琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的制备与性能表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1728

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (18): 2900-2908.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1728

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琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的制备与性能表征

李静静¹，郭璇¹，解军¹，黄磊¹，索金荣²，傅松涛^1，2,3

¹山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030001；²山西宾大干细胞科技有限公司，山西省太原市 030001；³山西省生物医药健康研究生教育创新中心，山西省太原市 030001

收稿日期:2019-02-19 出版日期:2019-06-28 发布日期:2019-06-28
通讯作者: 傅松涛，教授，山西医科大学基础医学院，山西省太原市 030001；山西宾大干细胞科技有限公司，山西省太原市 030001；山西省生物医药健康研究生教育创新中心，山西省太原市 030001
作者简介:李静静，女，1990年生，河南省驻马店市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事组织修复与再生及生物支架材料研究。

Preparation of agarose/gelatin/hyaluronic acid/extracellular matrix hydrogel and its property characterization

Li Jingjing¹, Guo Xuan¹, Xie Jun¹, Huang Lei¹, Suo Jinrong², Fu Songtao^{1, 2, 3}

¹School of Basic Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ²Shanxi Binda Stem Cell Technology Co., Ltd., Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; ³Shanxi Provincial Biomedical Health Graduate Education Innovation Center, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2019-02-19 Online:2019-06-28 Published:2019-06-28
Contact: Fu Songtao, Professor, School of Basic Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Shanxi Binda Stem Cell Technology Co., Ltd., Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; Shanxi Provincial Biomedical Health Graduate Education Innovation Center, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Li Jingjing, Master candidate, School of Basic Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

软骨组织工程：是将体外扩增的种子细胞，植入有良好生物相容性且能够在体内逐渐降解吸收的各种支架材料中，并加入能够诱导细胞增殖定向分化的生长因子，使之再生出具有生物功能的软骨组织，最终将此复合软骨材料植入到损伤部位，以达到修复软骨缺损的目的。

温敏性水凝胶：水凝胶是采用天然或人工合成高分子物质，通过物理或化学交联形成的一种可在水中溶胀并保持大量水分的聚合物高分子材料。温敏性水凝胶结构中具有一定比例的亲水和疏水基团，温度变化可影响这些基团的疏水作用和大分子链间的氢键作用，改变水凝胶的网络结构，产生体积相变，其具有高含水量，同时具有与天然细胞外基质相似的三维空间结构，能够传递各种力学和生物信号。

背景：由于软骨组织无血管结构，无神经组织，缺乏自我修复与再生的内在能力，因此临床上软骨损伤的修复仍然是一个重大挑战。

目的：旨在制备一种温敏性可注射生物活性水凝胶，用于软骨组织工程。

方法：将0.4%琼脂糖、10%明胶和10 g/L透明质酸溶液混合，制备琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶，然后向其内分别加入0，10，20，30 g/L的软骨细胞外基质，制备4种温敏性可注射生物活性水凝胶，进行扫描电镜、透射电镜、平衡溶胀率、生物力学强度和体外降解率检测。将含20 g/L软骨细胞外基质的温敏性可注射生物活性水凝胶与软骨细胞-骨髓间充质干细胞共培养，培养1，3，7 d，通过活/死细胞荧光双染法评价该水凝胶的细胞相容性。

结果与结论：①扫描电镜显示，4种水凝胶均具有良好的三维网格结构，孔径较大；透射电镜显示，细胞外基质颗粒均匀分布于水凝胶中，颗粒粒径主要在50-200 nm；②随着加入细胞外基质颗粒质量浓度的增加，水凝胶的平衡溶胀率降低；③浸泡于PBS溶液4周时，含0，10，20，30 g/L细胞外基质水凝胶的体外降解率分别为42.32%，67.36%，89.05%和99.47%；④当添加细胞外基质颗粒质量浓度在0-20 g/L时，水凝胶的生物力学强度逐渐增加；⑤培养7 d内，软骨细胞-骨髓间充质干细胞在水凝胶内均匀地分布与生长，并不断增殖，细胞存活率均在90%以上；⑥结果表明细胞外基质颗粒修饰的琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶，是一种可用于软骨组织工程的良好医用生物材料。

ORCID: 0000-0002-2651-8137(李静静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 可注射水凝胶, 温敏性, 明胶, 透明质酸, 琼脂糖, 细胞外基质, 软骨细胞外基质颗粒, 软骨组织工程, 软骨修复

Abstract:

BACKGROUND: Due to no vascular structure or nerve tissue, cartilage tissue lacks the intrinsic ability of self-repair and regeneration. Therefore, the repair of cartilage defect in clinic remains a challenge.

OBJECTIVE: To prepare a thermo-sensitive injectable bioactive hydrogel used for cartilage tissue engineering.

METHODS: Agarose/gelatin/hyaluronic acid hydrogel was prepared by mixing 0.4% agarose, 10% gelatin and 10 g/L hyaluronic acid solution. Then 0, 10, 20, and 30 g/L cartilage extracellular matrix particles were added into the hydrogel respectively to prepare four kinds of thermo-sensitive injectable bioactive hydrogels, for further scanning electron microscope, transmission electron microscope, equilibrium swelling ratio, biomechanical strength and degradation rate. The thermo-sensitive injectable bioactive hydrogel containing 20 g/L cartilage extracellular matrix was co-cultured with chondrocyte-bone marrow mesenchymal stem cells for 1, 3, and 7 days, and the cytocompatibility was assessed by live/dead fluorescence double staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that all four hydrogels had good three-dimensional grid structure and large pore size. Transmission electron microscope showed that extracellular matrix particles were evenly distributed in the hydrogels, and the particle size was mainly in the range of 50-200 nm. (2) With the extracellular matrix particle concentration increasing, the equilibrium swelling rate of the hydrogel was decreased. (3) The degradation rate in vitro in the four groups of hydrogels containing 0, 10, 20, and 30 g/L extracellular matrix particles immersed in PBS for 4 weeks was 42.32%, 67.36%, 89.05% and 99.47%, respectively. (4) When the concentration of extracellular matrix particles was added at 0-20 g/L, the biomechanical strength of the hydrogel was gradually increased. (5) Within 7 days after culture, chondrocytes-bone marrow mesenchymal stem cells were uniformly distributed and grew in the hydrogel and proliferated continuously, with the cell survival rate of above 90%. (6) These results showed that the agarose/gelatin/hyaluronic acid hydrogel modified with extracellular matrix particles is a good medical biomaterial that can be used for cartilage tissue engineering.

Key words: injectable hydrogel, thermo-sensitivity, gelatin, hyaluronic acid;, agarose, extracellular matrix, cartilage extracellular matrix particles, cartilage tissue engineering, cartilage repair

中图分类号:

李静静，郭璇，解军，黄磊，索金荣，傅松涛. 琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的制备与性能表征[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(18): 2900-2908.

Li Jingjing, Guo Xuan, Xie Jun, Huang Lei, Suo Jinrong, Fu Songtao. Preparation of agarose/gelatin/hyaluronic acid/extracellular matrix hydrogel and its property characterization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(18): 2900-2908.

图/表（结果） 7

2.1 水凝胶支架的形态观察琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶支架表现为淡黄色透明状凝胶结构，而琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶/细胞外基质水凝胶支架表现为一个黄色半透明状固态支持结构，随着细胞外基质颗粒质量浓度的增加，水凝胶的浑浊度逐渐增加，而且所有水凝胶支架均可塑成简单的柱状体，见图1A，经过冷冻干燥后，各组水凝胶均呈现为多孔海绵状结构，见图1B。

2.2 水凝胶支架及细胞外基质颗粒的超微结构

扫描电镜观察表明：4组样品均呈现高度互连且松散的不规则多孔网络结构，未添加细胞外基质颗粒水凝胶的凝胶孔径较均匀，并且孔隙光滑；添加细胞外基质颗粒后，通过光的透射情况可观察到水凝胶的凝胶孔径显著增大，并且孔壁逐渐变得粗糙，见图2，这可能是由于添加的细胞外基质颗粒本身是疏松多孔的结构，加入到水凝胶溶液后，部分水凝胶向细胞外基质颗粒内部多孔结构迁移，导致游离的水凝胶含量减少，即可形成水凝胶支架孔壁的含量减少，因而，水凝胶的凝胶孔径显著增大。孔壁变粗糙可能是较多的细胞外基质颗粒黏附在变薄的孔壁上造成的。以上结果说明细胞外基质颗粒的添加，会改变琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的孔径大小和孔隙粗糙程度，改变其三维网络结构，故为确保水凝胶结构的稳定性，加入细胞外基质颗粒的量不能太高。

射电镜观察结果显示：琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶均匀致密，结构良好，其中细胞外基质颗粒在水凝胶中分布均匀，粒径主要集中在50-200 nm，从不同放大倍数透射电镜图片来看，细胞外基质颗粒的添加对水凝胶形态结构不会产生凹陷、坍塌或者其他不良影响，见图3。

2.3 水凝胶的平衡溶胀率 4组水凝胶在溶胀至平衡后的平衡溶胀率范围为623%-957%，见图4。与S1组相比，S2、S3、S4组水凝胶的平衡溶胀率有所下降，且S2、S3组与S1组平衡溶胀率比较差异有显著性意义(P < 0.01)，S4组与S1组平衡溶胀率比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)。这可能是由于细胞外基质颗粒的添加，造成琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的孔壁结构更加致密，降低了可用于保水的空间。

2.4 水凝胶的体外降解率体外降解率实验结果显示，S1-4组水凝胶4周时的平均体外降解率分别为42.32%，67.36%，89.05%和99.47%，在第5周时，S1组平均降解率刚刚达到60%左右，S2组平均降解率为95.38%，其他2组均已100%降解，见图5。可见随着细胞外基质颗粒质量浓度的增加，水凝胶的降解速度显著增快。可能的原因是：细胞外基质颗粒降低了琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的交联度，加速了该水凝胶的体外降解行为；细胞外基质添加量的增加，增大了水凝胶的孔径，更利于酶溶液的进入，能够与水凝胶支架充分接触并加速其降解。

2.5 水凝胶的生物力学强度测试加入适量细胞外基质颗粒，琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的应力-应变行为明显得到了改善。当添加细胞外基质颗粒质量浓度为0-20 g/L时，随着细胞外基质颗粒质量浓度的增加，琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的生物力学强度逐渐增大；当添加的细胞外基质颗粒质量浓度为20 g/L时，琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶拥有较大的耐压力(约为0.06 MPa)和较强的抵制变形能力；当添加细胞外基质颗粒的质量浓度继续增加到30 g/L时，琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的最大耐压力和抵制变形的能力反而表现出减弱趋势，见图6。这可能是由于细胞外基质颗粒的添加，改变了琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的交联度，造成其脆碎度增加，易产生碎裂现象。以上研究表明通过调控细胞外基质颗粒的添加量，可有效改善琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的生物力学性能。

2.6 水凝胶的细胞相容性活/死细胞荧光双染观察发现，软骨细胞-骨髓间充质干细胞共培养系统能够在琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶中均匀地分布和生长，培养1，3，7 d的细胞存活率均在90%以上，且细胞仍在不断地增殖，3个时间点间的细胞增殖情况两两比较差异均有显著性意义(P < 0.01，P < 0.001)，见图7。以上研究结果表明，琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的细胞毒性很低，2种细胞均能够在该水凝胶中正常地黏附与增殖。

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引言

由于无血管结构、无神经组织性质，成熟的软骨组织缺乏自我再生的内在能力^[1]，软骨组织缺损的修复与再生一直是临床上一个难以完全攻克的挑战。传统治疗软骨损伤的方法有很多^[2]，如微骨折手术及骨软骨移植技术等，这些方法均存在着一些问题，微骨折手术对设备要求高，术后恢复周期长且新生成的多为纤维软骨而非透明质软骨，在生物学和力学性能上远不如正常的透明软骨^[3]；骨软骨移植分为自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植，自体骨软骨移植手术操作简单而且是一期手术，但面临供体资源不足、可引起供区并发症、体外扩增细胞过程难以维持软骨细胞表型，不能用于修复超过2 cm²的骨软骨缺损等问题^[4]，同种异体骨软骨移植可修复较大的软骨缺损，但存在着免疫排斥和疾病传播的风险^[5]。

随着材料学、再生医学及相关生物化学的迅速发展，Langer等^[6]提出了组织工程的概念，组织工程学综合了材料学、再生医学及相关生命科学的基本原理和方法，将分离、提取的细胞体外培养扩增，然后复合于组织相容性良好、可降解吸收的三维支架材料上，形成具有生物活性的复合物，然后植入体内修复病损部位。近年来，软骨组织工程技术越来越受到研究者的青睐，该技术已被广泛应用于生物医药等各个领域，未来有着广阔的发展前景。

种子细胞、支架材料和细胞因子作为软骨组织工程的3大要素，支架材料的选择更是关键部分^[7-8]。组织工程软骨支架作为种子细胞临时生长的微环境，在软骨组织工程中扮演了非常重要的角色。理想的软骨组织工程支架应提供一定的力学支撑，可仿生天然软骨细胞外基质的结构，模拟软骨细胞生长的微环境，利于软骨细胞等种子细胞的黏附、生长和增殖，促进软骨缺损的修复^[9]。传统的生物医用支架材料主要有无机金属材料(不锈钢、铝合金等)、无机非金属材料(如生物陶瓷等)及有机高分子材料(如聚乳酸等)，都存在着各种缺点，如生物相容性低、可降解性差等。而水凝胶材料是采用天然或人工合成的高分子物质，通过物理或化学交联形成的一种可在水中溶胀并保持大量水分的聚合物材料^[10]。化学交联是指在光、热、高能辐射、机械力、超声波等媒介和交联剂等作用下，大分子链间通过化学键联结起来，形成网状或体形结构高分子的过程。通过化学交联合成的水凝胶是由化学键交联形成的三维网络聚合物，是永久性的，又称为真凝胶。物理交联是通过物理作用力，如静电作用、离子相互作用、氢键作用、链的缠绕等形成凝胶，这种水凝胶是非永久性的，通过加热可使其转变为溶液，故又称为可逆水凝胶^[11]。

软骨细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白聚糖和水组成。天然材料具有类似于细胞外基质的成分，因而具有良好的细胞相容性和组织相容性，可为软骨细胞提供有利于生存和繁殖的三维微环境^[12]。水凝胶具有独特的内部结构和优异的性能，与生物体内的环境十分相似，因此水凝胶被广泛应用于创伤愈合、药物缓释、骨组织再生与修复等领域^[13-14]。Zheng等^[15]将绵羊软骨细胞体外混合于壳聚糖水凝胶中制备组织工程化软骨，注射到羊体内后发现，软骨细胞可在该支架中存活并保持分泌基质的能力，24周后羊软骨缺损完全修复。Chao等^[16]在软骨修复术中将丝素水凝胶生物材料注入洞型骨缺损内，刺激骨髓产生干细胞长出新生软骨，临床试验结果表明患者术后疼痛明显减轻，新生软骨覆盖率为86%左右。

在众多的水凝胶中，温敏性水凝胶是研究最多的一类水凝胶，可响应温度变化而发生体积相变或溶胶-凝胶转变。近年来，对温敏性水凝胶作为原位形成可注射凝胶体系的研究越来越受到关注^[17]。可注射水凝胶通过注射的方式输入人体内，无需手术，具有微创的特点，将其用于生物医药领域，患者依从性好，可对药物、蛋白质、基因和细胞等进行可控封装和释放，因而受到研究人员的青睐^[18-20]。温敏性水凝胶可在高于人体正常体温(37 ℃)下呈现自由流动的溶胶状态，而在体温下转变为凝胶状态，因此能作为可注射水凝胶得到应用^[21]。由于温敏性可注射水凝胶独特的温敏性溶胶-凝胶转变行为，使其可在注射前实现对药物或细胞的封装，而在注射位点迅速形成凝胶，达到局部给药的效果^[22]，因而在药物缓释载体、组织工程支架和伤口愈合等方面得到广泛应用^[23-24]。

天然高分子(如壳聚糖、琼脂糖、明胶和透明质酸等)和合成高分子(如聚乳酸和聚羟基乙酸等)均可作为温敏性水凝胶的骨架材料，它们均具有良好的生物降解性，可在人体内微生物的作用下降解成小分子物质，被人体吸收和利用，并通过新陈代谢排出体外。相比之下，合成高分子的生物降解性能较差，且可能有未反应完全的小分子残留，对人体有一定的毒性，因此，天然高分子在生物医用领域(如药物缓释载体及组织工程支架等)应用更广泛^[25]。天然来源可注射的温度敏感型水凝胶材料，具有与天然软骨细胞外基质相似的三维空间结构，能够传递各种力学和生物信号，具有良好的生物相容性^[26]。该类型的水凝胶材料操作简便创伤小，可在体外以流动性很好的液态形式复合药物、生长因子及细胞等，通过注射器或内窥镜等微创方式植入体内的器官或者缺损部位，因温度改变可快速在原位形成凝胶，对形状和深度不规则的缺损部位进行原位修复，因此在软骨组织工程领域越来越受到关注^[27]。

软骨细胞外基质是由软骨中驻留细胞分泌物质的特定混合物，已成为软骨再生的有吸引力的生物材料。细胞外基质含有相关的生物活性因子并有助于细胞的黏附、增殖和分化^[28-29]。有研究表明，软骨细胞外基质可增强干细胞的成软骨分化。Yin等^[30]通过一系列涉及粉碎、筛分和去细胞化过程，将新鲜软骨制成细胞外基质源性微粒，在旋转细胞培养系统中的微重力培养条件下，骨髓基质细胞可在细胞外基质源性微粒表面快速增殖；组织学评价和基因表达分析表明，不使用外源性生长因子情况下，培养21 d后骨髓基质细胞分化为成熟软骨细胞。Buckley等^[31]和Pia等^[32]的研究表明，由重建天然软骨衍生基质组成的支架，可能通过建立细胞表面受体和天然组织蛋白上存在的细胞外基质配体之间的相互作用，来诱导软骨细胞或间充质干细胞的软骨形成。Diekman等^[33]进一步证实，天然软骨衍生基质可单独或与外源性生长因子结合，为干细胞软骨形成的研究提供新的培养系统。软骨细胞外基质也被用于其他生物材料(如纤维蛋白水凝胶)的功能化，以促进软骨形成。Almeida等^[34]通过低温研磨和冷冻干燥猪关节软骨产生细胞外基质微粒，用软骨细胞外基质微粒功能化的可注射纤维蛋白水凝胶和转化生长因子β3作为关节软骨再生的推定治疗剂，发现这些纤维蛋白内髌下脂肪垫衍生的干细胞软骨形成得到明显改善。软骨细胞外基质颗粒可用于控制体外纤维蛋白水凝胶中，转化生长因子β3向髌下脂肪垫衍生干细胞的递送，与装载有明胶微球的对照构建体相比，会导致更高水平的硫酸化糖胺聚糖和胶原蛋白积累。在体内，与对照明胶负载的构建体相比，新鲜分离的基质细胞在用软骨细胞外基质颗粒功能化的纤维蛋白水凝胶内可产生更成熟的软骨样组织、Ⅱ型胶原强烈染色并含有更高水平的硫酸化糖胺聚糖。

此次研究采用物理交联的方式，利用琼脂糖、明胶和透明质酸3种高分子之间的静电相互作用及氢键作用，通过温度控制方法制备了一种安全有效的可注射温敏性水凝胶。残余的交联剂会在缺损处产生较严重的细胞毒性，严重影响伤口愈合，由于研究未添加化学交联剂，不会对包封的细胞产生附加毒性作用，而且物理交联方式产生的水凝胶是可逆的，可通过温度控制改变水凝胶的溶胶-凝胶状态，这在软骨组织工程临床应用上是十分有利的。同时在该水凝胶中引入细胞外基质颗粒进行修饰，以解决现今软骨修复中细胞存活率低、软骨分化速率慢等问题，并对其进行结构与性能表征，旨在为临床上软骨的修复与再生提供一种有希望的生物医用材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年8月至2019年1月在山西医科大学基础医学院电镜楼A215实验室完成。

1.3 材料猪松质骨碎片(太原田和肉联厂)；明胶(北京索莱宝生物科技有限公司)；琼脂糖(美国SIGMA-ALODICH公司)；透明质酸钠(华熙福瑞达生物医药有限公司)；软骨细胞、骨髓间充质干细胞(宾大干细胞生物科技有限公司)。

实验用试剂与仪器：AE31 motic倒置显微镜(北京瑞科中仪科技有限公司)；HH-2恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂)；P70D20TL_D4 Galanz微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)；Hirayama HVA-85高压蒸汽灭菌锅(舜友(上海)生物技术有限公司)；Bioaer超净工作台(安徽航天生物科技股份有限公司)；OHAUS奥豪斯CP153电子天平(上海向帆仪器有限公司)；Alalis pH400酸度计(广州爱测智能科技有限公司)；Q800DMA动态粘弹谱仪(美国TA公司)；Tri-Gas INCUBATOR/CO₂培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；SC-3610低速离心机(安徽中佳科学仪器有限公司)；胰酶、EDTA(北京索莱宝生物科技有限公司)；Calcein-AM/PI活/死细胞荧光双染试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司，美国)；JSM-6701F扫描电镜(山西大学提供)；JEM-1011透射电镜(山西医科大学转化医学中心提供)。

1.4 实验方法

1.4.1 水凝胶的制备

琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的制备：称取0.04 g的琼脂糖粉末，置于盛有10 mL蒸馏水的无菌烧杯中，搅拌均匀后放入微波炉中，约1 min看到有泡沫冒出停止加热，制备成0.4%琼脂糖溶液；另称取0.1 g明胶颗粒和0.04 g透明质酸钠粉末，置于盛有约14 mL蒸馏水的无菌烧杯中，将烧杯放入60 ℃恒温水浴锅中，并用洁净的玻璃棒迅速搅拌至固体完全溶解，呈淡黄色澄清状；将上述制备的2种溶液混合均匀，至澄清透亮后备用。

细胞外基质颗粒的制备：按照Masaeli等^[35]报道的方法，将猪松质骨碎片转移到离心管中，用生理盐水洗涤3-5次，用无水乙醇脱脂后，将其暴露于-20 ℃进行冷冻/解冻2个循环，再在液氮中进行冷冻/融溶5个循环，之后用研钵研磨均匀后过80目钢筛，筛粒经紫外灭菌即得细胞外基质颗粒，4 ℃保存，以供进一步使用。

将0，0.24，0.48，0.72 g的细胞外基质颗粒分别加入到刚刚制备的24 mL琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶溶液中，搅拌均匀后降温至37 ℃，即制得4种含不同质量浓度(0，10，20，30 g/L)细胞外基质的琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶，分别记为S1、S2、S3、S4。

1.4.2 水凝胶的表征

扫描电镜观察：取4组水凝胶样本(n=3)，经冷冻干燥机干燥，将样品用导电胶粘到样品台上，离子溅射仪中喷金，扫描电镜下观察水凝胶的内部三维网络结构。

透射电镜观察：将4组水凝胶经磷钼酸等一系列处理后，透射电镜下观察水凝胶中细胞外基质颗粒的形态结构。

平衡溶胀率检测：切取各组冷冻干燥后的水凝胶样本，大小相同，浸于盛有PBS的离心管中，置于37 ℃恒温水浴锅中，24 h后取出，用滤纸吸干表面的水分，称质量，记为m₂₄；然后将样本在冷冻干燥箱内干燥12 h，取出后称质量，记为m₀，每个样本测3次，取平均数，平衡溶胀率(%)=(m₂₄-m₀)/m₀×100%。

体外降解率测试：切取各组冷冻干燥后的水凝胶样本，大小相同，放入离心管中，分别加入含1 g/L溶菌的PBS溶液10 mL，置于37 ℃恒温水浴锅中。2，4，6，8周从各组分别取出3个样本，蒸馏水洗后冷冻干燥，称质量m_t，体外生物降解率(%)=(m₀-m_t)/m₀×100%，m₀为水凝胶初始质量。

力学强度测试：将水凝胶切割成直径5 cm、高度5 cm的圆柱形状，利用动态黏弹谱仪进行应力-应变测试，在0.030 MPa压下保持压缩3 min后，瞬间移去压力，测试水凝胶的形变恢复能力。

1.4.3 水凝胶的体外细胞毒性检测将复苏的P3代软骨细胞与P3代骨髓间充质干细胞按2∶1的细胞密度混合，共培养1周，然后将软骨细胞-骨髓间充质干细胞共培养系统(含体积分数1%转化生长因子β3)按1×10¹⁰ L^-1与新制备的38-39 ℃琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶溶液(细胞外基质质量浓度为20 g/L)混合均匀，按每孔100 μL接种到24孔板中，待其凝胶后每孔再补加0.5 mL DMEM/ F12培养基，每3 d换一次液。

培养第1，3，7天各取3孔，加入Calcein-AM/PI溶液，每孔1 mL，置于37 ℃培养箱中温育20-30 min，弃去Calcein-AM/PI荧光孵育溶液，PBS洗涤后在荧光倒置显微镜下观察，通过IPP6.O图像分析软件进行荧光图像的最终分析和处理。蓝光激发活细胞的绿色荧光，绿光激发死细胞的红色荧光。

1.5 主要观察指标 4组水凝胶的微观结构、平衡溶胀率、生物力学强度和体外降解率，以及琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的细胞相容性。

1.6 统计学分析所有实验数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 20.0统计软件进行组间单因素方差分析，组内两两样本的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

组织工程支架为细胞提供黏附生长的载体，其材料组成及微结构特征均会对细胞生长产生影响，因此良好的组织工程支架需兼备生物相容性和微结构成形性^[36]。天然来源可注射温敏性水凝胶，可同时包裹和缓释生长因子，并具备募集周围组织间充质干细胞向材料迁移的能力^[37]。

琼脂糖作为一种天然植物多糖材料，呈线性多聚物，其溶液具有良好的温度敏感性，一般在90 ℃时溶于水，温度下降到40 ℃时即可形成稳定的水凝胶结构^[38]。琼脂糖水凝胶作为天然水凝胶，具有细胞无毒性、材料成本低、成胶方法简便等优点^[39-40]。随着琼脂糖浓度的增加，所制备的水凝胶的弹性会相应增大几个数量级^[41]。琼脂糖在水中的溶解性和温度有关，适于包囊细胞，被广泛应用于生物医药和化妆品等领域，如细胞治疗、药物缓释和组织工程等^[42-43]。Ulrich等^[44]将0-0.01 g/mL的琼脂糖与0.000 5 g/mL胶原复合制备复合水凝胶，结果表明，随着琼脂糖的质量浓度从0 g/mL增加到0.010 g/mL，水凝胶的储能模量增大了2个数量级，揭示复合琼脂糖可大幅度提高胶原水凝胶力学性能的可能性。研究选用琼脂糖制备水凝胶不仅使整个水凝胶具有温敏特性，而且在一定程度上增强了整个体系的生物力学强度。

明胶是胶原蛋白碱性水解或酸性水解的产物，无毒、免疫原性低，具备良好的细胞黏附能力、生物降解性和生物相容性。采用明胶制备的水凝胶支架，具有许多优良的特性，不仅提高了整个体系的抗压强度和细胞黏附能力，还可促进细胞的增殖、分化等行为。赵守军等^[28]以明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠作为细胞外支架材料，与细胞因子基因转染的骨骺干细胞复合，进行骨骺生长板缺损修复，术后4，8周时，组织工程组大鼠双侧胫骨长度差值、双侧胫骨角差值均小于自体移植组；Western Blot检测结果表明，组织工程组Ⅱ型胶原蛋白和Ⅹ型胶原蛋白蛋白水平更高；组织学观察结果显示，组织工程组大鼠软骨形成速度更快。此次研究中，明胶是水凝胶体系中用于软骨组织修复的主要成分，会直接影响细胞的黏附及新生软骨组织的形成。

透明质酸是一种阴离子线型高分子量多糖，是软骨基质中糖胺聚糖的重要成分，可用于制作可注射水凝胶^[45]。由于可支持细胞增殖和维持软骨表型形成，透明质酸已引起了研究者广泛的关注^[46]，在组织工程领域中已被广泛应用在人工皮肤、伤口愈合及软骨细胞培养等方面^[47]。以往研究发现，透明质酸可与细胞表面受体CD44结合并促进细胞表达更多的软骨细胞标志物，如SOX-9、聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原^[48]。Liu等^[49]通过光诱导亚胺交联反应将邻硝基苯甲醇接枝到透明质酸，然后与富血小板血浆复合，制备原位光交联富血小板血浆水凝胶，研究表明，原位光交联富血小板血浆水凝胶可使细胞相容且可原位成胶，形成坚固的水凝胶支架，不仅能控制生长因子释放，还显示出较强的组织黏附能力；进一步体外实验显示，原位光交联富血小板血浆水凝胶可促进软骨细胞和骨髓间充质干细胞的增殖和迁移；兔全层软骨缺损模型体内实验表明，原位光交联富血小板血浆水凝胶可实现一体化透明软骨再生，非常适用于软骨缺损再生。显然，透明质酸在软骨基质的形成方面起着非常关键的作用，因此，它是整个水凝胶体系的重要成分。

软骨细胞外基质是软骨细胞间的填充，更是软骨组织的支架。细胞外基质颗粒保留了天然软骨组织的基本骨架，是由丰富蛋白多糖及胶原纤维组成的一种疏松多孔微粒结构，在软骨细胞的增殖、迁移、细胞间信号的传递及组织工程软骨的力学响应方面都起着重要作用。具体来说，细胞外基质对组织工程软骨的作用主要体现在3个方面：第一，细胞外基质本身是一种类似天然软骨组织的疏松多孔结构，可提供一种适合正常干细胞生存的微环境，同时能够促进细胞的黏附、增殖并诱导其向软骨方向分化；第二，细胞外基质颗粒的加入，能够明显改善水凝胶-细胞复合支架的生物力学强度，此次研究结果刚好可证实这一点；第三，细胞外基质颗粒的加入，使水凝胶-细胞复合支架更加符合天然软骨组织的3D结构，这一点主要体现在除组织液以外，软骨基质中还存在一些细胞生长因子如转化生子因子β和胰岛素样生长因子1等。转化生长因子β在关节软骨中含量丰富，是已知的在软骨形成初级阶段起重要作用的生长因子, 它不但可促进包括Ⅱ型胶原在内的软骨基质的分泌^[50]，还可诱导间充质干细胞向软骨细胞分化^[51]，并对生长于无血清培养基中的细胞存活起到非常重要的作用^[52]。有研究表明，培养于海藻酸盐中的牛关节软骨细胞，在添加了转化生长因子β后，细胞的增殖及蛋白多糖合成都明显增加^[53]。胰岛素样生长因子1被认为是正常软骨合成代谢的主要生长因子^[54]，通过与其黏附蛋白相互作用来调整其生物学功能。胰岛素样生长因子1在软骨合成代谢方面具有特殊的作用，能促进蛋白合成、刺激细胞生长，可缩短软骨细胞培养周期，还可在有效浓度下促进软骨细胞表型的表达，使软骨细胞分泌正常的蛋白多糖及Ⅱ型胶原。在纤维蛋白中加入胰岛素样生长因子1，可促进马软骨细胞外基质中蛋白多糖的合成^[55]。细胞外基质颗粒中还存在一些非胶原成分，如软骨寡聚基质蛋白和纤连蛋白等。有证据表明，软骨寡聚基质蛋白在细胞外基质装配过程中起着非常重要的作用^[56]，被认为具有关节软骨细胞相对特异性。纤连蛋白沉积于一系列的细胞外基质，是最早发现的具有促进细胞黏附作用的物质，其通过整合素家族与细胞外基质的结合而附着，并可通过其亚单位上的结合域结合于细胞外基质其他成分。在软骨组织工程中，纤连蛋白可引起细胞骨架组成及排列发生改变，显著促进细胞的黏附及铺展，加快细胞生长速度^[57]。Liu等^[58]使用20 g/L的细胞外基质颗粒功能化G-CS/OHA水凝胶，表现出最佳的压缩强度，为骨髓间充质干细胞增殖提供了最佳环境；体外实验证实，与G-CS/OHA水凝胶相比，G-CS/OHA/细胞外基质(20 g/L)水凝胶中积累了更高水平的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原；体内实验显示，含有骨髓间充质干细胞的G-CS/OHA/细胞外基质(20 g/L)水凝胶组大鼠软骨缺陷部位生成更成熟的软骨样组织，与其他组相比，组织更加整合并含有更高水平的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原。Almeida等^[34]研究也证实，将高达 20 g/L的细胞外基质掺入纤维蛋白中，不会影响其形成稳定水凝胶的能力。因而，实验将细胞外基质颗粒加入到琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶中，进一步增强其生物力学强度，同时促进细胞在水凝胶支架中的黏附、增殖和成软骨分化。研究结果显示，细胞外基质颗粒的添加量，会对整个水凝胶体系的结构、吸水膨胀率、生物力学强度及体外降解率等产生不同程度的影响，随着细胞外基质颗粒添加量的增加，琼脂糖/明胶/透明质酸水凝胶的孔径显著增大，并且孔隙越来越粗糙，这将不利于整个体系的稳定；吸水膨胀率也逐渐下降，推测可能是由于添加了细胞外基质颗粒，使得水凝胶的微观结构更加致密，降低了可用于保水的空间；体外降解速率逐渐增大，可能是细胞外基质颗粒降低了水凝胶的交联度，加速了水凝胶的体外降解行为。经以上实验结果对比，作者最终选用20 g/L细胞外基质作为最佳添加量。

骨髓来源间充质干细胞是最具前景的干细胞来源之一，在骨、软骨修复中起着至关重要的作用，其在表型、功能及治疗潜能方面具有更为宽广的应用，可从软骨下骨迁移到受损部位，并分化为软骨细胞和成骨细胞，整合新生及周围组织，可同时修复软骨及软骨下骨组织^[59]。现已知骨髓间充质干细胞在损伤部位具有归巢特性并且分化为特定的细胞或者是分泌一系列具有促进再生功能的活性因子^[60-61]。诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，能够构建较高质量的组织工程软骨^[62-64]。Chen等^[65]将人软骨细胞与骨髓间充质干细胞以半透膜间隔，进行非接触共培养，发现共培养组骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原表达增加，故他们认为在共培养体系中软骨细胞能诱骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。有研究等发现，将兔软骨细胞和骨髓间充质干细胞按2∶1比例共培养时效果最佳。软骨细胞和间充质干细胞的共同培养，能够增强其表型和对转化生长因子β3的敏感性^[66]。故实验选用软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养系统与琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质(20 g/L)水凝胶复合培养，以检测其细胞相容性，并为后续成软骨分化实验打下基础。从研究结果来看，该水凝胶的确适合用于软骨组织工程研究。

实验采用温度控制的方法，利用天然高分子材料琼脂糖、明胶和透明质酸制备了一种温敏性可注射的生物活性水凝胶，其中20 g/L细胞外基质颗粒的添加，明显改善了水凝胶的吸水膨胀能力、力学强度和体外降解能力，同时还能够促进所复合的干细胞的黏附与增殖。简言之，琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质(20 g/L)水凝胶拥有较大的耐压力(约为0.06 MPa) 和较强的抵制变形能力、适宜的吸水膨胀率(约为800%)和合适的体外降解能力，能够与软骨细胞-骨髓间充质干细胞共培养系统生物相容，并促进细胞的黏附与增殖，因而该水凝胶是一种有希望的生物医用高分子材料，为临床上软骨组织损伤修复与再生提供了一条新的途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

琼脂糖/明胶/透明质酸/细胞外基质水凝胶的制备与性能表征

Preparation of agarose/gelatin/hyaluronic acid/extracellular matrix hydrogel and its property characterization

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