Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径

doi:10.12307/2025.269

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (6): 1183-1191.doi: 10.12307/2025.269

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Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径

贺光辉1，原杰1，柯燕琴1，丘小婷1，张晓玲1，2

1山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001；2上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092

收稿日期:2024-01-25 接受日期:2024-03-07 出版日期:2025-02-28 发布日期:2024-06-21
通讯作者: 张晓玲，博士，教授，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001；上海交通大学医学院附属新华医院骨科，上海市 200092
作者简介:贺光辉，男，1997年生，湖南省衡阳市人，山西医科大学在读硕士，主要从事干细胞与骨关节炎防治的研究。
基金资助:
山西省重点研发项目(201903D321097)，项目负责人：张晓玲

Hemin regulates mitochondrial pathway of oxidative stress in mouse chondrocytes

He Guanghui1, Yuan Jie1, Ke Yanqin1, Qiu Xiaoting1, Zhang Xiaoling1, 2

1Department of Orthopedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, China

Received:2024-01-25 Accepted:2024-03-07 Online:2025-02-28 Published:2024-06-21
Contact: Zhang Xiaoling, MD, Professor, Department of Orthopedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Department of Orthopedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200092, China
About author:He Guanghui, Master candidate, Department of Orthopedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
Key Research and Development Project of Shanxi Province, No. 201903D321097 (to ZXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Hemin：是一种富含铁的卟啉化合物，同时也是血红素加氧酶(HO-1)的诱导剂。它具备多种功效，包括细胞保护、抗氧化、免疫调节、促血管生成和抗炎等多种作用。Hemin已成功应用于临床，成为治疗急性卟啉病的重要药物。
氧化应激：是指细胞内产生过多的氧化物质(如自由基)，导致细胞内的氧化还原平衡被破坏，从而引发一系列不利的生物学效应。这些氧化物质可以损害细胞的脂质、蛋白质和DNA，进而导致细胞损伤、凋亡和炎症，参与多种疾病的发生和发展。

背景：研究显示线粒体氧化应激在膝骨关节炎发生发展中具有重要作用，Hemin可以调控线粒体相关蛋白的表达。
目的：研究Hemin对小鼠软骨细胞氧化应激的调控及其在膝骨关节炎中的干预作用及机制。
方法：①体外细胞实验：提取C57BL/6小鼠的原代软骨细胞，采用10 ng/mL的白细胞介素1β诱导构建体外骨关节炎软骨细胞模型，使用CCK-8法确定Hemin(0，1，10，20，40，80，160 μmol/L)干预小鼠软骨细胞的最适浓度。将软骨细胞随机分为正常组、模型组(白细胞介素1β)、Hemin组(白细胞介素1β+Hemin)。检测各组软骨细胞的活性氧、线粒体膜电位和凋亡情况。②动物体内实验：将成年C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组(骨关节炎)，Hemin(骨关节炎+Hemin)组，每组8只，Hemin治疗4周后观察小动物行为学及膝关节病理组织形态学变化，检测软骨组织细胞外基质相关蛋白表达及软骨组织细胞凋亡的变化，检测软骨组织Nrf2/HO-1蛋白的表达水平。
结果与结论：①体外细胞实验：Hemin作用于原代软骨细胞的最适浓度为40 μmol/L，经过Hemin处理的白细胞介素1β诱导的软骨细胞相对于模型组活性氧水平明显较少，线粒体膜电位明显有改善，软骨细胞凋亡减少。②动物体内实验：Hemin治疗4周后，与模型组比较，Hemin组的小鼠下肢功能明显转好，组织病理学评分显著改善，膝关节软骨细胞凋亡明显减少。③结果表明，Hemin可以缓解白细胞介素1β诱导下的小鼠软骨细胞氧化应激，恢复线粒体功能，减少细胞凋亡。Hemin可以改善膝骨关节炎细胞外基质降解、促进软骨细胞合成代谢、降低分解代谢及减少软骨细胞凋亡，可能是通过激活炎症环境中软骨细胞Nrf2/HO-1信号通路发挥的作用。
https://orcid.org/0000-0003-1948-1628(贺光辉)；https://orcid.org/0000-0002-0134-1347(张晓玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, Hemin, 氧化应激, 线粒体, 细胞凋亡, 软骨损伤

Abstract:
BACKGROUND: Studies have shown that mitochondrial oxidative stress has an important role in the development of knee osteoarthritis, and Hemin can regulate the expression of mitochondria-related proteins.
Objective: To study the regulatory effect of Hemin on oxidative stress in mouse chondrocytes and its interventional effect and mechanism in knee osteoarthritis.
METHODS: (1) In vitro cell experiment: Primary chondrocytes from C57BL/6 mice were extracted and induced with 10 ng/mL interleukin-1β to construct an in vitro chondrocyte model of osteoarthritis. The optimal concentration of Hemin (0, 1, 10, 20, 40, 80, and 160 μmol/L) for the intervention in mouse chondrocytes was determined by cell counting kit-8 method. Chondrocytes were randomly divided into control group, model group (interleukin-1β) and Hemin group (interleukin-1β+Hemin). Reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential and apoptosis of chondrocytes in each group were detected. (2) In vivo experiment: Adult C57BL/6 mice were randomly divided into normal group, model group (osteoarthritis) and Hemin group (osteoarthritis+Hemin), with eight mice in each group. After 4 weeks of Hemin treatment, the behavioral test and histopathological observation of the knee joint were performed in each group. Changes in extracellular matrix-related protein expression and apoptosis in chondrocytes and the expression level of Nrf2/HO-1 protein in cartilage tissue were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro experiment: the optimal concentration of Hemin on primary chondrocytes was 40 μmol/L. Compared with the model group, the level of reactive oxygen species was significantly reduced, the mitochondrial membrane potential was significantly improved, and the apoptosis of chondrocytes was reduced in the hemin-treated interleukin-1β-induced chondrocytes. In vivo experiment: After 4 weeks of treatment, compared with the model group, the lower limb function of mice in the Hemin group was significantly improved, the histopathological score was significantly improved, and the apoptosis of knee chondrocytes was significantly reduced. All these findings indicate that Hemin can alleviate oxidative stress, restore mitochondrial function and reduce apoptosis in mouse chondrocytes induced by interleukin-1β. Hemin can improve extracellular matrix degradation, promote chondrocyte anabolism, reduce catabolism and reduce chondrocyte apoptosis in knee osteoarthritis. It may act by activating the chondrocyte Nrf2/HO-1 signaling pathway in the inflammatory environment.

Key words: knee osteoarthritis, Hemin, oxidative stress, mitochondria, apoptosis, cartilage injury

中图分类号:

贺光辉, 原杰, 柯燕琴, 丘小婷, 张晓玲. Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1183-1191.

He Guanghui, Yuan Jie, Ke Yanqin, Qiu Xiaoting, Zhang Xiaoling. Hemin regulates mitochondrial pathway of oxidative stress in mouse chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(6): 1183-1191.

图/表（结果） 9

2.1 Hemin对软骨细胞的活性影响 0，1，10，20，40 μmol/L 的Hemin(分子式见图1A)处理24 h后对小鼠软骨细胞活力没有差异，但是80，160 μmol/L 的Hemin对小鼠软骨细胞活力有显著差异，见图1B。因而后续细胞实验选择Hemin的浓度为40 μmol/L。
2.2 各组软骨细胞活性氧水平与正常组相比，模型组软骨细胞活性氧水平相对绿色荧光升高；相较于模型组，Hemin组软骨细胞活性氧水平相对绿色荧光降低，见图 2。结果表明Hemin能够降低炎症因子白细胞介素1β对小鼠软骨细胞的活性氧水平。
2.3 各组软骨细胞线粒体膜电位水平与正常相比，模型组软骨细胞线粒体膜电位水平降低；与模型组相比，Hemin组软骨细胞线粒体膜电位水平升高，见图 3。结果说明Hemin可以增加炎症因子白细胞介素1β作用的软骨细胞线粒体膜电位水平。
2.4 各组软骨细胞凋亡情况采用流式细胞术进行小鼠软骨细胞凋亡检测，结果发现，经白细胞介素1β处理后软骨细胞凋亡数量明显增加(P < 0.001)，而给予Hemin治疗后软骨细胞凋亡水平降低(P < 0.001)，表明经Hemin处理可以缓解白细胞介素1β诱导的软骨炎症，见图4。结果说明Hemin可以降低炎症因子白细胞介素1β对软骨细胞凋亡的影响。
2.5 实验动物情况分析实验选用C57BL/6J雄性小鼠24只，随机分为3组，实验过程中动物无脱失，全部纳入结果分析。
2.6 各组小鼠行为学分析治疗4周后使用CatWalk进行小鼠步态分析，小鼠自由通过固定跑道时能清晰记录四肢印记，见图5A，B。正常组小鼠节律整齐的通过固定跑道；模型组小鼠在通过跑道时节律紊乱，右后肢触地面积变少；与模型组相比，Hemin组小鼠下肢步态节律更齐，有显著的恢复效果，见图5C。进一步分析发现模型组形成后局部痛阈减小，小鼠触地面积以及摆动的时间减少，见图5D，Hemin组治疗后小鼠功能显著恢复。
2.7 各组小鼠膝关节软骨组织病理学变化见图6。
2.7.1 苏木精-伊红染色结果显示，模型组的膝关节表面非常粗糙，软骨下骨暴露于关节面，而Hemin组减少了关节表面的磨损，恢复了一定的软骨层，软骨表面相对平整光滑，软骨组织病理学表现有所改善，见图6A。根据Mankin’s评分从软骨结构、软骨细胞、软骨基质细胞染色和潮线完整性4个方面定量损伤结果，与正常组相比模型组的Mankin’s评分显著升高，而Hemin组的Mankin’s评分均显著降低，见图6C。
2.7.2 番红O-固绿染色结果显示，模型组小鼠骨关节炎有明显的软骨损伤，与正常组小鼠相比，模型组小鼠膝关节软骨退变和侵蚀、以及番红O染色强度降低；相反，Hemin治疗可以恢复番红O染色强度，改善其他病理学变化，预防软骨损伤，见图6B。使用OARSI评分从软骨基质丢失、软骨损伤面积占比、垂直裂隙延伸长度不同程度等方面的软骨退变来定量损伤后，结果发现Hemin治疗显著降低了OARSI评分，见图6D。
2.8 各组小鼠软骨组织细胞外基质相关蛋白表达相对于正常组，模型组的软骨组织中Ⅱ型胶原表达显著降低，而基质金属蛋白酶13表达则显著升高；与模型组相比，Hemin组的Ⅱ型胶原表达均显著升高，基质金属蛋白酶13表达显著降低，见图7。结果表明Hemin能够提高骨关节炎软骨的合成代谢，同时降低其分解代谢，改善骨关节炎软骨退变。
2.9 各组小鼠软骨组织细胞凋亡变化与正常组相比，模型组软骨组织中凋亡软骨细胞显著增加；与模型组相比，Hemin组的凋亡软骨细胞显著均显著下降，见图 8。结果表明Hemin可以减少骨关节炎软骨细胞的凋亡数量。
2.10 各组小鼠软骨细胞Nrf2/HO-1蛋白的表达与正常组相比，模型组软骨细胞中HO-1、Nrf2蛋白表达水平均显著下降，与模型组相比，Hemin组HO-1、Nrf2蛋白表达水平均显著上升，见图 9。结果表明Hemin可以激活炎症环境中软骨细胞的Nrf2/HO-1信号通路。

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引言

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，这一疾病在全球范围内造成了巨大的健康和经济负担。据世界卫生组织的数据，骨关节炎是导致残疾和健康丧失的主要原因之一，在65岁以上人群中尤为常见[1-2]。骨关节炎的症状包括关节疼痛、僵硬、肿胀和功能受限等，严重影响了患者的生活质量。随着人口老龄化的加剧，骨关节炎的发病率呈上升趋势，进一步加重了医疗资源的压力[3]。膝关节是骨关节炎的常见部位之一，也是临床上最受关注、研究最多的受累关节之一[4]。目前，针对膝骨关节炎的治疗方法包括药物治疗、物理疗法、手术治疗等多种手段。但现有这些治疗方法主要旨在减轻症状，临床上还没有令人满意的药物或治疗方法来预防或延缓骨关节炎的进展[5]。因此，寻找更为有效、安全的治疗方法成为当前研究的焦点之一。靶向治疗作为一种新的治疗策略，针对骨关节炎的特定靶点进行干预，有望提供更为个性化、精准的治疗方案，从而取得更好的临床效果。
尽管许多病因已被证明与骨关节炎的进展有关，但其潜在机制仍有待完全阐明。骨关节炎是一种慢性炎症性疾病，其发病机制涉及到炎症反应、软骨损伤和关节组织退变等多个方面，在这些过程中，氧化应激可导致关节组织中氧自由基和活性氧物质的生成增加，进而引发炎症反应。这些活性氧物质会损伤细胞膜、蛋白质和DNA，促进炎症细胞的活化和炎症递质的释放，进而导致关节组织的炎症性损伤和疼痛[6]。氧化应激还会直接影响关节软骨的健康，可以促进蛋白质的氧化和酶的活化，导致软骨细胞的凋亡和细胞外基质的降解，干扰软骨细胞的代谢和功能，影响其合成和修复能力，从而加速关节软骨的退变和损伤[7]。软骨细胞的氧化应激主要是由创伤、超负荷、滑膜炎症和局部关节内病变等外源因素在细胞中生成或积累大量的活性氧而产生的[8]。活性氧过量产生及氧化还原稳态失衡可诱发严重氧化应激，是造成骨关节炎患者关节功能减退的主要病理基础之一。氧化应激、细胞凋亡和炎症是骨关节炎整个发病过程中不可或缺的因素[9]。降低氧化应激水平可有效抑制软骨细胞凋亡，改善软骨退化等骨关节炎临床症状。因此，靶向软骨细胞相关氧化应激和凋亡信号通路的药理学调节可能是缓解骨关节炎的一种非常有前途的治疗策略。
Hemin是含铁的卟啉化合物，也是血红素加氧酶的诱导剂，近年来，Hemin已在临床上用来治疗急性间歇性卟啉病[10]。作为一种衍生自血红素的化合物，有研究表明Hemin具有多种药理活性，包括细胞保护、抗氧化、免疫调节、促血管生成和抗炎作用[11]。此外，Hemin也已被证明在各种细胞和组织损伤模型中具有治疗作用，包括心脑血管疾病、脑卒中、系统性红斑狼疮和炎症性肠病[12-13]。但是到目前为止，Hemin对白细胞介素1β诱导的软骨损伤的作用效果及其机制尚未被研究。鉴于骨关节炎的发病机制涉及炎症反应和氧化应激过程，假设Hemin可能具有潜在的治疗骨关节炎的效果，可能通过调节炎症和氧化应激的生物学过程来改善骨关节炎的症状和疾病进展。
此项研究的目的是阐明Hemin对白细胞介素1β诱导下软骨细胞的氧化应激和凋亡情况，探究其对内侧半月板不稳(destabilization of the medial meniscus，DMM)模型诱导的C57BL/6J小鼠软骨损伤的保护作用，并揭示其潜在的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验和随机对照动物实验。结果数据进行t检验、单因素方差分析、秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2023年6-12月在山西医科大学第二医院骨科基础实验室和动物房完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择SPF级8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠24只，体质量25-30 g；8周龄C57BL/6J雌鼠生产后 3-5 d的新生鼠用于提取小鼠软骨细胞。实验动物购自山西医科大学迎泽校区实验动物中心，使用许可证号：SYXK(晋)2019-0009。小鼠购进后适应性喂养 1周，12 h/12 h 交替明暗光照，所有雄性小鼠随机分为正常组、模型组、Hemin组，每组 8 只。饲养环境温度 18-25 ℃，湿度 50%-60%，自由进食水。动物实验获得山西医科大学第二医院动物福利伦理委员会批准(伦理备案号：DW2023013)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，所有操作最大限度地减少其痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂 Hemin(纯度≥98.0%，16009-13-5)购自美国MCE公司；PBS(KGL2206-500)、胎牛血清(KGL2303-100)、双抗(KGL2303-100)、F12培养基(KGL1305-500)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；改良番红O-固绿软骨染色试剂盒(G1371)、苏木精伊红染色试剂盒(G1120)、胶原酶Ⅱ(C8150)购自北京索莱宝科技公司；Ⅱ型胶原抗体(ab34712)、基质金属蛋白酶13抗体(ab219620)购自英国Abcam公司；DAB显色试剂盒(ZLI-9017)、酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(PV-6000)购自北京中杉金桥生物有限公司；血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)抗体(PA5-77833)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)抗体(PA5-27882)和 GAPDH抗体(MA1-16757)购自美国赛默飞公司。
1.3.3 主要仪器细胞培养箱(BB150)购自美国Thermo公司；荧光倒置显微镜(DMi8)购自德国Leica公司；酶标仪(HBS-1096A)购自南京德铁实验设备有限公司；高速离心机(5810R)购自德国Eppendorf公司；石蜡切片机(ArcadiaH+C)购自德国Leica公司；小动物步态分析仪(XR-XFP101)购自北京诺达思公司。
1.4 实验方法
1.4.1 提取小鼠原代软骨细胞体外分离培养小鼠软骨细胞：用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉新生小鼠，脱颈处死后浸入体积分数75%乙醇中消毒，在细胞超净工作台中操作，解剖取出膝关节组织剪碎并置于浓度为0.2%Ⅱ型胶原酶中，在37 ℃、150-200 r/min的摇床中消化3 h；于 37 ℃ 1 200 r/min 离心10 min 后去掉上清液，以PBS洗涤细胞沉淀，1 200 r/min 离心5 min去掉上清液，以含体积分数10% 胎牛血清的 F12培养基重悬细胞沉淀接种于培养瓶培养细胞。
1.4.2 制备小鼠软骨细胞体外骨关节炎模型取传至第2代的小鼠软骨细胞以每孔1×104的密度接种在96孔板中，每孔培养液100 μL，培养 24 h 后以终质量浓度为10 ng/mL的白细胞介素1β处理24 h。
1.4.3 CCK-8检测取传至第2代的小鼠软骨细胞，以每孔1×104的密度接种在96孔板中，每孔培养液100 μL，同时用0.1%二甲基亚砜溶解后终浓度为0，1，10，20，40，80，160 μmol/L的Hemin分别处理软骨细胞，24 h后采用CCK-8试剂盒测定不同浓度处理组的细胞在A450的吸光度值，具体参照说明书中指导步骤进行。
1.4.4 活性氧检测取传至第2代的小鼠软骨细胞，以每孔4×105的密度接种在24孔板中，每孔培养液500 μL。培养 24 h后将细胞进行分组：正常组(正常小鼠软骨细胞)、模型组、Hemin组，后两组细胞分别加入白细胞介素1β(10 ng/mL)和白细胞介素1β(10 ng/mL)+Hemin(40 μmol/L)处理，所有细胞均在37 ℃、5%CO2环境下培养。24 h后采用活性氧检测试剂盒中荧光探针DCFH-DA进行检测，具体参照说明书中指导步骤进行，采用荧光倒置显微镜观察各组细胞并摄制图片。细胞内活性氧使无荧光的DCFH氧化成有荧光的DCF。
1.4.5 线粒体膜电位检测以每孔4×105的密度接种在24孔板中，每孔培养液500 μL。培养24 h后按照不同分组加入白细胞介素1β和Hemin处理(同1.4.4)，24 h后采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)中荧光探针JC-1进行检测，具体参照说明书中指导步骤进行，采用荧光倒置显微镜观察各组细胞并摄制图片。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。
1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡以每孔4×105的密度接种在24孔板中，每孔培养液500 μL。培养24 h后按照不同分组加入白细胞介素1β和Hemin处理(同1.4.4)，24 h后用无ETDA胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min收集细胞，用结合缓冲液重悬细胞为5×108 L-1，取500 μL细胞重悬液，依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI轻轻混匀，避光放置10 min，流式细胞仪上机进行检测，分析细胞凋亡率。
1.4.7 Western blot 检测以每孔4×105的密度接种在24孔板中，每孔培养液500 μL。培养24 h后按照不同分组加入白细胞介素1β和Hemin处理(同1.4.4)，24 h后吸去培养液，PBS冲洗3次，用含有1% PMSF 的RIPA 缓冲液裂解细胞。约 20 μg蛋白质在10% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后用一抗和二抗依次孵育。使用增强化学发光检测系统对免疫印迹进行显色。用于Western blot印迹分析的一抗包括HO-1、Nrf2和 GAPDH(稀释倍数1∶500)。HRP结合的二级抗体的稀释倍数为1∶5 000。使用增强化学发光检测系统检测抗体复合物。

1.4.8 小鼠膝关节炎造模及处理小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠 (2 mL/kg) 进行麻醉，俯卧位固定于手术台上，刮除膝关节局部鼠毛，碘伏消毒。正面切开膝关节皮肤，可看到白色的肌腱组织，切开肌腱内侧肌肉，将肌腱拨到膝关节靠外侧且固定，另一侧皮肤肌肉也固定，以看到内侧半月板为准，将内侧半月板用刀片挑起切断，造成内侧半月板不稳定，缝合膝关节肌肉以及皮肤；正常组小鼠同部位只打开关节囊，不切断内侧半月板，缝合膝关节肌肉以及皮肤。在进行了2周的观察后，对小鼠手术侧膝关节病变进行了评估，判定标准为：手术后膝关节出现屈伸运动步态功能障碍和膝关节组织肿胀，确认模型成功建立。

确认建模成功后，Hemin组向小鼠造模侧膝关节腔内注射100 μmol/kg的Hemin生理盐水溶液，正常组和模型组在膝关节同侧同法注射等量的生理盐水，频率为每4 d注射 1次，共干预4周。干预结束后，通过过量麻醉小鼠(2%戊巴比妥钠，8 mL/kg)，剪开右侧膝关节皮肤肌肉，剥离膝关节，收集膝关节标本，并将其置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，以进行后续的处理。

1.4.9 小鼠步态分析治疗4周后，采用小动物步态分析仪(CatWalk)检测小鼠功能恢复情况。避光条件下小鼠适应周围环境，将小鼠放置于提前设定好跑道宽度、摄像机位置、摄像机增益、红光电压、绿光电压、绿光强度阈值、采集速度范围、采集脚印数量、采集持续时间范围等小鼠步态参数的小动物步态分析仪跑道上，小鼠匀速通过固定检测区域跑道时，依据小鼠通过固定跑道时四肢产生的压力检测通过跑道过程中小鼠步态特征步频、周期、节律、足底压力、触地面积及站立时间等。每组测量数据重复3次，取平均值作为测量结果。
1.4.10 苏木精-伊红染色小鼠膝关节软骨组织在甲醛中固定24 h后，进行组织脱钙、脱水、石蜡包埋、切片处理。对组织切片经过常规脱蜡、脱水后，苏木精染色3 min，自来水冲洗5 min，盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗10 min(返蓝)，伊红30 s，乙醇梯度脱水，二甲苯透明5 min，并使用中性树脂进行封固。通过光学显微镜观察关节软骨的病理学变化，并采用 Mankin’s 病理评分法对关节软骨的病理损伤程度进行评估[14]。
1.4.11 番红O-固绿软骨染色小鼠膝关节软骨组织在甲醛中固定24 h后，进行组织脱钙、脱水、石蜡包埋、切片处理。对组织切片经过常规脱蜡、脱水后，滴加铁苏木素染色液3 min，自来水冲洗20 s，酸性分化液分化15 s，自来水冲洗5 min，滴加固绿染色液5 min，弱酸溶液洗涤切片15 s，番红染色液内浸染5 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明5 min，并使用中性树脂进行封固。通过光学显微镜观察关节软骨的病理学变化，并采用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分法评估关节软骨病理损伤的程度[15]。
1.4.12 免疫组化法检测关节软骨组织中Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13的表达组织切片经过常规脱蜡、脱水后，37 ℃胃蛋白酶抗原修复45 min，清洗3次后山羊血清封闭1 h，滴加兔抗小鼠Ⅱ型胶原(Col2a1)及基质金属蛋白酶13抗体 (稀释比均为1∶100)，4 ℃孵育过夜；次日用PBS冲洗3次，滴加HRP标记广谱二抗，湿盒孵育60 min，配置DAB染色，观察到切片有颜色改变时，立即用自来水洗去染色液，苏木精复染3 min，然后显微镜下观察。使用Image pro plus 软件对图像进行半定量分析。
1.4.13 Tunel染色将组织切片经常规脱蜡、水化后，采用Tunel检测试剂盒检测膝关节软骨组织中凋亡细胞的数量，根据试剂盒说明书操作。
1.5 主要观察指标 ① Hemin对软骨细胞的活性影响；②各组软骨细胞活性氧水平、线粒体膜电位水平；③各组软骨细胞凋亡情况；④各组小鼠行为学分析；⑤小鼠膝关节软骨组织病理学变化；⑥小鼠软骨组织细胞外基质相关蛋白表达；⑦小鼠软骨组织细胞凋亡变化。
1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行统计分析，Shapiro-Wilk 检验进行正态性分析，如果数据呈正态分布，采用t检验评价，多组间比较采用单因素方差分析，如果数据呈非正态分布，采用秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad Prism 9.0 软件进行图片处理。文章的统计学方法已由山西医科大学统计学专家审核。

讨论

线粒体氧化应激在骨关节炎的发生和发展中扮演着重要的角色[16]。氧化应激是细胞内外产生过多活性氧物质的过程，而线粒体是细胞内主要的氧化还原反应场所。在骨关节炎患者中，氧化应激水平明显升高，导致细胞内活性氧水平升高，损伤细胞结构和功能[17-18]。线粒体作为细胞的能量中心，不仅参与能量产生，还是氧化应激的主要靶点。氧化应激引起线粒体膜的脂质过氧化和蛋白质氧化，导致线粒体功能的损害，影响细胞正常的能量代谢和生存[19]，进一步线粒体氧化应激与骨关节炎的炎症反应和软骨损伤密切相关。氧化应激诱导了炎症因子的释放，促使关节炎症的发生，同时过度的氧化应激也直接损伤软骨细胞，促使软骨的退化和病变[20]。线粒体功能障碍可导致线粒体膜电位降低、细胞内活性氧水平激增，从而引发一系列细胞应激事件，诱导细胞死亡和变性[21]。因此，针对线粒体氧化应激的调控成为探索骨关节炎治疗新途径的研究焦点。此次研究发现白细胞介素1β诱导的软骨细胞线粒体功能障碍，包括线粒体形态变化、线粒体膜电位降低和活性氧增强；Hemin在体外实验中可以降低白细胞介素1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的活性氧水平，增强线粒体膜电位；其机制研究进一步证实，Hemin通过激活Nrf2/HO-1途径抑制白细胞介素1β诱导的小鼠软骨细胞损伤。同时，Hemin对体内骨关节炎小鼠模型也有保护作用，这一结果支持了Hemin作为一种针对软骨细胞氧化应激有前景的骨关节炎治疗药物。

抗氧化酶血红素加氧酶是对抗活性氧介导的氧化应激损伤的保护因子，它通过将血红素降解为亚铁、一氧化碳和胆绿素等来促进铁循环，保护细胞免受各种应激反应[22]。
血红素加氧酶介导一般的适应性反应，可以增强对各种应激反应的抵抗力[23]。但是血红素加氧酶易受到各种转录抑制因子的负调控，并通过氧化应激、与血红素结合和被半胱氨酸残基氧化等失活，导致其功能下降[24]。有研究表明，在野生型小鼠中，随着骨关节炎的进展，关节软骨中的血红素加氧酶显著降低[25]，这些结果表明，维持血红素加氧酶的表达有可能预防骨关节炎的发生和发展[26]。通过诱导血红素加氧酶的表达，抑制软骨细胞的氧化应激可能是治疗骨关节炎的一种很有前景的方法。而Hemin作为血红素加氧酶的激活剂，已被证明具有抗炎和抗氧化应激等多重作用[27]。以前的研究已经指出，健康的关节通过维持软骨细胞合成和分解代谢因子之间的平衡来保持关节的稳态。此次研究进一步证实，Hemin通过激活血红素加氧酶，有助于保持软骨细胞线粒体的稳态，从而维持关节的稳定状态。
已有许多研究表明，白细胞介素1β在软骨变性中发挥作用，并参与骨关节炎的发病机制[28]。此次研究也证实了白细胞介素1β促进了小鼠软骨细胞的氧化应激水平，而Hemin部分逆转了白细胞介素1β引起的氧化应激。氧化应激已被认为是骨关节炎的典型生物学特征，许多研究都指出了氧化应激在骨关节炎发展中的重要性。例如，姜黄素通过Nrf2途径减轻氧化应激，并预防骨关节炎的软骨变性[29]；紫锥菊苷通过其抗氧化作用减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤，因此被认为是一种有前景的骨关节炎治疗药物[30]。与这些研究结果一致，此次实验数据显示，Hemin抑制了白细胞介素1β诱导的小鼠软骨细胞的氧化应激。大量研究表明，活性氧通过诱导氧化应激在骨关节炎中发挥作用。例如，SHIN等[31]证实骨关节炎患者的活性氧产生和氧化应激增加，氧化应激的减少减轻了单碘乙酸诱导的骨关节炎软骨损伤；PARK等[32]阐述了锯叶马尾藻提取物通过抑制核因子κB、p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路的激活来减少白细胞介素1β诱导的软骨细胞氧化应激。这些研究表明，减少白细胞介素1β诱导的软骨细胞氧化应激有助于减轻骨关节炎。正如预期的那样，此次研究证实了小鼠软骨细胞中的相对活性氧水平随着Hemin的治疗而降低，并进一步阐明了Hemin抑制了小鼠关节软骨细胞中白细胞介素1β诱导的氧化应激。
Ⅱ型胶原和蛋白多糖作为构成细胞外基质的主要成分，在其分布和功能上扮演着至关重要的角色，它们共同构建了细胞外基质的结构框架，为维持组织的力学强度和稳定性提供了基础支持。Ⅱ型胶原主要存在于软骨组织中，赋予软骨抗拉伸和抗挤压的特性，是关节软骨的主要结构蛋白。而蛋白多糖则以其在细胞外基质中形成胶状物质的能力而为软组织提供了水分和润滑，维持了组织的弹性和柔韧性。这两种成分的合理分布和功能调控对于维持细胞外基质的动态平衡具有关键意义。在正常情况下，它们协同作用，维护了软骨的正常结构和功能。然而，在关节疾病如骨关节炎中，Ⅱ型胶原和蛋白多糖的代谢和分解失衡，导致了软骨组织的异常改变和退变[33]。
需要注意的是，在降解细胞外基质的过程中，基质金属蛋白酶发挥着关键作用，特别是其中的主要成员之一——基质金属蛋白酶13，该酶不仅参与了软骨蛋白多糖的降解，还能激活其他基质金属蛋白酶，共同促进Ⅱ型胶原的降解，进而导致软骨细胞的退变和凋亡。因此，此次研究在DMM小鼠模型的基础上评估了Hemin对骨关节炎细胞外软骨基质的影响。骨关节炎的特征是关节软骨的逐渐退化和磨损、软骨基质的降解、软骨下骨的伴随变化以及骨赘的进展。此次研究运用特殊染色和免疫组织化学技术评估Hemin对骨关节炎发展的保护作用，结果显示，Hemin组的软骨损伤和骨关节炎OARSI评分显著低于模型组，同时Hemin组促进了骨关节炎软骨中Ⅱ型胶原的表达，并抑制了基质金属蛋白酶13的表达。但也有研究表明在人类软骨细胞中HO-1的过表达会降低蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达，这意味着HO-1可能只在炎症诱导时具有保护作用[34]。然而，由于种属的差异以及体内体外的条件不同，还需要更多的实验来验证这一结果，但是，HO-1的升高在骨关节炎中对软骨具有保护作用与此次研究结果是一致的。这一系列结果表明，Hemin在促进合成代谢和降低分解代谢方面对骨关节炎软骨组织产生了积极的影响。综合分析显示，研究还证实了Hemin对减少骨关节炎软骨组织的细胞凋亡有显著效果，因此，上述实验结果共同为Hemin治疗在小鼠模型中显著减缓骨关节炎进展提供了有力的实证支持。
随着对骨关节炎发病机制的深入探索，异常的信号通路引起了人们广泛关注，主要包括Wnt/β-catenin信号通路[35]、TLR4/NF-κB信号通路[36]、Erk信号通路和Nrf2/HO-1信号通路[37-38]。Nrf2调节抗氧化蛋白的表达，并保护身体免受炎症和损伤引起的氧化损伤[39]。据报道，Nrf2与HO-1结合，HO-1是一种抗氧化反应元件，可以抵消各种组织损伤中的氧化损伤[40]。近年来，Nrf2/HO-1通路因在骨关节炎中的关键作用备受关注。例如，杨梅素激活Nrf2/HO-1通路，以减弱人类软骨细胞中细胞外基质的降解，并减轻小鼠的骨关节炎[41]。在这项研究中，阐明了白细胞介素1β诱导的小鼠软骨细胞损伤被Hemin治疗部分逆转，同时Hemin通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制了白细胞介素1β诱发的小鼠软骨细胞损伤，这与之前的发现相似，在上述结论的基础上，进一步证实了Hemin对体内骨关节炎小鼠模型具有保护作用。
尽管Hemin的干预在此次实验中表现出很好的治疗效果，但是这项研究有几个潜在的局限性：首先，Hemin对骨关节炎的保护作用仅基于小鼠模型，而不基于骨关节炎患者，因此，Hemin对骨关节炎疗效的临床研究有待探讨；其次，Hemin可降低白细胞介素1β诱导的软骨细胞内活性氧，然而，减少的活性氧如何调节软骨细胞的凋亡信号通路值得进一步研究。
综上所述，Hemin通过抑制炎症环境下软骨细胞中氧化应激，提高线粒体膜电位水平，减少软骨细胞的凋亡，促进软骨细胞外基质的合成代谢减轻骨关节炎的进展，这将为骨关节炎的治疗提供了创新策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径

Hemin regulates mitochondrial pathway of oxidative stress in mouse chondrocytes

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