熊果酸干预人牙周膜干细胞成骨分化的效应

doi:10.12307/2025.031

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (1): 80-86.doi: 10.12307/2025.031

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熊果酸干预人牙周膜干细胞成骨分化的效应

郑茜1，2，刘萍萍3，顾煜婕1，2，谢蕾1，2，4

西南医科大学附属口腔医院，1正畸科，4城北门诊部，四川省泸州市 646000；2口颌面修复重建和再生泸州市重点实验室，四川省泸州市 646000；3南充市中心医院口腔科，四川省南充市 637000

收稿日期:2023-11-23 接受日期:2024-01-22 出版日期:2025-01-08 发布日期:2024-05-18
通讯作者: 谢蕾，主治医师，西南医科大学附属口腔医院，正畸科，城北门诊部，四川省泸州市 646000；口颌面修复重建和再生泸州市重点实验室，四川省泸州市 646000
作者简介:郑茜，女，1990年生，四川省泸州市人，汉族，硕士，医师，主要从事正畸牙移动机制方面的研究。
基金资助:
四川省科技厅自然科学基金青年项目(2023NSFSC1522)，项目名称：光刺激对光基因化牙囊细胞成骨分化的影响及其机制研究，项目参与人：顾煜婕；西南医科大学附属口腔医院自然科学基金青年项目(201912)，项目名称：基于BMP信号通路探讨熊果酸对牙周膜干细胞骨分化能力的影响，项目负责人：谢蕾

Effect of ursolic acid on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells#br#

Zheng Qian1, 2, Liu Pingping3, Gu Yujie1, 2, Xie Lei1, 2, 4

1Department of Orthodontics, 4Department of Chengbei Outpatient, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration of Luzhou Key Laboratory, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Department of Stomatology, Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Received:2023-11-23 Accepted:2024-01-22 Online:2025-01-08 Published:2024-05-18
Contact: Xie Lei, Attending physician, Department of Orthodontics, and Department of Chengbei Outpatient, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration of Luzhou Key Laboratory, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Zheng Qian, Master, Physician, Department of Orthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration of Luzhou Key Laboratory, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation Youth Project of Sichuan Provincial Department of Science and Technology, No. 2023NSFSC1522 (to GYJ); Natural Science Foundation Youth Project of Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, No. 201912 (to XL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

牙周膜干细胞：是存在于牙周膜中具有多向分化潜能的成体干细胞。从再生重建的研究中发现，牙周膜干细胞表现出更高的碱性磷酸酶活性、更强的矿化能力和更好的牙周软组织修复效果，是牙周组织工程中较为理想的种子细胞，可构建组织工程牙周膜，促进牙周缺损的修复。

骨形态发生蛋白信号通路：参与调控生命体生长、发育、衰老和死亡等生命过程，是细胞增殖分化、胚胎和器官发育的关键调控环节和信号转导途径之一。骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族中的成员，与成骨向分化及骨形成密切相关，其中骨形态发生蛋白2在此过程中发挥重要的调节作用。

背景：熊果酸可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化，但其对人牙周膜干细胞是否具有促成骨作用目前相关报道少见。
目的：探讨熊果酸对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化能力的影响。
方法：分离、培养人牙周膜干细胞，取第3代细胞，分别采用含不同浓度(0，1，2，4，6，8 μmol/L)熊果酸的普通培养基干预，干预1，3，5，7 d后，采用CCK-8法检测细胞增殖，筛选适宜干预浓度。取第3代人牙周膜干细胞，分别用含0，1，2，4 μmol/L熊果酸的成骨诱导液干预，干预7 d后，采用qRT-PCR法检测碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA的表达，干预14 d后，茜素红染色观察矿化结节形成。取第3代人牙周膜干细胞，对照组加入成骨诱导液，熊果酸组、拮抗剂组分别加入含熊果酸(2 μmol/L)、骨形态发生蛋白信号通路拮抗剂Noggin的成骨诱导液，熊果酸+拮抗剂组加入含熊果酸(2 μmol/L)、骨形态发生蛋白信号通路抑制剂Noggin的成骨诱导液，培养7 d后，采用qRT-PCR和Western blot检测骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2的mRNA及蛋白表达。
结果与结论：①1，2，4 μmol/L熊果酸可促进人牙周膜干细胞的增殖，6，8 μmol/L熊果酸可抑制人牙周膜干细胞的增殖，后续实验选择1，2，4 μmol/L熊果酸进行干预；②与0 μmol/L相比，1，2，4 μmol/L熊果酸可促进碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素mRNA的表达以及矿化结节的形成(P < 0.05)，其中以2 μmol/L熊果酸效果最显著；③与对照组比较，熊果酸组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2的mRNA及蛋白表达均升高(P < 0.05)，拮抗剂组上述指标的mRNA及蛋白表达均降低(P < 0.05)；与熊果酸组比较，熊果酸+拮抗剂组上述指标的mRNA及蛋白表达均降低(P < 0.05)；④结果表明，熊果酸可通过激活骨形态发生蛋白信号通路促进人牙周膜干细胞的成骨分化。

https://orcid.org/0009-0003-4093-8669 (郑茜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人牙周膜干细胞, 熊果酸, 成骨, 骨形态发生蛋白信号通路, 碱性磷酸酶, 骨钙素, 骨形态发生蛋白2, Smad1蛋白

Abstract: BACKGROUND: Ursolic acid can promote the directed differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts. However, there are few reports on whether ursolic acid has osteogenic effect on human periodontal ligament stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ursolic acid on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells.
METHODS: The human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured. Passage 3 cells were selected and treated with ordinary medium containing different concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8 μmol/L) of ursolic acid. After intervention for 1, 3, 5, 7 days, the cell proliferation was detected by CCK-8 assay and the appropriate intervention concentration was screened. Passage 3 human periodontal ligament stem cells were treated with osteogenic induction solution containing 0, 1, 2, 4 μmol/L ursolic acid, respectively. After 7 days of intervention, the mRNA expressions of alkaline phosphatase, Runx2, and osteocalcin were detected by qRT-PCR. After 14 days of intervention, the formation of mineralized nodules was observed by alizarin red staining. Passage 3 human periodontal ligament stem cells were taken and the control group was added with osteogenic induction solution; the ursolic acid group and the antagonist group were added with osteogenic induction solution containing ursolic acid (2 μmol/L) and the bone morphogenetic protein signaling pathway antagonist Noggin, respectively. The ursolic acid+antagonist group was added with osteogenic induction solution containing ursolic acid (2 μmol/L) and Noggin, the inhibitor of bone morphogenetic protein signaling pathway, and cultured for 7 days. qRT-PCR and western blot assay were used to detect the mRNA and protein expressions of bone morphogenetic protein 2, Smad1, osteopontin, and Runx2.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 1, 2, 4 μmol/L ursolic acid could promote the proliferation of human periodontal ligament stem cells. 6, 8 μmol/L ursolic acid could inhibit the proliferation of human periodontal ligament stem cells, and 1, 2, 4 μmol/L ursolic acid was selected to intervene in subsequent experiments. (2) Compared with 0 μmol/L, 1, 2, 4 μmol/L ursolic acid could promote the expression of alkaline phosphatase, Runx2, and osteocalcin mRNA and the formation of mineralized nodules (P < 0.05), and the effect of 2 μmol/L ursolic acid was the most significant. (3) Compared with the control group, the mRNA and protein expressions of bone morphogenetic protein 2, Smad1, osteopontin, and Runx2 in the ursolic acid group were increased (P < 0.05), while mRNA and protein expressions of the above indexes were decreased in the antagonist group (P < 0.05). Compared with the ursolic acid group, mRNA and protein expressions of above indexes were decreased in ursolic acid+antagonist group (P < 0.05). (4) The results indicate that ursolic acid promotes osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells through bone morphogenetic protein signaling pathway.

Key words: human periodontal ligament stem cell, ursolic acid, osteogenesis, bone morphogenetic protein signaling pathway, alkaline phosphatase, osteocalcin, bone morphogenetic protein 2, Smad1 protein

中图分类号:

郑茜, 刘萍萍, 顾煜婕, 谢蕾. 熊果酸干预人牙周膜干细胞成骨分化的效应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(1): 80-86.

Zheng Qian, Liu Pingping, Gu Yujie, Xie Lei. Effect of ursolic acid on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells#br#[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(1): 80-86.

图/表（结果） 4

2.1 人牙周膜干细胞的形态与鉴定 显微镜镜下观察人牙周膜干细胞形态似成纤维细胞，呈长梭形，胞质均匀，胞核居中，3-7 d后细胞相连成片，呈中心性旋涡排列，见图1A。成骨诱导后，显微镜下观察可见红染钙结节，见图1B。成脂诱导后，显微镜下观察到细胞变得丰满，部分胞质内有圆形脂滴形成，油红O染色后变为红橘色，见图1C。人牙周膜干细胞表面抗原CD45、CD34呈阴性，检出率分别为2.95%，2.41%；CD73、CD90呈阳性，检出率分别为99.3%，97.3%，见图1D，表明细胞具备间充质干细胞的特征。

2.2 熊果酸对人牙周膜干细胞增殖能力的影响 CCK-8检测结果显示，培养第1天，与0 μmol/L组比较，8 μmol/L组细胞相对增殖率下降(P < 0.01)；培养第3天，与0 μmol/L组比较，2 μmol/L组细胞相对增殖率升高(P < 0.05)，8 μmol/L组细胞相对增殖率下降(P < 0.01)；培养第5天，与0 μmol/L组比较，1，2，4 μmol/L组细胞相对增殖率升高(P < 0.05)，6，8 μmol/L组细胞相对增殖率下降(P < 0.01)；培养第7天，与0 μmol/L组比较，1，2， 4 μmol/L组细胞相对增殖率升高(P < 0.01)，6，8 μmol/L组细胞相对增殖率下降(P < 0.01)，见图2。提示熊果酸浓度大于6 μmol/L时存在细胞生长抑制现象，因此选择熊果酸浓度≤4 μmol/L用于后续实验。

2.3 熊果酸对人牙周膜干细胞成骨分化的影响 qRT-PCR检测结果显示，与0 μmol/L组比较，1，2，4 μmol/L组碱性磷酸酶、骨钙素 mRNA表达上调(P < 0.05)，1，2 μmol/L组Runx2 mRMA表达上调(P < 0.05)，见图3A。
茜素红染色结果显示，与0 μmol/L组比较，1，2，4 μmol/L组成骨效果均优于对照组，并且2 μmol/L组镜下观红染钙结节最多，成骨效果较好，见图3B，C。矿化结节半定量分析结果显示，与0 μmol/L组比较，1，2，4 μmol/L组吸光度值均明显升高(P < 0.05)，其中2 μmol/L组吸光度值最大，见图3D，表明此组融合的钙结节最多。

2.4 熊果酸对人牙周膜干细胞成骨分化中骨形态发生蛋白信号通路的影响 qRT-PCR检测结果显示，与对照组比较，熊果酸组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2 mRNA表达上调(P < 0.01)，拮抗剂组形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2 mRNA表达降低(P < 0.05)；与熊果酸组比较，熊果酸+拮抗剂组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2 mRNA表达下调(P < 0.05)，见图4A。
Western blot检测结果显示，与对照组比较，熊果酸组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2蛋白表达升高(P < 0.05，P < 0.01)，拮抗剂组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2表达下降(P < 0.05)；与熊果酸组比较，熊果酸+拮抗剂组骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2蛋白表达下降(P < 0.05)，见图4B。

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引言

牙槽骨是高度可塑性的骨组织，是人体骨骼系统中最活跃的部分，它在正畸矫治中会随正畸牙的移动而不断改建。正畸治疗正是利用牙槽骨的这种生物特性使错位牙向正常位置移动，但是过大的机械力刺激可能引起牙槽骨创伤性吸收，不利于正畸治疗的顺利进行，严重影响患者口腔健康。因此，增加骨量、改善骨的微结构缺陷，成为许多学者关注的热点。干细胞移植促进骨组织再生为治疗骨组织缺损开辟了一条新道路[1-3]。牙周膜干细胞是牙周膜中重要的细胞成分，作为间充质干细胞的一员具有良好的增殖和多向分化潜能，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞和成纤维细胞等，不仅维持正常情况下牙周膜内环境的稳定，还在牙周组织的自我更新和修复再生中起着重要作用[4-8]。牙周膜干细胞是目前公认的具有形成牙周软、硬组织潜力的种子细胞，其分化受很多药物因素的影响，研究其生物学行为有助于开展以干细胞为基础的牙周组织再生及重建实验，为修复牙槽骨缺损提供导向性思路。

骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族的一员，在人类机体中骨形态发生蛋白通过自分泌或旁分泌与靶细胞表面受体结合，启动通路下游蛋白表达，从而调控细胞的成骨分化[9-10]。骨形态发生蛋白信号通路与骨代谢关系密切。Smad蛋白家族是一种细胞内信号传导蛋白，包括受体调控Smad蛋白、共用Smad蛋白、抑制性Smad蛋白[11-12]，其在转化生长因子β超家族成员的信号转导中具有重要作用，与骨形态发生蛋白关系最为密切[13]。
中草药等天然化合物及其衍生物历来都是中华民族治疗疾病的宝贵药材，药物研究革新以及天然化合物的开发在口腔研究领域中引起了学者们广泛的兴趣。熊果酸是存在于自然界植物中的羟基五环三萜酸，其药理作用包括促成骨[14-15]、抗肿瘤[16-18]、抗菌等[19]。研究发现，熊果酸可促进Balb/c小鼠骨细胞数量的增加，表明熊果酸可以促进骨骼的形成[20]。熊果酸对骨形成的影响主要是通过激活丝裂原活化蛋白激酶、核因子κB和活化蛋白1，进而诱导成骨细胞特异性基因的表达，诱导成骨分化，并证实了其在小鼠颅骨的体内成骨活性[21]。在骨重塑的过程中，成骨细胞、骨髓间充质干细胞都是熊果酸的效应细胞[22]。适宜浓度的熊果酸可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[23]，但熊果酸是否能促进牙周膜干细胞的成骨分化目前罕见报道。此次实验利用体外细胞模型研究熊果酸对人牙周膜干细胞成骨分化的影响，初步探讨熊果酸影响人牙周膜干细胞成骨分化的通路机制，为利用牙周膜干细胞治疗牙周组织损伤修复提供理论和实验依据，旨在对正畸治疗过程中及治疗结束后存在的牙槽骨吸收破坏的修复再生提供一定的理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞分子生物学实验，组间比较应用单因素方差(One Way ANOVA)分析、LSD法。
1.2 时间及地点 实验于2020年1-12月在西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 人牙齿 收集2019年3-12月于西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科因正畸需要拔除的前磨牙，牙体无龋坏、无牙周病变，患者年龄12-16周岁。患者及监护人对实验知情同意并签署了知情同意书。实验方案已通过西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准，批准号：20191209002。
1.3.2 主要试剂与仪器 熊果酸、二甲基亚砜、地塞米松、茜素红染液、β-甘油磷酸钠、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA组织细胞快速裂解液(索莱宝，中国)； GAPDH抗体、骨形态发生蛋白拮抗剂Noggin(MCE，美国)；α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(四季青，中国)；青霉素-链霉素(HyClone，美国)；Ⅰ型胶原酶(Sigma，美国)；CCK-8试剂(Dojindo，日本)；RNA提取试剂盒(Ambion，美国)；反转录试剂盒(TAKARA，日本)；SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒(KAPA Biosystems，美国)；鼠抗CD73-PE、CD90-FITC、CD45-FITC、CD34-APC抗体和兔抗骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2一抗(Abcam，英国)；胰酶细胞消化液、辣根过氧化物酶标记的山羊二抗(碧云天，中国)；流式细胞仪(Beckman-Coulter，美国)；荧光定量PCR仪(Bio-rad，美国)；酶标仪(Eppendorf，德国)。
1.3.3 主要实验溶液配制 ①熊果酸溶液：用二甲基亚砜溶解熊果酸，配置成2 mmol/L的母液，用0.22 μm滤器过滤后EP管分装，-20 ℃冰箱冻存。使用前需用含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基稀释并调整至需浓度。②完全培养基：胎牛血清、双抗、α-MEM培养基的体积比为15%∶1%∶84%，充分混匀后置4 ℃冰箱保存。③Ⅰ型胶原酶溶液：电子天平称取Ⅰ型胶原酶粉末15 mg，溶于5 mL PBS中，0.22 μm过滤器过滤后分装，得到3 mg/mL Ⅰ型胶原酶溶液，放在4℃冰箱保存，避免杂菌污染。④成骨诱导液：每100 mL成骨诱导液含10 mL的胎牛血清、1 mL双抗、89 mL α-MEM培养基、0.306 g β-甘油磷酸钠、0.005 g 维生素C、4 μL地塞米松。避光保存，1个月内用完。⑤成脂诱导液：A液，含1%谷氨酰胺、0.2%胰岛素、0.1%地塞米松、0.1%吲哚美辛、0.1% 3-异丁基-1-甲基(IBMX)的完全培养基；B液，含1%谷氨酰胺、0.2%胰岛素的完全培养基。⑥CCK-8工作液：避光条件下，将CCK-8溶液与α-MEM培养基按照体积比1∶9混合，现配现用。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定 参考SEO等[24]的方法分离培养人牙周膜干细胞。将拔除后的牙齿放入含10%双抗的α-MEM培养基中，分别用预冷过含10%双抗和5%双抗的PBS冲洗牙齿，直至液体澄清透明。刮取牙根中1/3牙周膜组织置于盛有2 mL PBS的培养皿中，1 000 r/min离心5 min，去上清液，加入2 mL Ⅰ型胶原酶溶液，置于孵育箱消化30 min，1 000 r/min离心5 min，去上清。事先将T25 cm细胞培养瓶底壁用完全培养基润湿，将絮状物均匀地铺在培养瓶底壁，倒置培养瓶，烘干，翻转培养瓶加入2 mL完全培养基，置于孵育箱中静置2 d。牙周膜组织培养7-10 d后可见细胞爬出，每3 d换液1次，待细胞长满至瓶底80%左右时传代。
成骨分化鉴定：取P3代细胞，消化，离心，重悬，调整细胞浓度至2×107 L-1。35 mm培养皿明胶包被，每皿加入2 mL细胞悬液常规培养，细胞生长融合至50%时去除培养基，加入成骨诱导液1.5 mL，避光培养。成骨诱导21 d后，去除成骨诱导液，用PBS冲洗3次，加入1 mL多聚甲醛固定细胞及钙化结节15 min，预冷PBS洗3次，加入1 mL 1%茜素红溶液染色5 min，弃染液，用PBS冲洗直至废液无明显颜色，镜下观察红染钙结节。
成脂分化鉴定：取P3代细胞，调整细胞浓度至2×107 L-1，以2 mL/孔接种于6孔板中常规培养，待细胞生长融合至70%时去除原培养液，加入2 mL成脂诱导 A液培养基诱导3 d；吸走A液，加入2 mL B液培养基，24 h后除去B液，换回A液进行诱导。A、B液交替诱导3个循环后，B液继续培养四五天直到脂滴可见，除去诱导液，用PBS洗涤2次，2 mL体积分数4%甲醛溶液固定30 min，弃去甲醛溶液，用PBS清洗2次，加入1 mL油红O染液染色20 min，弃染液，用PBS冲洗，镜下观察脂滴形成。
流式细胞仪鉴定：取P3代细胞，待细胞生长融合达90%时用预冷PBS冲洗2次，消化后1 000 r/min离心5 min，重悬，细胞浓度为2×107 L-1，用1.5 mL EP管分装，每管100 μL，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加500 μL PBS重悬，各管分别加入CD73-PE、CD90-FITC、CD45-FITC、CD34-APC抗体。4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测抗体表面标志物。

1.4.2 熊果酸对人牙周膜干细胞增殖的影响 取P3代人牙周膜干细胞，接种于5个96孔板中，细胞密度为 3 000个/孔，次日弃原培养基，并在5个96孔板中分别加入含0，1，2，4，6，8 μmol/L熊果酸的完全培养基，每组重复3次。培养1，3，5，7 d时，各随机选择一个96孔板，每孔加入CCK-8工作液100 μL，37 ℃避光孵育1.5 h，酶标仪检测吸光度值(450 nm)。筛选熊果酸适宜的干预浓度。

1.4.3 熊果酸对人牙周膜干细胞成骨分化的影响 实验分组干预：取P3代人牙周膜干细胞，消化后1 000 r/min离心5 min，重悬，调整细胞浓度为2×107 L-1。35 mm小皿明胶包被后加入2 mL细胞悬液常规培养，待细胞生长融合至50%左右去除培养基，对照组加入成骨诱导液1.5 mL，各实验组分别加入含1，2，4 μmol/L熊果酸的成骨诱导液1.5 mL，避光培养。
qRT-PCR法检测成骨相关基因表达：培养7 d后，采用Trizol法提取总RNA，-80 ℃保存。按反转录试剂盒说明书进行反转录，获得反转录产物置于4 ℃保存备用。按照SYBR FAST qPCR Master Mix试剂盒说明书进行PCR检测，扩增体系：SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 8 μL，总体积20 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环，同时做65-95 ℃范围内的熔解曲线。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达水平。引物序列见表1。
茜素红染色：成骨诱导14 d后进行茜素红染色，镜下观察染色情况并采图。各组加入1.5 mL氯化十六烷基吡啶溶液溶解钙结节15 min，将溶液转移至96孔板，上机检测在562 nm处的吸光度值，取平均值。
1.4.4 熊果酸对人牙周膜干细胞成骨分化影响的机制 由成骨分化实验得出2 μmol/L熊果酸干预效果最好，所以实验选择该浓度进行干预。
实验分组干预：取P3代人牙周膜干细胞，消化后1 000 r/min离心5 min，重悬，调整细胞浓度为2×107 L-1。35 mm小皿明胶包被后加入2 mL细胞悬液常规培养，待细胞生长融合至50%左右去除培养基，对照组加入成骨诱导液1.5 mL，熊果酸组加入含2 μmol/L熊果酸的成骨诱导液1.5 mL，拮抗剂组加入含1 μg/mL骨形态发生蛋白信号通路拮抗剂Noggin的成骨诱导液1.5 mL[25-26]，熊果酸+拮抗剂组加入含2 μmol/L熊果酸及1 μg/mL Noggin的成骨诱导液1.5 mL。
qRT-PCR检测相关 mRMA表达：培养7 d后，以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算骨形态发生蛋白2、Smad1、骨桥蛋白、Runx2 mRNA的相对表达水平。检测方法同上。引物序列见表1。
Western blot法检测相关蛋白表达：培养7 d后，收集细胞，裂解，进行蛋白提取，按BCA试剂盒进行蛋白定量。制备SDS-PAGE胶，以20 μg/孔上样量进行上样，以一般浓缩胶 80 V 40 min、分离胶120 V 50 min进行电泳，当溴酚蓝达胶底部时即可终止电泳。进行转膜，转膜后将 PVDF膜TBST洗3次，孵育一抗(稀释度骨形态发生蛋白2为1∶1 000、Smad1为1∶1 000、骨桥蛋白为1∶ 2 000、Runx2为1∶2 000)、二抗(稀释度1∶10 000)，用全自动化学发光分析仪检测，通过 TANON GIS 软件读取相关条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①熊果酸处理后人牙周膜干细胞增殖情况；②熊果酸处理后人牙周膜干细胞的成骨分化情况；③熊果酸处理后人牙周膜干细胞成骨分化过程中骨形态发生蛋白信号通路的表达。

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，对数据进行正态性检验和单因素方差(One Way ANOVA)分析，分析采用LSD法，数据用x±s表示，P < 0.05认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经西南医科大学附属口腔医院生物统计学专家审核。

讨论

正畸矫治过程中或矫治结束后，一些患者可能发生不同程度的牙槽骨吸收情况，严重者可能出现牙周附着丧失、牙齿松动、牙齿脱落等症状，对口腔健康造成极大危害。干细胞在特殊的诱导信号条件下可分化出一些结缔组织，如骨组织、牙本质、牙骨质、脂肪组织等多种间充质组织，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复，尤其是口颌面组织的修复[27]。牙周膜干细胞是存在于牙周膜中具有多向分化潜能的间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，不仅能分化为成骨细胞和成牙骨质细胞，形成骨和牙骨质样组织，而且还可以分化为成纤维细胞，形成类似天然牙周膜样结构[26，28]。从再生重建的研究中发现，人牙周膜干细胞表现出较高的碱性磷酸酶活性和较强的矿化能力，是牙周组织中较为理想的种子细胞[29]。然而在牙槽骨病损部位，由于牙槽骨吸收破坏或存在炎症等情况，牙周膜干细胞的数量和来源有限，很难达到有效的再生和修复，因此探究如何增加病变部位牙周膜干细胞的数量和活性具有重要的临床意义。

熊果酸是一种植物化学物质，最常见于苹果皮、枇杷叶、栀子等天然植物中，具有低毒性、生物安全性高、易获取等特点。此次实验发现不同浓度熊果酸对人牙周膜干细胞增殖的影响不同，当浓度≤4 μmol/L时对细胞增殖起促进作用，并且随着熊果酸浓度的增加呈先上升后下降的趋势，2 μmol/L熊果酸促细胞增殖作用最强，当浓度≥6 μmol/L时熊果酸对细胞增殖起抑制作用，随熊果酸浓度的增加，抑制细胞增殖作用增强，同时熊果酸对人牙周膜干细胞增殖的影响会随着时间的延长而表现得更加明显，这表明适宜浓度的熊果酸有较好的生物相容性，有应用于临床促进人牙周膜干细胞增殖的潜力。

成骨细胞早期分化主要受转录因子核心结合蛋白Runx2的转录表达调控，Runx2作为重要的成骨转录因素在成骨早期起决定性作用[30]。碱性磷酸酶参与成骨细胞的分化，是成骨细胞分化的早期标志物，其活性代表成骨细胞的分化程度[31-32]。骨钙素是由非增殖期成骨细胞合成和分泌的一种特异非胶原骨基质蛋白，是骨组织内非胶原蛋白的主要成分[33]，参与基质的矿化过程及成骨细胞分化，与骨转换相关，能够维持骨的正常矿化速率[34]。此次实验采用1，2，4 μmol/L熊果酸诱导人牙周膜干细胞成骨，发现熊果酸可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素的表达，其中2 μmol/L浓度的熊果酸促进作用最明显。同时，茜素红染色和矿化结节半定量分析也显示2 μmol/L熊果酸形成的钙结节最多。这些实验结果表明，适宜浓度的熊果酸可以促进人牙周膜干细胞成骨相关基因的表达和骨基质的成熟，促使人牙周膜干细胞的成骨分化，并且2 μmol/L浓度熊果酸促成骨效果最好。

骨形态发生蛋白信号通路参与调控生命体生长、发育、衰老和死亡等生命过程，是细胞增殖分化、胚胎和器官发育的关键调控环节和信号转导途径之一。经典Smads途径以骨形态发生蛋白2、Smad1、Smad5、Smad8为主要诱发因子，并且骨形态发生蛋白2通过Smad1、Smad5、Smad8介导的转导通路来调控成骨细胞的分化与成熟[35]。在骨形态发生蛋白2信号转导过程中，成骨细胞中的骨形态发生蛋白2/Smads信号通路可通过上调转录因子核心结合蛋白Runx2和成骨细胞特异性转录因子Osterix的表达，进一步影响成骨细胞的分化[36-37]。Noggin蛋白是一种分泌型同二聚体糖蛋白，是骨形态发生蛋白的拮抗剂。当小鼠成骨细胞中Noggin过表达时成骨细胞的增殖和分化都会受到一定的抑制，甚至会导致小鼠发生骨质疏松，这在一定程度上证实了骨形态发生蛋白信号通路能够促进成骨细胞分化的理论[38]。

在调节骨代谢过程中骨形态发生蛋白2是重要的成骨调节因子，具有最强的成骨诱导能力，是骨组织工程中应用最广泛的生长因子之一[39]。骨形态发生蛋白2可促进间充质来源干细胞的增殖效应[40]，将骨形态发生蛋白2作用于牙周膜干细胞后相关成骨标志物表达增强，牙周膜干细胞钙化能力增强，有向成骨分化的趋势[41]。大量研究表明，骨形态发生蛋白信号通路对人牙周膜干细胞的迁移、增殖、分化起调控作用[42]。骨桥蛋白是一种糖基化蛋白，广泛存在于细胞外基质中，与骨的形成和发展密切相关。此次实验结果显示，在适宜浓度熊果酸的作用下，人牙周膜干细胞通过上调骨形态发生蛋白通路中主要因子骨形态发生蛋白2、Smad1的表达激活骨形态发生蛋白信号通路，进而促进成骨相关因子表达，促进成骨效应；而在加入骨形态发生蛋白拮抗剂Noggin后信号通路被阻滞，导致成骨相关因子表达下调，表明熊果酸可通过骨形态发生蛋白信号通路调控人牙周膜细胞的成骨分化，从而影响成骨效应。

此次实验基于骨形态发生蛋白信号通路对熊果酸促进人牙周膜干细胞的成骨作用进行初步研究，后期还需深入探究明确哪些信号通路作用于人牙周膜干细胞成骨分化的生物学效应。需注意的是，牙周膜干细胞成骨分化的机制十分复杂，熊果酸促进人牙周膜干细胞的成骨作用可能是由多个信号因子、多个信号通路组成的一个复杂网络体系调控，各条信号通路非孤立存在，它们之间可能存在一定的交互作用，但目前并没有相关研究说明其中潜在的机制，由此也为进一步研究提供了新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

熊果酸干预人牙周膜干细胞成骨分化的效应

Effect of ursolic acid on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells#br#

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