间，以进一步观察分化心肌细胞能否达到正常心肌细胞的钾通道水平。TNI是横纹肌细胞中肌钙蛋白复合物亚基，对收缩起重要作用，TNI有3种类型，TNNI1和TNNI2主要位于骨骼肌细胞中，而TNNI3主要位于心肌细胞中，是代表心肌细胞成熟的相关基因。一些研究表明，分化心肌细胞中β-MHC和TNNI1基因表达水平在整个分化期间明显增加[25]，而该研究中TNNI1基因表达水平逐渐下降，TNNI3基因表达水平逐渐升高，也证明体外诱导过程中的持续心脏分化和功能成熟。体外分化40 d时β-MHC基因表达水平明显提高，提示心肌细胞的心室肌亚型分化，因为该基因主要在心室及肌细胞中表达。已有研究表明，α-MHC基因表达水平的下降和β-MHC基因水平的上升是心衰时心肌收缩力减退的分子基础之一[26]，而此研究中，随着培养时间的延长，α-MHC基因表达水平逐渐升高，β-MHC基因表达水平逐渐降低，表明功能成熟的心肌水平升高。对于Cx-43基因表达水平获得了满意结果，分化40 d的分化心肌细胞和原代心肌细胞的Cx-43基因表达量是相当的，而Cx-43蛋白可支撑所有心肌细胞更好地收缩传导，并促进心肌细胞移植后与宿主细胞间电耦合，从而防止移植后心律失常的发生[27]。研究表明，通过加入电刺激或组织工程和机械应力调节的三维共培养系统[28-29]，分化心肌细胞表现出与成年心肌细胞相似的基因表达，因此可以设想，在三维共培养体系中加入电刺激，并且延长诱导分化时间，可以在该研究结果上进一步从基因层面提高分化心肌细胞成熟度。
分化心肌细胞的心脏蛋白检测结果与基因检测结果基本一致。NKX2.5是一种心脏早期分化标志物，心肌细胞成熟后不会随着培养时间的延长而表达增加，结果显示2个时间点的分化心肌细胞NKX2.5蛋白表达基本一致，均位于核周区。40 d时，分化心肌细胞CX-43基因的表达明显高于20 d，而CX-43蛋白在2个时间点的表达基本相同，虽然存在基因表达水平和蛋白表达水平的差异，但20 d时的CX-43蛋白仅表达于核周区(定位的不成熟模式)，而40 d时CX-43蛋白表达于除核周区的更多细胞结构内，也证明此时的心肌细胞更成熟，让相邻细胞间有间隙连接，这与之前的悬浮培养中加入抗坏血酸可以获得更多功能心肌细胞结果一致[30]。α-MHC和TNNT2的基因表达和蛋白表达完全一致，40 d的表达水平明显高于20 d，Ca2+-ATP酶基因(SERCA2a)表达水平也是40 d时高于20 d，因此分化心肌细胞在第40天时有更高的Ca2+浓度以及更强的心肌收缩力。尽管在荧光显微镜下未观察到核周线粒体聚集[31]，但线粒体形态和膜电位的异质性在40 d的分化心肌细胞中更为明显，此外，线粒体网状结构在体外培养中随着时间推移而转变，随着细胞的增大，细长的线粒体更加规则和密集分布在整个细胞中，这些改变可进一步满足自发跳动的心肌细胞对能量的需求。
研究结果证实，延长诱导分化时间，可以通过增加分化心肌细胞肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度，但研究也有相应的局限性，并未对分化心肌细胞的搏动性、离子通道水平和电生理功能进行鉴定，此外以后需要进一步研究分化心肌细胞对各种心脏疾病模型的治疗作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

体外培养时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞成熟度的影响

Effect of culture time in vitro on maturity of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

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