碳点-普鲁士蓝纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变

doi:10.12307/2023.177

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (25): 4038-4044.doi: 10.12307/2023.177

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碳点-普鲁士蓝纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变

曹志鹏1，2，石宇1，2，李克1，2，林文正1，姜乐涛1，卜文振1，2，朱海3，杜建伟1，王辉辉2，陈昊1，2

1扬州大学附属医院，江苏省扬州市 225000；2扬州大学医学院-转化医学研究院，江苏省扬州市 225000；3淮安市第一人民医院骨科，江苏省淮安市 223001

收稿日期:2022-02-28 接受日期:2022-05-26 出版日期:2023-09-08 发布日期:2023-01-17
通讯作者: 陈昊，博士，教授，博士生导师，扬州大学附属医院骨科，江苏省扬州市 225000；扬州大学医学院-转化医学研究院，江苏省扬州市 225000 王辉辉，博士，讲师，硕士生导师，扬州大学医学院-转化医学研究院，江苏省扬州市 225000
作者简介:曹志鹏，男，1990年生，河南省信阳市人，汉族，扬州大学医学院在读硕士，医师，主要从事椎间盘退行性病变方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(8217090346)，项目负责人：陈昊；江苏省基础研究计划(自然科学基金)面上项目(SBK2021022619)，项目负责人：陈昊；江苏省高校基础科学(自然科学)研究面上项目(21KJB320009)，项目负责人：陈昊；淮安市自然科学研究计划(HAB202023)，项目负责人：朱海

Carbon dot Prussian blue nanoenzyme antioxidative stress delays intervertebral disc degeneration

Cao Zhipeng1, 2, Shi Yu1, 2, Li Ke1, 2, Lin Wenzheng1, Jiang Letao1, Bu Wenzhen1, 2, Zhu Hai3, Du Jianwei1, Wang Huihui2, Chen Hao1, 2

1Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China; 2Institute of Translational Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China; 3Department of Orthopedics, First People’s Hospital, Huai’an 223001, Jiangsu Province, China

Received:2022-02-28 Accepted:2022-05-26 Online:2023-09-08 Published:2023-01-17
Contact: Chen Hao, PhD, Professor, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China; Institute of Translational Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China Wang Huihui, MD, Lecturer, Master’s supervisor, Institute of Translational Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China
About author:Cao Zhipeng, Master candidate, Physician, Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China; Institute of Translational Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225000, Jiangsu Province, China
Supported by:
General Project of National Natural Science Foundation of China, No. 8217090346 (to CH); Jiangsu Basic Research Program (Natural Science Foundation) (General Project), No. SBK2021022619 (to CH); Basic Science of Jiangsu Province Universities (Natural Science) Research Project, No. 21KJB320009 (to CH); Huaian Natural Science Research Program, No. HAB202023 (to ZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

纳米酶：指具有纳米材料的独特性能及催化功能的模拟酶，具有经济、稳定、高催化效率和规模化制备的特点，在医学、化工等多领域应用广泛。
椎间盘退变：椎间盘退行性改变包括髓核、软骨终板以及椎间盘纤维环的退变，可表现出脱水、钙化、积气、萎缩变薄、膨出、骨性终板硬化及椎体缘增生肥大等改变。

背景：近年来研究发现氧化应激是椎间盘退变的重要激活机制，具有类酶活性的纳米颗粒在抗氧化应激等领域受到大量关注，但有关其在延缓椎间盘退变方面的探究较少。
目的：构建碳点-普鲁士蓝复合纳米颗粒，通过体内外实验验证其清除过量活性氧、调控氧化应激延缓大鼠椎间盘退变的作用。
方法：基于水热法，以聚乙烯亚胺为碳源，与柠檬酸、FeCl3·6H2O混合制备碳点，随后在其表面原位合成普鲁士蓝，构建碳点-普鲁士蓝复合纳米颗粒(记为CD-PBs)。①体外实验：提取SD大鼠原代髓核细胞，培养至3代，然后分别加入H2O2溶液(对照组)、CD-PBs+H2O2溶液(实验组)共培养，以单独培养的细胞为空白对照，细胞被处理24 h后，利用荧光探针检测细胞内活性氧水平与线粒体膜电位，实时定量PCR分析细胞Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α mRNA表达。②体内实验：将30只SD大鼠随机分3组，空白对照组不做任何处理，对照组建立尾椎椎间盘退变模型，实验组将CD-PBs溶液注射至退变椎间盘间隙内，术后8周，病理切片观察椎间盘形态。

结果与结论：①体外实验：对照组细胞内活性氧水平高于空白对照组(P < 0.05)，实验组细胞内活性氧水平低于对照组(P < 0.05)。对照组细胞线粒体荧光强度低于空白对照组(P < 0.05)，实验组细胞线粒体荧光强度高于对照组(P < 0.05)。与空白对照组比较，对照组Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达量下降(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α mRNA表达量升高(P < 0.05)；与对照组比较，实验组Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达量升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α mRNA表达量下降(P < 0.05)。②体内实验：苏木精-伊红染色显示，对照组大鼠椎间盘间隙高度明显降低，纤维环排列紊乱，且髓核内结构破坏，细胞和基质大量丢失；实验组大鼠椎间盘椎间隙高度下降不明显，髓核部分丢失，纤维环结构稍显紊乱，较对照组有明显改善。③结果表明：碳点-普鲁士蓝复合纳米颗粒可通过清除细胞内活性氧、抗氧化应激延缓椎间盘退变。

https://orcid.org/0000-0001-5337-5242(曹志鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 碳点, 纳米酶, 普鲁士蓝, 活性氧, 线粒体, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: In recent years, oxidative stress has been found to be an important activation mechanism of intervertebral disc degeneration. Nanoparticles with enzyme-like activity have attracted a lot of attention in the study of anti-oxidant stress, but there is little research on delaying intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To construct carbon dot Prussian blue nanoparticles (PEI-600-Fe C-dots Prussian Blue Nanoparticles, CD-PBs), to verify that CD-PBs can eliminate excessive reactive oxygen species, regulate oxidative stress and delay intervertebral disc degeneration in rats by in vitro and in vivo experiments.
METHODS: Based on the hydrothermal method, polyethyleneimine was used as carbon source to prepare carbon dots by mixing with citric acid and FeCl3•6H2O, and then Prussian blue was synthesized in situ on its surface to construct CD-PBs. (1) In vitro experiment: SD rat nucleus pulposus cells were extracted and cultured for three generations. Then, H2O2 solution (control group) and CD-PBs +H2O2 solution (experimental group) were added for co-culture, and the cells cultured alone were used as blank controls. After the cells were treated for 24 hours, the level of intracellular reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential were detected by fluorescent probes. The mRNA expression levels of type II collagen, aggrecan, matrix metalloproteinase 3 and tumor necrosis factor α were analyzed by real-time quantitative PCR. (2) In vivo experiment: 30 SD rats were randomly divided into three groups. The blank control group did not do any treatment. In the control group, a model of coccygeal intervertebral disc degeneration was established. In the experimental group, CD-PBs solution was injected into the degenerated intervertebral disc space. At 8 weeks after operation, the morphology of intervertebral disc was observed by pathological section.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiments: The intracellular reactive oxygen species level in the control group was higher than that in the blank control group (P < 0.05). The level of intracellular reactive oxygen species in the experimental group was lower than that in the control group (P < 0.05). The mitochondrial fluorescence intensity of the control group was lower than that of the blank control group (P < 0.05). The mitochondrial fluorescence intensity of the experimental group was higher than that of the control group (P < 0.05). Compared with the blank control group, the mRNA expression of type II collagen and aggrecan decreased in the control group (P < 0.05); the mRNA expression of matrix metalloproteinase 3 and tumor necrosis factor α increased (P < 0.05). Compared with the control group, the mRNA expression of collagen type II and aggrecan in the experimental group increased (P < 0.05); the mRNA expression of matrix metalloproteinase 3 and tumor necrosis factor α decreased (P < 0.05). (2) In vivo experiment: Hematoxylin-eosin staining showed that the height of the intervertebral disc space in the control group was significantly reduced; the arrangement of the annulus fibrosus was disordered; the structure of the nucleus pulposus was destroyed, and the cells and matrix were lost in large quantities. In the experimental group, the height of the intervertebral disc space did not decrease significantly; the nucleus pulposus was partially lost, and the structure of the annulus fibrosus was slightly disordered, which was significantly improved compared with the control group. (3) The results showed that CD-PBs could prevent oxidative stress by removing intracellular reactive oxygen species and delay intervertebral disc degeneration.

Key words: intervertebral disc degeneration, carbon dot, nanozyme, Prussian blue, reactive oxygen species, mitochondria, oxidative stress

中图分类号:

曹志鹏, 石宇, 李克, 林文正, 姜乐涛, 卜文振, 朱海, 杜建伟, 王辉辉, 陈昊. 碳点-普鲁士蓝纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(25): 4038-4044.

Cao Zhipeng, Shi Yu, Li Ke, Lin Wenzheng, Jiang Letao, Bu Wenzhen, Zhu Hai, Du Jianwei, Wang Huihui, Chen Hao. Carbon dot Prussian blue nanoenzyme antioxidative stress delays intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(25): 4038-4044.

图/表（结果） 7

2.1 CD-PBs材料的表征
2.1.1 碳点与CD-PBs的微观图像及表面电荷如图1所示，透射电镜图像显示合成的碳点分布均匀，粒状直径为7-12 nm，在其表面原位合成普鲁士蓝后形成的CD-PBs直径为40-50 nm。碳点Zeta电位为(27.42±0.26) mV；CD-PBs Zeta电位为(11.97±0.38) mV。

2.1.2 CD-PBs表面元素组成如图2A-C所示，CD-PBs表面有明显的Fe-C峰(707.6，720.5 eV)、Fe-N峰(396.9 eV)和C-N峰(400.4 eV)。该结果显示碳点表面存在普鲁士蓝的特征峰，提示普鲁士蓝在碳点表面成功合成。
2.1.3 碳点及CD-PBs的类酶活性如图2D-F所示，类酶活性检测结果显示，不同时间点CD-PBs催化H2O2产生的氧气较碳点显著增多；在0-200 mg/L质量浓度范围内，同质量浓度的CD-PBs相比碳点的超氧化物歧化酶活性高10%-30%；碳点不具备清除羟自由基能力，在其表面原位合成普鲁士蓝之后对羟自由基的清除能力随浓度升高而增强。

2.2 大鼠髓核细胞形态及鉴定提取的原代髓核细胞传至3代培养24 h，进行聚集蛋白聚糖免疫化学荧光染色，见图3，镜下见细胞轮廓清晰可见，形态多为梭形。

2.3 CD-PBs体外实验结果
2.3.1 CD-PBs的细胞相容性如图4所示，H2O2浓度在100 μmol/L以上时会对细胞存活率产生显著影响(P < 0.05)，故后续实验采用100 μmol/L浓度H2O2干预髓核细胞；CD-PBs溶液质量浓度在200 mg/L以下时细胞存活率均在90%以上，且细胞存活率与空白对照组无差异(P > 0.05)，根据该实验结果确定后续体外CD-PBs给药质量浓度为100 mg/L。

2.3.2 CD-PBs对细胞内活性氧水平的影响如图5A-D所示，H2O2能够诱导髓核细胞内产生大量活性氧，对照组超氧化物阴离子荧光强度明显增强，平均荧光强度较空白对照组提升约6.12倍(P < 0.001)，实验组平均荧光强度下降至空白对照组的1.99倍。
2.3.3 CD-PBs对细胞线粒体的影响如图5E-H所示，H2O2处理后髓核细胞密度下降，线粒体平均荧光强度相比空白对照组下降了约66%，实验组髓核细胞线粒体荧光强度有所恢复，相比空白对照组下降约38%。

2.3.4 CD-PBs对细胞相关基因相对表达量的影响如图6所示，相比空白对照组，对照组Ⅱ型胶原基因表达量减少约62%，聚集蛋白聚糖基因表达量减少约59%，炎症相关基因肿瘤坏死因子α表达增加4.14倍，同时分解代谢相关基因基质金属蛋白酶3表达量增加5.59倍，而CD-PBs处理能够减缓H2O2刺激带来的不利影响。

2.4 CD-PBs体内实验结果大鼠椎间盘标本苏木精-伊红染色显示，空白对照组椎间盘形态完整，椎间隙高度明显，髓核饱满且与周围组织分界清晰，纤维环排列有序；对照组椎间隙高度明显降低，纤维环排列紊乱，且髓核内结构破坏，细胞和基质大量丢失；实验组椎间隙高度较空白对照组稍下降，髓核部分丢失，纤维环结构稍显紊乱，较对照组有明显改善，见图7。

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引言

椎间盘退变是导致腰背痛的主要原因，随着人口老龄化加剧，逐年增加的患者数量所带来的治疗费用导致巨大社会经济负担[1]。目前，造成椎间盘退变的机制尚不清楚，治疗靶点选择有限，当前的保守或手术干预治疗不能逆转潜在的椎间盘退变或促进椎间盘再生[2]，因此，探索椎间盘退变的新机制、发现治疗新靶点迫在眉睫。活性氧是一类含有氧的高活性分子，包括单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)、超氧化物(O2•−)和羟基自由基(•OH)，主要发挥调节细胞基质代谢、炎症、凋亡、自噬和衰老作用[3-6]。大量研究表明，活性氧是椎间盘细胞信号网络中的重要中间体，年龄、营养、创伤等因素可引起椎间盘细胞中产生过量活性氧，引发氧化应激，进而促进了基质降解和炎症，导致椎间盘微环境中活细胞的数量减少和功能减退，进一步加重椎间盘退变。因此，通过清除过量活性氧抗氧化应激，被认为是治疗椎间盘退行性改变的有效途径[7]。
天然酶虽具有较高的催化效率，但在应用上也存在一些局限性，包括制备和纯化成本高、反应条件差、稳定性差等[8]。尽管许多被评估为抗氧化剂的小分子在基础实验研究中显示出治疗潜力，但临床试验结果仍未能达到预期[9-10]。碳点因其超小尺寸、优良的可调光学性能、高水溶性和良好生物相容性而被广泛应用于纳米医学[11-12]，有相关文献报道了碳点根据其固有的类酶样活性表现出自由基的清除能力[13]，同时可通过掺杂金属提高自由基清除能力[14]，碳点所有方面的理想理化性质使其成为酶促应用的首选纳米材料。虽然碳点的类酶活性虽已被证实，但仍偏低，将其作为抗氧化剂应用于生物医学领域需进一步改进。近年来有研究发现，普鲁士蓝纳米粒子具备人工过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及清除羟基自由基(•OH)等生物酶活性[15-16]，是有效的活性氧清除剂，且普鲁士蓝纳米酶在强酸性或碱性环境中表现出较高的活性，比天然酶更稳定[17-18]。但普鲁士蓝纳米颗粒存在水溶性较差、分散度不佳、细胞相容性较差的问题。基于课题组前期研究基础[19]，基于水热法，以聚乙烯亚胺为碳源，与柠檬酸、FeCl3·6H2O合成制备碳点，随后在其表面原位合成普鲁士蓝的方法构建一种新型核壳样复合材料——碳点-普鲁士蓝复合纳米颗粒(PEI-600-Fe C-dots-Prussian Blue Nanoparticles，CD-PBs)，此次实验主要验证该复合材料体外抗氧化应激效应及其在体内延缓椎间盘退变方面的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计 CD-PBs复合纳米材料的制备及表征，体外细胞学及体内动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年5-12月在扬州大学医学院-转化医学研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 试剂及设备支化聚乙烯亚胺、戊巴比妥钠、胎牛血清、柠檬酸、FeCl3·6H2O (Sigma，美国)；DMEM/F12培养基(Gibco，美国)；兔抗大鼠Aggrecan多抗(abclonal，美国)；FITC 标记的山羊抗兔IgG(Abcam，美国)；Tecnai 12透射电镜(飞利浦，荷兰)；马尔文粒子分析仪(Malvern，英国)；多参数分析仪(Cany，中国)；多功能酶标仪(TECAN，奥地利)；总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(碧云天，上海)；CCK-8试剂盒、羟自由基清除能力检测试剂盒(索莱宝，北京)；双氧水(阿拉丁，上海)；线粒体红色荧光探针Mito-Tracker Red CMXRos、超氧化物阴离子荧光探针(碧云天，上海)；荧光显微镜(Nikon，日本)。
1.3.2 实验动物 36只雄性SD大鼠，10周龄，体质量200-260 g；其中6只大鼠饲养2周后用于提取椎间盘髓核细胞，余30只用于后续实验。所用实验动物由常州卡文斯实验动物有限公司提供，实验动物许可证：SYXK(苏)2021-0013、 SYXK(苏)2021-0027。实验过程中对动物的处置符合 2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。实验方案经扬州大学医学院动物实验伦理委员会批准，批准号为：202103084。
1.4 实验方法
1.4.1 制备CD-PBs复合纳米材料
制备碳点：称取聚乙烯亚胺-600(600 mg，0.001 mol)和柠檬酸(192.1 mg，0.001 mol)溶解在去离子水(20 mL)中。随后在溶液中加入FeCl3·6H2O(270.3 mg，0.001 mol)，室温下搅拌30 min。将所得溶液转移到20 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，并在180 ℃下反应10 h。高压釜自然冷却到室温，得到的碳点用G25凝胶过滤层析法纯化。
制备CD-PBs：称取纯化所得碳点(90 mg)和FeCl3(48.66 mg，0.3 mmol)溶解在去离子水(90 mL)中，于圆底烧瓶中28 ℃共水浴搅拌1 h。称取K4[Fe(CN)6]·3H2O(63.36 mg，0.15 mmol)溶于10 mL去离子水中，30 min滴入上述水浴烧瓶内。滴毕三者继续共水浴搅拌30 min，得到的溶液使用500 Da透析袋透析24 h后置于冻干机冻干。
1.4.2 CD-PBs材料表征及类酶活性鉴定使用透射电镜、马尔文粒子分析仪、光电子能谱仪等设备对CD-PBs进行材料表征。
碳点及CD-PBs类酶活性测定：①人工过氧化氢酶活性：过氧化氢酶的作用是将H2O2分解成水和氧气，通过多参数分析仪的电极在室温下对溶液中的溶解氧含量进行测定，从而测定不同浓度碳点及CD-PBs人工过氧化氢酶活性。②人工超氧化物歧化酶活性：超氧化物歧化酶活性的测定检测原理为黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2•−)，可将氮蓝四唑还原为甲臜，后者在560 nm处有强吸收。超氧化物歧化酶可清除超氧阴离子，抑制甲臜的形成。反应液蓝色愈浅，说明超氧化物歧化酶活性愈高。③羟自由基的清除能力：使用羟自由基清除能力检测试剂盒验证质量浓度为20，100 mg/L的碳点及CD-PBs对•OH的清除能力。根据试剂说明，H2O2/Fe2+通过芬顿反应产生•OH，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+，导致536 nm的吸光度值下降，样本清除羟自由基的能力根据各组吸光度下降速率的抑制程度计算。
1.4.3 体外实验
大鼠原代髓核细胞提取、培养及鉴定：①提取、培养：随机选择6只SD大鼠，2%戊巴比妥钠过量麻药(10 mL/kg)处死大鼠，消毒尾部后从尾椎6-7处离断，剥离表皮，乙醇浸泡后转移至灭菌细胞台，剥除韧带、暴露各节段椎间盘。切开椎间隙，摘取尾椎7-8、8-9、9-10中心髓核组织，切碎，离心，0.25%胰酶消化后离心，移至培养皿，0.2%Ⅱ型胶原酶37 ℃消化3 h。消化后离心，加入完全培养基(含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)吹打混匀，移至100 mm培养皿培养。P2-P5代的髓核细胞为实验所用。②鉴定：髓核细胞在24孔板内传至3代后吸除培养基，PBS清洗2次，40 g/L多聚甲醛固定后清洗3次，封闭液覆盖孔板，密封后室温避光孵育2 h，去除封闭液，滴加抗体稀释液配制的聚集蛋白聚糖一抗工作液(1∶200稀释)，置于4 ℃避光孵育过夜；次日回收一抗，PBS清洗3次，然后在样本上滴加荧光二抗(1∶200稀释)，室温避光孵育2 h，回收二抗，PBS清洗3次；DAPI染色液覆盖孔板，室温避光孵育5 min后，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察并采集图像。
细胞毒性检测：CCK-8试剂盒检测H2O2或CD-PBs对髓核细胞活力的影响。将第3代髓核细胞转移至96 孔板中，细胞密度6 000个/孔，并与不同浓度的H2O2(0，25，50，100，200，400，800 µmol/L)或CD-PBs溶液(0，25，50，100，200，400，800 mg/L)共培养24 h。PBS洗涤髓核细胞后，孔中更换为100 µL含CCK-8溶液培养基，37 ℃孵育30 min后，使用分光光度计在450 nm 波长处检测吸光度值。筛选适宜浓度的H2O2与CD-PBs溶液用于后续实验。
细胞活性氧分析：采用活性氧检测荧光探针对细胞内的活性氧水平进行检测，过氧化物指标二氢乙啶在细胞质中呈蓝色荧光，被氧化进入细胞的DNA 中，使细胞呈现明亮红色荧光。提取第3代髓核细胞，细胞密度6 000个/孔，分3组培养，空白对照组加入DMEM/F12培养基培养24 h；对照组加入含100 µmol/L H2O2的完全培养基培养24 h；实验组加入100 mg/L CD-PBs溶液预处理30 min，随后更换为含100 µmol/L H2O2的完全培养基培养24 h。培养结束后更换培养基，将荧光探针浓度稀释至20 µmol/L，每孔滴入10 μL荧光探针染色液，37 ℃避光孵育30 min，孵育结束后更换新鲜培养液，荧光显微镜下拍摄染色图像。
线粒体染色：线粒体红色荧光探针Mito-Tracker Red CMXRos 能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位。髓核细胞实验分组处理同上，使用Mito-Tracker Red探针37 ℃共孵育30 min，40 g/L多聚甲醛固定，DAPI染色液室温染色10 min后，荧光显微镜下观察。

实时定量PCR分析：将第3代髓核细胞按2×105/孔的密度种于6孔板，分3组处理，依次应用PBS(空白对照组)、H2O2(对照组)、CD-PBs+H2O2(实验组)处理24 h后，使用Trizol裂解细胞，提取RNA，按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA，RT-PCR分别检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子α、GAPDH表达水平，其中GAPDH作为内参。引物设计由北京擎科生物科技有限公司代为设计以及合成，见表1。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃10 s；60 ℃ 30 s，循环反应重复 40 次。

1.4.4 体内实验
分组与造模：采用随机数字表法将 30只SD 雄性大鼠随机分为空白对照组、对照组、实验组，每组10只。对照组及实验组术前定位并确定第7-8、8-9尾椎(Co7-8、Co8-9)并做标记，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，根据参考文献[20]，消毒穿刺部位皮肤，使用22 G针头垂直穿入椎间隙并贯穿，旋转针头360°，停留30 s后拔出。
局部给药方案：造模后即刻，实验组根据预实验结果使用微量注射器以1 g/L的浓度局部注射10 µL CD-PBs溶液，对照组同节段给予10 µL PBS局部注射。取Co7-8椎间盘标本用于制作组织切片。

组织形态评估：术后8周，每组取6只大鼠，过量麻药处死后取Co7-8椎间盘，苏木精-伊红染色观察椎间盘纤维环形态、髓核分界、髓核细胞形态。参考以往的研究计算组织学评分[21]，组织学分级系统分为4类，从4分(正常)到12分(严重退变)，见表2。

1.5 主要观察指标 CD-PBs体外抗氧化应激效应及其在体内延缓椎间盘退变方面的作用。
1.6 统计学分析计量资料采用x±s表示，两组间连续变量采用独立t检验，3 组以上的组间差异采用单因素方差分析
(ANOVA)。应用 GraphPad Prism software version 9 进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经通过扬州大学医学院生物统计学专家审核。

讨论

慢性腰痛严重影响患者的生活质量，已成为全球性的健康问题。椎间盘退变是导致慢性腰痛的重要原因之一，40%的下腰痛是由椎间盘退变引起的，其发病率随着年龄的增长而增加[22]。目前有大量机制研究发现，椎间盘退变与氧化应激关联密切[23-25]。活性氧过量产生诱使氧化应激发生，线粒体呼吸链中的低效电子转移被认为是活性氧的主要来源[26]，线粒体氧化还原状态的变化与衰老过程的启动显著关联[27]。内源性抗氧化剂(如过氧化氢酶家族、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶)及外源性抗氧化剂(如还原性谷胱甘肽、类胡萝卜素、维生素C和维生素E)构成机体内活性氧清除系统[28]，当细胞因某些内、外源性因素改变，其氧化-抗氧化平衡被打破，活性氧过量产生和累积后在多个步骤中阻碍受损的核和线粒体DNA修复，导致细胞基因组不稳定[29]。因此有研究认为，髓核细胞线粒体功能受损参与椎间盘退变的发生发展[30]，受损的线粒体与活性氧异常升高在细胞走向衰老、凋亡过程中互为因果，形成恶性循环，加速椎间盘退变进程[31]。以抗氧化应激作为治疗靶点在针对椎间盘的保护作用方面有较多实验研究[32-35]，研究结果显示，通过多种机制和途径靶向氧化应激，降低细胞内活性氧水平，能够有效维持细胞线粒体稳态，降低炎症、分解代谢、衰老、凋亡等相关基因表达，进而维持椎间盘结构稳定，延缓椎间盘退行性病变。
如前言所述，现有的抗氧化治疗方案受限于制备成本或疗效因素，未能达到预期。因此，许多研究尝试开发人工酶来取代天然酶，其中新一代人工纳米酶是目前研究的热点[36]。2007年，GAO等[37]首先发现Fe3O4纳米颗粒具有类过氧化物酶活性，并将其定义为“纳米酶”。纳米酶是一种具有类酶活性的纳米材料，主要类酶活性包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及过氧化物酶等[37]。与天然酶相比，纳米酶在恶劣环境下具有相对较高的物理化学稳定性、更高的耐久性和更低的成本，引起了相当大的关注。目前，纳米酶主要由金属和金属氧化物组成，因为金属活性中心可以简单地模拟天然酶的催化电子氧化还原过程[38]。近年来，许多具有催化特性的纳米酶被研发出来，并应用于生物医学各领域，包括影像学成像、心血管系统疾病、神经系统退行性疾病、骨骼系统退行性疾病、肿瘤等[39]。CHEN等[40]合成了壳聚糖衍生的氮掺杂碳点(N-CD)，该材料有效消除了核因子κB 受体活化因子配体诱导的活性氧生成升高，体外实验证明其有效减弱了破骨细胞生成和骨吸收。HOU等[41]设计了空心普鲁士蓝纳米酶(HPBzymes)，证明该纳米酶可重塑微环境，保护软骨细胞，显著延缓创伤性关节炎的进展。目前，关于纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变相关报道极少，作者设计的CD-PBs制备工艺简便、合成成本低，具备高效类酶活性，细胞相容性好，可在体外有效清除过量活性氧，有助于维持线粒体稳态，并在体内展现出延缓椎间盘组织退变的效果，针对该复合材料的进一步改进及其具体发挥作用的分子生物学机制研究尚在进行，需更加深入的实验进一步论证。
总之，椎间盘退变是漫长且机制复杂、影响因素众多的病理生理过程，其发病机制、预防和治疗方式也始终是研究焦点。类似于椎间盘退变，许多骨与关节衰老相关退行性疾病都存在病程漫长及传统的临床治疗方案疗效有限、不良反应大、花费高昂等现存问题，难以减轻该类疾患对经济社会和家庭带来的重大负担。小分子靶向药物、干细胞疗法、基因治疗、纳米技术或多项技术联合的非手术疗法为该类慢性衰老相关退行性疾病提供了更多潜在方案，这些方案突出特点在于早期、微创或无创、靶向性强、更加智能化，值得更多更深入的研究探索。目前许多纳米材料已逐步进入实验室研究向临床应用转化阶段，未来有望在相关领域开辟出一些新的疾病防治原理与技术，高效、精准为患者解决病痛，造福社会大众。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

碳点-普鲁士蓝纳米酶抗氧化应激延缓椎间盘退变

Carbon dot Prussian blue nanoenzyme antioxidative stress delays intervertebral disc degeneration

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