炎症与正常牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨分化能力和自噬水平

doi:10.12307/2025.037

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (1): 74-79.doi: 10.12307/2025.037

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

炎症与正常牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨分化能力和自噬水平

毛家奇1，赵力如2，杨冬茹1，胡永青1，代博文3，李淑娟1

1河北医科大学口腔医学院 • 口腔医院牙周一科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050017；2河北医科大学口腔医学院 • 口腔医院正畸科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050017；3河北医科大学，河北省石家庄市 050017

收稿日期:2023-12-21 接受日期:2024-02-08 出版日期:2025-01-08 发布日期:2024-05-18
通讯作者: 李淑娟，硕士，主任医师，教授，河北医科大学口腔医学院 • 口腔医院牙周一科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050017
作者简介:毛家奇，男，1993年生，四川省简阳市人，汉族，2020年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事口腔干细胞相关基础研究。共同第一作者：赵力如，女，1993年生，四川省绵阳市人，汉族，2019年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，讲师，主要从事口腔干细胞相关基础研究。
基金资助:
河北省医学科学研究课题(20211078)，项目负责人：赵力如；河北省医学科学研究课题(20230185)，项目负责人：毛家奇；河北省卫健委2019年度政府资助省级临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目(2019061441-2)，项目负责人：李淑娟；2017年河北省财政厅老年病防治项目(361029)，项目负责人：李淑娟

Osteogenic ability and autophagy level between normal and inflammatory periodontal ligament stem cells

Mao Jiaqi1, Zhao Liru2, Yang Dongru1, Hu Yongqing1, Dai Bowen3, Li Shujuan1

1First Department of Periodontology, Hebei Key Laboratory of Stomatology, Hebei Clinical Research Center for Oral Diseases, School and Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; 2Department of Orthodontics, Hebei Key Laboratory of Stomatology, Hebei Clinical Research Center for Oral Diseases, School and Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China; 3Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China

Received:2023-12-21 Accepted:2024-02-08 Online:2025-01-08 Published:2024-05-18
Contact: Li Shujuan, Master, Chief physician, Professor, First Department of Periodontology, Hebei Key Laboratory of Stomatology, Hebei Clinical Research Center for Oral Diseases, School and Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China
About author:Mao Jiaqi, Master, Attending physician, First Department of Periodontology, Hebei Key Laboratory of Stomatology, Hebei Clinical Research Center for Oral Diseases, School and Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China Zhao Liru, Master, Attending physician, Lecturer, Department of Orthodontics, Hebei Key Laboratory of Stomatology, Hebei Clinical Research Center for Oral Diseases, School and Hospital of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei Province, China Mao Jiaqi and Zhao Liru contributed equally to this article.
Supported by:
Medical Science Research Project in Hebei Province, No. 20211078 (to ZLR); Medical Science Research Project in Hebei Province, No. 20230185 (to MJQ); 2019 Hebei Provincial Health Commission Government Funded Provincial Clinical Medicine Excellent Talent Training and Basic Research Project, No. 2019061441-2 (to LSJ); Elderly Disease Prevention and Control Project of Hebei Provincial Department of Finance in 2017, No. 361029 (to LSJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

碱性磷酸酶：在成骨早期阶段表达，在一定程度上反映了细胞的成骨能力。

自噬：是介导各种细胞内容物递送到溶酶体进行降解和回收的主要机制，也是细胞维持内环境稳定的重要机制。

背景：炎症影响牙周膜干细胞的成骨分化，同时牙周膜干细胞的成骨能力与自噬水平密切相关，但是炎症是否影响牙周膜干细胞成骨分化不同阶段的成骨能力与自噬水平尚未见相关报道。
目的：探讨牙周膜干细胞在牙周炎和正常状态下的碱性磷酸酶表达和自噬水平。
方法：分离培养健康人群与牙周炎患者的牙周膜干细胞，进行Vimentin、pan-CK和Stro-1荧光染色。正常和炎症牙周膜干细胞成骨分化3，7，14 d时，Western blot检测碱性磷酸酶、LC3B、Beclin1、ATG5的蛋白表达，real-time PCR检测碱性磷酸酶、骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2、LC3B、Beclin1、ATG5 的mRNA表达。
结果与结论：①牙周膜干细胞内Stro-1阳性表达，Vimentin阳性表达，pan-CK阴性表达；②成骨分化3，7，14 d，与正常牙周膜干细胞相比，炎症牙周膜干细胞所形成的矿化结节明显减少(P < 0.01)，碱性磷酸酶的蛋白和mRNA表达明显降低(P < 0.05)，骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2的mRNA表达明显降低(P < 0.05)；③成骨分化7，14 d，与正常牙周膜干细胞相比，炎症牙周膜干细胞的ATG5、LC3B与Beclin1蛋白和mRNA表达均明显降低(P < 0.05)。结果表明，炎症可减少牙周膜干细胞的矿化结节形成和碱性磷酸酶的表达，削弱牙周膜干细胞成骨分化7，14 d的自噬潜能。

https://orcid.org/0009-0003-5246-9767 (毛家奇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牙周膜干细胞, 牙周炎, 碱性磷酸酶, 自噬, 炎症, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Inflammation affects the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells, and the osteogenic ability and autophagy level of periodontal ligament stem cells are closely related. However, there are no relevant reports on whether inflammation affects the osteogenic ability and autophagy level of periodontal ligament stem cells at different stages of osteogenic differentiation.
OBJECTIVE: To explore alkaline phosphatase expression and autophagy periodontal ligament stem cells levels in periodontitis and normal conditions.
METHODS: Periodontal ligament stem cells from normal and periodontitis patients were isolated and cultured, and underwent Vimentin, pan-CK, and Stro-1 fluorescence staining. At 3, 7, and 14 days of osteogenic differentiation, western blot assay was used to detect the protein expression levels of alkaline phosphatase, LC3B, Beclin1, and ATG5 in normal and inflammatory periodontal ligament stem cells. The mRNA expression levels of alkaline phosphatase, bone sialoprotein, osteocalcin, Runx2, LC3B, Beclin1, and ATG5 were detected by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Stro-1 was positive, Vimentin was positive, and pan CK was negative in periodontal ligament stem cells. (2) At 3, 7, and 14 days after osteogenic differentiation, compared with normal periodontal ligament stem cells, the mineralization nodules formed by periodontal ligament stem cells from inflammatory sources were significantly reduced (P < 0.01); the expression of alkaline phosphatase protein and mRNA was significantly lower (P < 0.05); the mRNA expression levels of bone sialoprotein, osteocalcin, and Runx2 were significantly decreased (P < 0.05). (3) At 7 and 14 days after osteogenic differentiation, compared with normal periodontal ligament stem cells, the expression levels of ATG5, LC3B, and Beclin1 proteins and mRNA of periodontal ligament stem cells were downregulated (P < 0.05). These findings suggest that inflammation reduces the activity of periodontal ligament stem cells in mineralizing nodule formation and the expression of alkaline phosphatase and weakens the autophagy potential of periodontal ligament stem cells at 7 and 14 days after osteogenic differentiation.

Key words: periodontal ligament stem cell, periodontitis, alkaline phosphatase, autophagy, inflammation, osteogenic differentiation

中图分类号:

毛家奇, 赵力如, 杨冬茹, 胡永青, 代博文, 李淑娟. 炎症与正常牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨分化能力和自噬水平[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(1): 74-79.

Mao Jiaqi, Zhao Liru, Yang Dongru, Hu Yongqing, Dai Bowen, Li Shujuan. Osteogenic ability and autophagy level between normal and inflammatory periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(1): 74-79.

图/表（结果） 2

2.1 牙周膜干细胞的原代及传代培养 培养第7天观察到小部分成纤维形态细胞，第9天细胞量明显上调，第11 天细胞融合至60%-70%，第1代细胞呈长梭形，胞体饱满，见图1。
2.2 牙周膜干细胞的鉴定结果 荧光染色结果显示，细胞Vimentin呈阳性表达，可见此原代培养细胞为间充质来源，见图2A；pan-CK阴性表达，见图2B，可见此原代培养细胞未被牙龈上皮细胞等污染；Stro-1阳性表达，Stro-1为间充质干细胞共性表达标记物，见图2C。成骨分化21 d，牙周膜干细胞茜素红染色出现大量矿化结节，见图2D。成脂分化28 d，牙周膜干细胞油红O染色显示有红色的脂滴，见图2E。根据Vimentin、pan-CK、Stro-1荧光染色的结果及成骨成脂多向诱导分化的结果，证明为牙周膜干细胞。
2.3 两种牙周膜干细胞在成骨诱导不同阶段成骨分化能力的差异 相较于正常牙周膜干细胞，炎症牙周膜干细胞成骨诱导21 d后茜素红染色的矿化结节明显减少(P < 0.01)，见图3A，B。相较于正常牙周膜干细胞，炎症牙周膜干细胞成骨诱导3，7，14 d的碱性磷酸酶蛋白表达显著降低(P < 0.05)，见图3C，D。real-time PCR实验显示同样的结果，相较于正常牙周膜干细胞，炎症牙周膜干细胞成骨诱导3，7，14 d的碱性磷酸酶、骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2 mRNA表达水平显著降低，见图3E。

2.4 两种牙周膜干细胞在成骨诱导不同阶段自噬水平的差异 在成骨分化的第3天，自噬相关因子LC3B、Beclin1、ATG5 mRNA的表达水平在两组之间差异无显著性意义；而在成骨分化第7，14天，炎症牙周膜干细胞组自噬相关因子LC3B、Beclin1、ATG5 mRNA的表达低于正常牙周膜干细胞组(P < 0.05，P < 0.01)。在成骨分化的第3天，自噬相关因子LC3B、Beclin1、ATG5蛋白表达在两组之间差异无显著性意义；在成骨分化第7，14天，炎症牙周膜干细胞组自噬相关因子LC3B、Beclin1、ATG5蛋白的表达水平低于正常牙周膜干细胞组(P < 0.05，P < 0.01)，见图4。

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引言

牙周炎是口腔领域的常见病，表现为牙周支持组织的破坏，是成年人牙齿脱落最常见的原因[1]。牙周膜干细胞作为“种子细胞”在牙周再生方面显示出巨大的潜力[2-5]，其中牙周膜干细胞的成骨分化对牙周组织缺损修复至关重要[6-8]。但是牙周炎症破坏了牙周膜干细胞的成骨分化能力，研究发现炎症牙周膜组织来源牙周膜干细胞的骨修复缺损能力低于正常牙周膜组织来源牙周膜干细胞，碱性磷酸酶的表达较正常牙周膜干细胞皆偏低[4，8-9]。

自噬是介导各种细胞内容物递送到溶酶体进行降解回收的主要机制。研究表明，自噬对疾病的保护作用非常重要，自噬活性异常甚至会引发恶性疾病[10]。自噬是机体的一类自我调控机制[11-12]。研究表明，激活自噬可提高牙周膜干细胞膜片的成骨能力[13]。MAO等[14]研究发现，体外培养的牙周膜干细胞加入肿瘤坏死因子α诱导炎症反应后，LC3表达上升，在6 h升高至最高点，在7 d时LC3表达下调，可见肿瘤坏死因子α所致牙周炎症初期对自噬具有促进效应，但后续对自噬具有阻断功能。另有研究表明，周期性拉伸应力可以促进牙周膜干细胞的成骨分化，并且与线粒体自噬的激活有关，为线粒体自噬参与成骨分化调控提供了新的实验证据[15]。由此可知，自噬和牙周膜干细胞成骨分化密切相关[16-17]，但是炎症是否影响牙周膜干细胞成骨分化不同阶段的成骨能力与自噬水平尚未见相关报道。
该研究拟探讨炎症与牙周膜干细胞成骨能力、自噬水平之间的联系，为后续进一步研究自噬与成骨之间的调控机制提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年1月至2022年12月在河北省口腔医学重点实验室完成。
1.3 材料 胎牛血清、α-MEM培养基(Gibco，美国)；LC3B、Beclin1、ATG5抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)；β-actin、碱性磷酸酶、STRO-1抗体(Abcam，英国)；波形蛋白(Vimentin)、泛角化角蛋白(Pan-cytokeratin，pan-CK)抗体(Boster，美国)；RT-PCR试剂盒(天根，中国)；多功能成像仪(GE Healthcare，美国)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 牙周膜干细胞的原代与传代培养 离体牙由河北医科大学口腔医院提供，患者签署知情同意书。该研究的实施符合河北医科大学口腔医院医学伦理会的相关伦理要求，伦理编号：【2020】037。实验分组：①正常牙周膜干细胞组：来源于拔除的3颗第三磨牙(无牙体、牙周疾病，患者无全身系统性疾病，不吸烟，年龄25-35岁)；②炎症牙周膜干细胞组：来源于3颗因牙周炎拔除的磨牙(患牙无龋坏，患者无全身系统性疾病，不吸烟，年龄30-45岁)。离体牙拔除后立即置于预冷的PBS中，并在半小时内采用组织块法进行原代培养。将离体牙用PBS反复冲洗至少5次，取根中1/3部位的牙周膜，切成1 mm×1 mm大小的组织块，置于T25培养瓶中，培养基为α-MEM完全培养基(α-MEM+体积分数10%胎牛血清+1%青链霉素混合液+1%谷氨酰胺)，传代后进行后续实验。
1.4.2 免疫细胞荧光染色 将第3代正常牙周膜干细胞与炎症牙周膜干细胞分别以每孔1×104的密度接种于24孔板培养1 d，多聚甲醛固定15 min，室温下5%牛血清白蛋白封闭1 h，pan-CK、Vimentin与Stro-1单克隆抗体(稀释浓度为1∶1 000) 4 ℃下孵育过夜，荧光二抗(1∶10 000)避光孵育1 h，DAPI染核，荧光显微镜下扫描成像。
1.4.3 成骨与成脂诱导分化 取正常与炎症牙周膜干细胞接种培养1 d后，更换成骨诱导培养基(α-MEM+体积分数10%胎牛血清+1%谷氨酰胺+10-8 mol/L地塞米松+2 mmol/L β-甘油磷酸钠+100 μg/mL抗坏血酸)或成脂诱导培养基(α-MEM+体积分数10%胎牛血清+1 mmol/L地塞米松+5 mg/mL胰岛素+100 mmol/L吲哚美辛+ 250 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，此后每2 d换液1次，成骨诱导21 d后进行茜素红染色，成脂诱导28 d后进行油红O染色。

1.4.4 real-time PCR检测碱性磷酸酶与自噬相关因子mRNA的表达 成骨诱导分化3，7，14 d的正常牙周膜干细胞与炎症牙周膜干细胞样本中加入Trizol裂解并提取RNA，参照试剂盒进行反转录与核酸扩增，测定碱性磷酸酶、骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2、LC3B、Beclin1、ATG5的mRNA表达，获得CT值，使用2-ΔΔCT方法计算每个基因的相对表达水平，引物序列见表1。

1.4.5 Western blot检测碱性磷酸酶与自噬相关因子蛋白的表达 正常牙周膜干细胞与炎症牙周膜干细胞在成骨诱导分化3，7，14 d，吸弃培养基，刮下细胞置于离心管中，离心，弃上清，加入2×SDS-PAGE上样缓冲液，快速反复吹打，进行金属浴、离心后取上清。在10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后转膜，转移到0.45 μm聚氟乙烯膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入抗β-actin、碱性磷酸酶、LC3B、Beclin1、ATG5一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜，加入兔抗人或鼠抗人IgG辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶10 000)在室温下孵育2 h，用ECL显色液显影，于成像仪下观察并拍照，结果通过Image J软件进行蛋白条带的灰度值分析。

1.5 主要观察指标 ①免疫荧光细胞染色观察牙周膜干细胞Vimentin、pan-CK、Stro-1的表达；②茜素红染色观察牙周膜干细胞体外成骨诱导后矿化结节的形成情况；③油红O染色观察牙周膜干细胞体外成脂诱导分化后脂滴的形成情况；④Western blot检测成骨分化不同阶段碱性磷酸酶、LC3B、Beclin1、ATG5的蛋白表达；⑤real-time PCR检测成骨分化不同阶段碱性磷酸酶、骨唾液蛋白、骨钙素、Runx2、LC3B、Beclin1、ATG5 的mRNA表达。

1.6 统计学分析 两组间比较选择t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析并制作统计图。文章统计学方法已经通过河北医科大学生物统计学专家审核。

讨论

关于体外培养牙周膜干细胞模拟牙周炎的方法大致有2种：第1种方法是加入炎症刺激因子，如肿瘤坏死因子α[2]、脂多糖[8，18-20]、gasdermin-D (GSDMD)[4]、牙周细菌上清液等[21]，通过诱导牙周膜干细胞炎症因子表达来模拟牙周炎，也有几种因子联用的(肿瘤坏死因子α+白细胞介素1β+脂多糖)[22]；第2种方法是从牙周炎患者的牙周膜中提取牙周膜干细胞[23-24]，已有研究表明牙周炎患者来源牙周膜干细胞的生物学特性与正常来源牙周膜干细胞是不一样的，更能反映牙周炎患者的真实情况。该研究采用第2种方法，以牙周炎患者牙周膜中培养获得的牙周膜干细胞作为研究对象，以期获得更接近临床患者真实情况的实验结果。实验结果显示，原代培养相同天数条件下，从组织块中爬出的炎症牙周膜干细胞比正常牙周膜干细胞明显减少。传代培养相同天数条件下，炎症牙周膜干细胞密度较正常牙周膜干细胞少。SUN等[24]也报道了类似的结果，牙周炎来源牙周膜干细胞体外形成的细胞膜片厚度较正常来源牙周膜干细胞薄，可能与炎症影响牙周膜干细胞的增殖有关。

牙周膜干细胞成骨分化过程是由成骨相关基因调控，其中碱性磷酸酶在促进牙周组织再生中发挥着重要作用[25]。研究发现，肿瘤坏死因子α刺激牙周膜干细胞后碱性磷酸酶表达明显降低，显著抑制了成骨分化潜能[26]。牙周炎症微环境下，碱性磷酸酶表达和活性降低，牙周组织成骨能力下降[27]。该实验研究炎症环境下牙周膜干细胞矿化结节的改变和碱性磷酸酶的表达，发现相比较正常牙周膜干细胞组，炎症牙周膜干细胞组矿化结节明显减少，碱性磷酸酶蛋白和mRNA表达均明显下调，与上述研究结果一致。

LC3现被用作自噬的特异性标记[28-31]。因LC3处于通路的下游，该研究也采用LC3作为衡量自噬的检测指标。Beclin1是酵母Atg6的哺乳动物直系同源物，在自噬过程中起着核心作用[32]。ATG5对自噬体产生具有促进作用，与LC3、Beclin1同样在牙周膜干细胞的成骨分化中起关键作用[33]。研究证实，乳酸通过MCT1-mTOR信号通路降低Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和ATG5的表达以抑制牙周膜干细胞矿化结节的形成和成骨相关蛋白的表达，而自噬诱导剂雷帕霉素能部分挽救成骨相关蛋白的下调[34]，由此可见抑制自噬会抑制成骨分化。该实验发现炎症降低了牙周膜干细胞成骨分化7，14 d自噬相关蛋白和mRNA的表达，然而炎症对牙周膜干细胞成骨分化3 d的自噬降低作用并不明显。由此可见，炎症环境下自噬和成骨的变化趋势并不一致，可能存在炎症在成骨分化前期促进自噬的上调。

实验表明，炎症可减少牙周膜干细胞的矿化结节形成和碱性磷酸酶的表达，并显著下调成骨分化7，14 d的自噬表达水平，为炎症状态下牙周膜干细胞成骨与自噬的相关机制分析打下基础，但仍需要进一步的细胞通路实验以探究其内在调控机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

炎症与正常牙周膜来源牙周膜干细胞的成骨分化能力和自噬水平

Osteogenic ability and autophagy level between normal and inflammatory periodontal ligament stem cells

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