脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制

doi:10.12307/2025.524

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5296-5303.doi: 10.12307/2025.524

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脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制

陈振坤，朱世伟，肖竞楠，唐卫平

南华大学附属第一医院肝胆胰外科，湖南省衡阳市 421001

收稿日期:2024-02-27 接受日期:2024-05-14 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-17
通讯作者: 唐卫平，博士，主治医师，硕士生导师，南华大学附属第一医院肝胆胰外科，湖南省衡阳市 421001
作者简介:陈振坤，男，1997年生，湖南省常德市人，汉族，南华大学附属第一医院肝胆胰外科专业在读硕士，主要从事肝纤维化的基础与临床相关研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金项目(2021JJ40488)，项目负责人：唐卫平；湖南省卫生健康委员会课题(202202054239)，项目负责人：唐卫平

Mechanism of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes regulating autophagy of hepatic stellate cells

Chen Zhenkun, Zhu Shiwei, Xiao Jingnan, Tang Weiping

Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China

Received:2024-02-27 Accepted:2024-05-14 Online:2025-09-08 Published:2024-12-17
Contact: Tang Weiping, MD, Attending physician, Master’s supervisor, Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Chen Zhenkun, Master candidate, Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Hunan, No. 2021JJ40488 (to TWP); Subject of Hunan Health Commission, No. 202202054239 (to TWP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脂肪间充质干细胞：是从哺乳动物脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化能力的细胞亚群，对组织、器官有修复功能。
外泌体：是一种包含丰富脂质、蛋白和复杂核酸的亚细胞小泡，直径范围为40-160 nm，主要通过细胞内多泡体融合于细胞质膜后分泌至胞外基质。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞可释放大量外泌体参与各种病理生理过程，关于脂肪间充质干细胞源性外泌体对肝星状细胞自噬的影响以及具体机制还有待于深入研究。
目的：探讨脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p对肝星状细胞自噬的靶向调控作用及分子机制。
方法：收集8周龄雄性C57BL/6小鼠腹股沟区脂肪组织，使用胶原酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞，使用超速离心法提取脂肪间充质干细胞源性外泌体；取小鼠肝脏组织，使用胶原酶灌注消化法和密度梯度离心法分离提取肝星状细胞。实验分2组：对照组肝星状细胞常规培养48 h，外泌体组将肝星状细胞与脂肪间充质干细胞源性外泌体共培养48 h。通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光染色观察外泌体对肝星状细胞增殖活化、自噬及纤维化标志物表达的影响。RT-qPCR及Western blot检测外泌体对肝星状细胞中miR-15a-5p以及下游信号通路Bcl-2、Beclin-1和Rubicon mRNA和蛋白表达的影响。
结果与结论：①与对照组相比，外泌体组肝星状细胞中自噬标志物LC3-Ⅱ表达下降，自噬小体数目显著减少，脂滴重新生成，细胞体积减小同时增殖能力减弱，肝星状细胞活化明显受到抑制；②与对照组相比，外泌体组肝星状细胞中α-平滑肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达显著下降(P < 0.01)，miR-15a-5p表达显著增高(P < 0.01)，同时其下游靶基因Bcl-2表达显著下降(P < 0.01)，而自噬基因Beclin-1和Rubicon表达显著增高(P < 0.01)。结果提示：脂肪间充质干细胞源性外泌体通过miR-15a-5p靶向抑制肝星状细胞中Bcl-2表达，促进其下游自噬基因Beclin-1、Rubicon表达，从而抑制肝星状细胞自噬。

https://orcid.org/0009-0000-4960-6984 (陈振坤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪间充质干细胞, 外泌体, 肝星状细胞, 自噬, miR-15a-5p, Bcl-2, Beclin-1, Rubicon

Abstract: BACKGROUND: Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells release a large amount of exosomes to participate in various pathophysiological processes, but the impact and precise mechanism of exosomes derived from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on autophagy of hepatic stellate cells have not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To explore the targeted regulatory effect and molecular mechanism of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes on autophagy of hepatic stellate cells through miR-15a-5p.
METHODS: Adipose tissue was collected from inguinal region of 8-week male C57BL/6 mice. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were extracted by collagenase digestion. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes were extracted by ultracentrifugation. Mouse liver tissue was obtained, and hepatic stellate cells were isolated and extracted using collagenase perfusion digestion and density gradient centrifugation. The experiment was divided into two groups. In control group, hepatic stellate cells were cultured alone for 48 hours. In the exosome group, hepatic stellate cells were co-cultured with adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes for 48 hours. The effects of exosomes on hepatic stellate cell proliferation, activation, autophagy, and expression of fibrosis markers were detected by western blot assay, RT-qPCR, and immunofluorescence staining. RT-qPCR and western blot assay were used to detect the effect of exosomes on the mRNA and protein expression of miR-15a-5p and the downstream signaling pathway Bcl-2, Beclin-1, and Rubicon in hepatic stellate cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the ratio of autophagy markers LC3-II expression decreased, the number of autophagosome was also significantly decreased, and the intracellular lipid droplets were regenerated, simultaneously, cell volume diminished with the weakening of proliferation in hepatic stellate cells of the exosome group, indicated that the hepatic stellate cell activation was significantly inhibited. (2) Compared with the control group, the expressions of α-smooth actin and type I collagen were significantly decreased (P < 0.01), and the expression of miR-15a-5p was significantly increased in hepatic stellate cells of the exosome group (P < 0.01). At the same time, the expression of its downstream target gene Bcl-2 was significantly decreased (P < 0.01), while the expressions of autophagy genes Beclin-1 and Rubicon were significantly increased in hepatic stellate cells of the exosome group (P < 0.01). The results indicate that adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes inhibits the expression of Bcl-2 in hepatic stellate cells by targeting miR-15a-5p and increases the expression of downstream autophagy genes Beclin-1 and Rubicon, thereby inhibiting the autophagy of hepatic stellate cells.

Key words: ">adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, exosome, hepatic stellate cell, autophagy, miR-15a-5p, Bcl-2, Beclin-1, Rubicon

中图分类号:

陈振坤, 朱世伟, 肖竞楠, 唐卫平. 脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5296-5303.

Chen Zhenkun, Zhu Shiwei, Xiao Jingnan, Tang Weiping. Mechanism of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes regulating autophagy of hepatic stellate cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5296-5303.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞及ADSC-exo的鉴定结果 从小鼠脂肪组织获取脂肪间充质干细胞，培养72 h后倒置显微镜下观察见细胞贴壁生长，呈纺锤形，传代培养后选取第3代细胞经成脂肪诱导分化7 d，油红O染色可见细胞内脂滴呈红色，经成软骨诱导分化14 d，Alcian Blue染色阳性(图1A)。细胞免疫荧光染色提示Vimentin(波形蛋白)和N-cadherin(神经型钙黏蛋白)表达阳性，而血管内皮细胞标志物CD31呈阴性(图1B)。流式细胞仪检测显示间充质干细胞标志物CD29和CD90阳性，而血管内皮细胞共同标志物CD31和CD45阴性(图1C)，符合脂肪间充质干细胞的表型特征。
收集脂肪间充质干细胞的上清液，通过超速离心法分离提取上清液中的外泌体，透射电子显微镜观察外泌体呈现双层膜盘状囊泡的外形，形状为椭圆形或不规则圆形，均一性良好，大小基本分布在80-130 nm之间(图1D)。Western blot检测外泌体表面标志物CD63和CD81表达阳性(图1E)。
2.2 ADSC-exo抑制肝星状细胞活化 从小鼠肝组织中获取的肝星状细胞呈扁圆形，内含较多光亮的脂滴，折光性强，在327 nm波长下可见蓝色荧光(图2A左)，培养5 d后肝星状细胞体积增大，呈纤维细胞样形态，胞浆中脂滴明显减少，α-平滑肌肌动蛋白活化，细胞呈完全活化状态(图2A右)；PKH26标记的ADSC-exo与肝星状细胞共孵育48 h后，PKH26红色荧光标记的ADSC-exo与DAPI标记的蓝色荧光在肝星状细胞中共定位，而作为对照组的无外泌体培养基培养的肝星状细胞则未见红色荧光(图2B)，表明ADSC-exo可以被肝星状细胞所摄取。
ADSC-exo与肝星状细胞共孵育48 h后，肝星状细胞中可见脂滴形成，细胞体积缩小，提示肝星状细胞由活化型向静息型转化(图2C)。RT-qPCR结果显示外泌体组miR-15a-5p的表达量相较于对照组显著升高，提示ADSC-exo可能是通过携带并释放miR-15a-5p至肝星状细胞中，从而使肝星状细胞中的miR-15a-5p水平升高(P < 0.01，图2D)。CCK-8检测提示ADSC-exo与肝星状细胞共孵育4 d后，细胞活力较对照组有显著降低，由此说明ADSC-exo可明显抑制肝星状细胞的增殖能力(P < 0.01，图2E)。RT-qPCR和Western blot检测结果显示ADSC-exo处理后α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白表达显著下调(图2F-H)，提示肝星状细胞活化明显受抑制。

2.3 ADSC-exo通过miR-15a-5p抑制肝星状细胞自噬 通过生物信息学(TargetScanHuman7.2和Entrez Nucleotide数据库)预测Bcl-2的3’非编码区存在miR-15a-5p的结合位点(图3A)。双荧光素酶报告显示，与突变型Bcl-2相比，miR-15a-5p显著抑制了野生型Bcl-2的3’端非翻译区的转录荧光素酶活性(P < 0.01，图3B)。RT-qPCR和Western blot 检测结果显示外泌体组肝星状细胞中Bcl-2表达显著下调，而Beclin-1和Rubicon表达则显著上调，自噬标志物LC3-Ⅱ表达下降，自噬流降低(图3C，D)，由此说明细胞处于自噬受抑制状态。免疫荧光染色分析进一步印证了RT-qPCR和Western blot结果(图3E-G)。mRFP-GFP-LC3双荧光示踪观察自噬流改变结果显示，外泌体组的自噬小体(白色箭头)数目相比于对照组均有显著减少(图3H)，由此说明ADSC-exo可使肝星状细胞的自噬流降低，从而降低肝星状细胞自噬水平。结合肝星状细胞活化以及miR-15a-5p表达的改变(图2C，D)，提示外泌体可能是通过miR-15a-5p抑制肝星状细胞自噬。

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引言

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病发生发展的共同病理生理过程，如果未能及早发现和及时治疗，进展的肝纤维化可发展成为终末期肝病甚至肝癌，现阶段终末期的肝病治疗方式主要是肝移植，但器官移植存有诸多限制，包括缺乏合适的供者、费用昂贵、长期应用免疫抑制剂、各种致命的并发症等[1]。临床上亟需探索新的减轻肝脏炎症、改善纤维化和促进肝再生的治疗方法。
近年研究表明，基于干细胞移植的治疗方法可通过抑制肝脏炎症、促进肝细胞增殖及血管生成等途径修复肝脏组织，为肝纤维化的治疗提供了新的方向[2-3]。越来越多的证据表明干细胞移植后的疗效并不依赖于细胞的存活和增殖，而主要通过旁分泌细胞因子等途径发挥作用[4-5]。其中，脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)通过旁分泌途径产生的外泌体是一种具有脂质双层膜的纳米尺寸细胞外囊泡，外泌体中包含多种物质，如脂质、蛋白和多种miRNA等[6]，参与细胞代谢、凋亡、增殖、活化等多种病理及生理过程，在细胞间物质和信息的传递中起重要作用，将多种因子传递到肝内以维持内环境稳定[7-8]，但其作用机制仍未完全明确。研究表明，外泌体可将miRNA转移到肝组织中促进细胞增殖与新生血管形成，并修复肝脏损伤[9-11]。
miR-15a-5p广泛存在于肝脏细胞和组织中，可通过多种作用机制在细胞分化和周期调控、血管生成、炎症反应等病理生理过程中发挥重要调控功能[12-14]。
在解剖上，肝星状细胞与肝窦内皮细胞相邻，因此包括药物、病毒和脂质在内的各种刺激可触发外泌体在肝细胞和肝星状细胞之间的信息传递，调节肝星状细胞的增殖活化进而影响肝纤维化的进展[15]，而作为肝星状细胞活化的关键步骤，细胞自噬可通过降解肝星状细胞内脂滴为其活化提供能量，从而促进肝纤维化[16]。研究发现下调miR-15a-5p靶向基因可诱导肝星状细胞凋亡并减轻肝硬
化[17]。该研究通过体外细胞实验探索脂肪间充质干细胞源性外泌体(adipose mesenchymal stem cell-derived exosome，ADSC-exo)对肝星状细胞自噬的影响，明确ADSC-exo通过miR-15a-5p调控肝星状细胞自噬和活化的作用以及分子机制，为肝纤维化的治疗提供新的理论基础和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞培养实验。
1.2 时间及地点 实验于2022年10月至2023年12月在南华大学附属第一医院综合楼实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量22 g左右，购买自南华大学医学院实验动物中心，动物许可证号：SYXK(湘)2020-002，小鼠分笼饲养，人工控制光照(12 h∶12 h光/暗周期)，环境温度(22±2) ℃，相对湿度(55±10)%，自由给水和饵料，实验前适应环境1周。
此次实验严格遵守中华人民共和国科技部[2006]398号文件《关于善待实验动物的指导性意见》要求。实验方案经南华大学附属第一医院动物实验医学伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂及仪器 Ⅳ型胶原酶、PBS、Accutase 细胞消化液(美国Innovative Cell Technologies公司)；抗小鼠抗体CD29、CD31、CD45、CD63、CD81、CD90(美国BD公司)；α-MEM培养基、体积分数10%新生牛血清、成软骨诱导培养基、成脂肪诱导培养基、Alcian Blue、EdU试剂盒(上海Invitrogen 公司)；油红O、PKH26荧光细胞标记试剂盒(美国Sigma 公司)；α-平滑肌肌动蛋白抗体、Ⅰ型胶原蛋白抗体(德国Santa Cruz 公司)；70 μm孔径细胞筛(BD Biosciences公司)；RNA试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；全外泌体分离试剂盒(上海Invitrogen公司)；mRFP-GFP-LC3质粒(上海汉恒生物)；SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒(大连TaKaRa公司)。细胞超净工作台(苏州安泰科技有限公司)；CO2培养箱(赛默飞世尔科技)；细胞培养皿及孔板(NEST)；光学显微镜(XDS-1A)；倒置相差显微镜(奥林巴斯，IX71)；透射电镜(日本日立)；低速离心机(上海卢湘仪，TDZ4B-WS)；超高速离心机(日本日立)；Real-time检测仪(ABI-7500)；摇床(其林贝尔，TS-1000)；流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本基恩士公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 肝星状细胞、脂肪间充质干细胞培养及外泌体的提取和鉴定
(1)肝星状细胞分离培养：采用胶原酶灌注消化法和密度梯度离心法收集肝星状细胞。取小鼠肝脏组织，肝脏离体后，门静脉插管，Hank’s液灌洗，38 ℃ Ⅰ型胶原酶灌洗消化肝组织，有齿镊分离去除肝包膜，200 μm孔径细胞筛过滤，回收细胞悬液50×g低速离心3 min，回收上清，离心、回收反复循环3次，150×g离心10 min，吸弃上清液，用15% iodixanol溶液(ρ=1.084 g/mL)悬浮离心管底部的细胞团，上层缓慢添加8% iodixanol溶液(ρ=1.050 g/mL)，再在上层缓慢添加5 mL Hank’s液，1 400×g离心15 min，收集位于8% iodixanol和15% iodixanol溶液交界液面处的肝星状细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，每2 d换液1次，待细胞融合度约70%时消化传代处理。显微镜下观察细胞形态，328 nm波长紫外光激发细胞自发荧光，细胞免疫荧光染色法检测肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白的表达
情况。
(2)脂肪间充质干细胞分离培养：取小鼠腹股沟区皮下脂肪组织，PBS冲洗3遍，剪碎后加入1 mg/mL Ⅳ型胶原酶混匀消化1 h，70 μm孔径细胞筛过滤后离心，以2×105/cm2密度接种于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基的25 cm2培养瓶中，每2 d换液1次，待细胞融合度达70%-80%时消化传代处理，取第3代细胞进行鉴定和使用。
细胞表型检测：细胞用Accutase消化酶消化后分别加入CD29及CD45抗体各10 μL，同型对照管分别加入IgG-FITC或者IgG-PE作阴性对照，4 ℃遮光反应30 min，400×g离心5 min后流式细胞仪上机检测。
细胞免疫荧光染色：细胞固定后透化，封闭，分别加一抗Vimentin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)、CD31 (1∶1 000)于湿盒4 ℃孵育过夜，清洗后加FITC标记二抗(1∶1 000)，室温下孵育2 h，清洗后DAPI染色。
细胞分化能力检测：细胞以1×105/孔密度接种于6孔板，待达到80%汇合后，分别用成软骨诱导培养基及成脂肪诱导培养基培养。成脂诱导培养7 d后行油红O染色；成软骨诱导培养14 d后行Alcian Blue染色。
(3)外泌体分离鉴定：第3代脂肪间充质干细胞培养72 h后，收集细胞上清液，3 000×g离心15 min，弃去细胞和细胞碎片，参照外泌体提取试剂说明书按1∶4比例加入外泌体提取试剂，混匀后4 ℃过夜，1 500×g离心30 min，弃上清，再1 500×g离心5 min，小心吸弃上清，沉淀即为外泌体，纯化后的外泌体以PBS重悬分装，-80 ℃保存。透射电子显微镜观察外泌体形态；通过BCA法蛋白定量后用Western blot鉴定外泌体表面标记物CD63和CD81表达量。
(4)肝星状细胞摄取外泌体示踪：用0.5 mL稀释液C悬浮ADSC-Exo，加入PKH26荧光染料应用液，吹打混匀，孵育后加α-MEM完全培养基终止反应，离心并洗涤，将PKH26荧光标记后的ADSC-Exo与肝星状细胞避光共培养48 h，PBS洗涤，DAPI染色，荧光显微镜观察。
1.4.2 CCK-8检测 采用CCK-8法测定ADSC-exo对肝星状细胞增殖能力的影响。按照1×105/孔的密度将肝星状细胞接种于96孔板中，培养24 h后，外泌体组加入ADSC-exo(20 μL/mL)，对照组常规培养，每组每个时间点4个复孔，分别在第1，2，4，6天，每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h，酶标仪测定450 nm处吸光度值。
1.4.3 实验分组 实验分2组：对照组和外泌体组。肝星状细胞接种于24孔板中，每孔1×105个细胞，培养24 h后更换培养基，外泌体组加入ADSC-exo(20 μL/mL)共培养48 h，对照组常规培养48 h，无特殊处理。
1.4.4 Western blot检测各组肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、LC3、Bcl-2、Beclin-1和Rubicon蛋白表达水平 RIPA裂解液分别提取各组肝星状细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜并室温下封闭1 h，清洗后加入一抗4 ℃孵育过夜，一抗分别为α-平滑肌肌动蛋白抗体(1∶1 000)、Ⅰ型胶原蛋白抗体(1∶500)、LC3抗体(1∶1 000)、Bcl-2抗体(1∶500)、Beclin-1抗体(1∶500)、Rubicon抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)，清洗3次，每次5 min，室温下孵育二抗1 h，二抗为Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP(1∶5 000)、Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP(1∶5 000)，清洗3次，每次5 min，最后用Bio-Rad图像系统曝光拍照和Image J软件行定量分析。
1.4.5 RT-qPCR检测各组肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、miR-15a-5p、Bcl-2、Beclin-1和Rubicon mRNA表达水平 TRIzol提取各组肝星状细胞总RNA，反转录成cDNA，按照系列反应条件进行荧光定量PCR反应：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环，操作按照SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒说明书进行。引物序列见表1。

1.4.6 免疫荧光法 两组肝星状细胞固定后透化处理，封闭，滴加Bcl-2(1∶500)、Beclin-1(1∶500)、Rubicon一抗(1∶1 000)于湿盒4 ℃孵育过夜，清洗3遍，加FITC标记二抗(1∶1 000)，室温下孵育2 h，清洗后DAPI染色，荧光显微镜下观察。

1.4.7 双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染示踪法 按1×105/孔的密度将两组肝星状细胞接种于24孔板，融合度达60%-70%时加入自噬双标慢病毒RFP-eGFP-LC3质粒转染24 h，荧光显微镜下观察肝星状细胞中自噬小体和自噬溶酶体的形成情况，评估ADSC-exo对自噬流的影响。
1.4.8 生物信息学分析 通过Entrez Nucleotide数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)找到小鼠源性和人源性Bcl-2 3’非编码区的序列，通过TargetScanHuman 7.2(www.targetscan.org)和(www.micorrna.org)数据库对miR-15a-5p和Bcl-2 3’非编码区结合位点进行预测。
1.5 主要观察指标 ①ADSC-exo对小鼠肝星状细胞自噬的影响；②验证miR-15a-5p和Bcl-2之间的靶向关系；③ADSC-exo中miR-15a-5p靶向Bcl-2对自噬基因Beclin-1和Rubicon及相关蛋白表达的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。图表均采用GraphPad PRISM Version 6.0软件进行绘制。数据以x±s表示，分别进行组间独立t 检验，多样本均数比较采用方差分析。P < 0.01为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南华大学衡阳医学院生物统计学专家审核。

讨论

自噬参与机体的正常免疫、感染和炎症反应等生理或病理过程，但自噬相关基因的改变会引起其功能紊乱[16]。肝损伤后氧自由基和炎症物质产生，随后巨噬细胞和其他炎症细胞因子均被激活、募集到损伤部位，最终引发自噬，激活肝星状细胞并使其向成纤维细胞分化[18]，
自噬是肝星状细胞活化的关键步骤，而肝星状细胞活化是肝纤维化的重要始动环节[19]。外泌体对肝星状细胞活化发挥重要的调控作用，表现在通过减少肝脏炎症、上调肝细胞再生等途径抑制肝星状细胞激活，然而目前机制仍然不明确[15]。该研究发现ADSC-exo使纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达下降，自噬小体显著减少，肝星状细胞的自噬及活化受抑制，进而抑制了肝纤维化的进展。因此，研究ADSC-exo和肝星状细胞自噬之间的联系，对于有效抑制肝星状细胞活化有积极的意义。
该研究从小鼠脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞，然后从中提取外泌体，并研究ADSC-exo对小鼠肝星状细胞自噬的影响，明确ADSC-exo在肝纤维化中的治疗潜力。外泌体内含有的脂质、蛋白和核酸含量丰富，作为一种高效的细胞间通讯物质而被广泛关注[20-22]。该实验探讨ADSC-exo对肝星状细胞自噬的影响以及具体作用机制和信号通路，将ADSC-exo与肝星状细胞共培养，对比发现ADSC-exo处理后肝星状细胞中脂滴重新聚集，细胞体积缩小，表明肝星状细胞活化受到抑制，同时观察到ADSC-exo干预肝星状细胞后自噬小体显著减少，提示ADSC-exo对肝星状细胞自噬过程有明显抑制作用，而其中机制可能与miRNA相关。miRNA能够调节肝脏的生理和病理功能，其表达与肝代谢、肝损伤、肝纤维化以及肝癌发展相关[23]。该研究通过生物信息学数据库预测Bcl-2 的3’非编码区存在miR-15a-5p的结合位点。最近有多项研究报道了miR-15a-5p在不同脏器纤维化中具有不同作用，miR-15a-5p通过靶向Smad7调节心肌纤维化[24]，miR-15a-5p过表达能减少外界因素诱导的自噬[25]，也可通过促进miR-15a-5p调节血管内皮生长因子发挥抗腹膜间皮细胞纤维化作用等[26]。为进一步明确miR-15a-5p对肝星状细胞自噬的具体影响及相关的作用机制，该实验发现与ADSC-exo共培养后肝星状细胞中miR-15a-5p的表达显著提升，下游靶基因Bcl-2表达显著下调，进一步检测显示自噬基因Beclin-1和Rubicon表达显著上调，Rubicon是一种RNA结合蛋白，可通过促进 Beclin-1 的泛素化和降解来抑制细胞自噬，另外，Rubicon还可与其他蛋白质如Bcl-2家族蛋白相互作用，进一步调节细胞凋亡和自噬的平衡。而Beclin-1被认为是Bcl-2/Beclin-1/Rubicon信号通路中的关键环节，参与调控细胞自噬[27]。自噬标志物LC3-Ⅱ表达下调，说明细胞自噬受抑制，验证了可能是ADSC-exo中miR-15a-5p通过靶基因Bcl-2影响下游自噬基因Beclin-1和Rubicon的表达这一实验设想，为进一步研究ADSC-exo作为治疗肝纤维化的潜在方法提供了实验依据。
该研究还存在一定局限性：仅在体外细胞实验证实了ADSC-exo通过miR-15a-5p靶向下游自噬基因调节肝星状细胞的自噬，还需深入研究确定miR-15a-5p的作用并且需在肝纤维化动物模型中进行多方位实验验证；其次，肝纤维化患者外周血外泌体中miR-15a-5p表达水平等相关指标的临床指导性意义还有待进一步分析和确定。
综上，该研究对ADSC-exo调控miR-15a-5p对小鼠肝星状细胞自噬的影响进行了相关实验验证，明确了外泌体微环境中miR-15a-5p抑制肝星状细胞自噬的信号通路，验证了肝星状细胞中Bcl-2是miR-15a-5p的直接靶点，ADSC-exo通过携带并释放miR-15a-5p至肝星状细胞中，靶向抑制Bcl-2表达，继而使其下游自噬基因Beclin-1/Rubicon表达上调，抑制肝星状细胞自噬和活化，继而起到抑制肝纤维化病理过程的效果。
ADSC-exo可参与多种肝脏病理生理过程，对于肝脏疾病的发生发展、治疗等方面具有重要价值和广阔的应用前景[28-30]。该研究为延缓肝纤维化的作用提供了新的分子机制研究和治疗思路。随着外泌体基础以及临床应用相关研究技术的发展，基于干细胞来源外泌体的临床应用有望为肝纤维化患者提供新的治疗选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪间充质干细胞来源外泌体调节肝星状细胞自噬的机制

Mechanism of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes regulating autophagy of hepatic stellate cells

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