低强度脉冲超声促进骨与软骨再生的研究与临床应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0805

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
低强度脉冲超声：是一种频率超过人耳听阈(20 kHz)以上，强度为1-100 mW/cm2的声波。由于其对骨及软骨修复有显著促进作用，并且具有安全、廉价及便捷的特点，美国食品药品监督总局于1994年批准其作为加速骨折愈合的治疗手段。经过数十年的努力，目前临床上已逐渐探索出一条简单、合理、有效利用低强度脉冲超声的治疗方法，在促进患者机体功能康复的同时，最大程度上节约医疗资源，提高社会生产力。
细胞力学：是生物力学的前沿领域，也是组织工程学的一个重要分支。它涉及细胞在力学载荷作用下细胞膜、细胞骨架的变形，弹性常数、黏弹性、黏附力等力学性能的研究，以及力学因素对细胞生长、发育、成熟、增殖、衰老和死亡等的影响及其机制研究。细胞力学关注人体各类细胞，尤其是与骨骼运动系统、血液循环系统、消化系统等有关的细胞。

摘要
背景：低强度脉冲超声是一种无热力无创伤的力学刺激，临床利用低强度脉冲超声治疗骨与软骨缺损已经取得了一定的疗效。
目的：回顾分析低强度脉冲超声在骨与软骨再生过程中的作用及机制，并对低强度脉冲超声参与调节的分子信号、组织再生机制以及临床应用的现状进行综述，为临床提供科学理论依据。
方法：由第一作者运用计算机检索计算机检索Cochrane Library、PubMed、中国生物医学文献服务系统(CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)，以及万方数据资源系统中1990年1月至2017年2月发表的低强度脉冲超声治疗促进骨与软骨再生的相关研究，以“低强度脉冲超声，钙离子，整合素，一氧化氮，前列腺素，骨形成蛋白”为中文检索词，以“LIPUS，calcium，integrin，nitric oxide，prostaglandin，BMP”为英文检索词。同一领域相关研究则选择权威杂志或近期发表的文献，从检索结果中共选择了80篇文章进行进一步分析。
结果与结论：①低强度脉冲超声的基础研究涉及细胞力学以及组织再生等多个领域，尤其在分子生物学技术的支持下，促进骨与软骨再生的研究取得了突破性的进展；②研究发现，低强度脉冲超声通过机械波能引起细胞或组织内产生相应的力学信号，使信号通路中相关分子变化，进而加速受作用区域的血供和新陈代谢，促进骨与软骨组织的再生，并取得了一定的临床疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4328-9898(祖海越)

关键词: 低强度脉冲超声, 组织工程, 细胞力学, 骨疾病, 软骨疾病

Abstract:

BACKGROUND: Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) is a non-thermal and non-invasive mechanical stimulation, which has achieved certain curative efficacy on bone and cartilage defects.
OBJECTIVE: To retrospectively analyze the effects and mechanisms of LIPUS in bone and cartilage regeneration process, and to review the related cellular signals and tissue regeneration mechanism involved in the current achievement of basic research and clinical application, thus providing theoretical basis for clinics.
METHODS: The first author retrieved Cochrane Library, PubMed, CBM, CNKI and WanFang databases using compute for the articles addressing LIPUS promoting bone and cartilage regeneration published from January 1990 to February 2017. The keywords were “LIPUS, calcium, integrin, nitric, oxide, prostaglandin, BMP” in English and Chinese, respectively. The articles published in authoritative magazines or recently published were preferred, and finally 80 articles were selected for result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The basic research concerning LIPUS involves cellular mechanics and tissue engineering. Especially with the support of molecular biology, there has been a major breakthrough in promoting bone and cartilage regeneration. LIPUS can stimulate cells and tissues to produce mechanical signals by mechanical wave, lead to changes in cytokines in the signaling pathways, further accelerate blood supply and metabolism, and finally promote the regeneration of bone and cartilage. Therefore, LIPUS is an effective treatment method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Ultrasonography, Bone Diseases, Cartilage Diseases, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

祖海越，易雪婷，赵德伟. 低强度脉冲超声促进骨与软骨再生的研究与临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2593-2600.

Zu Hai-yue1, Yi Xue-ting2, Zhao De-wei1. Low-intensity pulsed ultrasound promotes bone and cartilage regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2593-2600.

图/表（结果） 1

2.1 LIPUS调控细胞的分子机制

2.1.1 钙离子钙离子是细胞力学信号通路中一种重要的生物学信号，其浓度变化是细胞对外界环境压力的反应之一。当钙离子通道被激活时，钙离子从细胞膜外或从细胞内存储的细胞器中(如内质网，肌质网和线粒体)转运入胞浆，引起了下游生物学变化。Parvizi等^[6]研究发现，LIPUS可以增加软骨细胞内钙离子的浓度，使细胞内蛋白多糖含量上升。当利用钙离子螯合剂或Ca²⁺/ATP酶抑制剂后，发现LIPUS对细胞内钙离子影响显著减低，则证实LIPUS可以激活细胞内钙离子通道，或者也可以通过Ca²⁺和P2Y受体来调控ATP/嘌呤的释放，从而影响成骨细胞的增殖^[7](图1)。钙离子在酶活动中起间接作用，其通过结合不同蛋白，包括钙调蛋白，肌钙蛋白和膜联蛋白完成变构，形成复合物来充当第二信使，并触发下游分子的调节^[8]。最近的研究表明，LIPUS刺激人类骨髓间充质干细胞，可以调节其细胞内钙离子的摆动性^[9]。钙离子的摆动性对于骨髓间充质干细胞分化等多种细胞功能至关重要。Kim等^[10]研究发现，钙离子的摆动性通过影响RhoA的GTP酶通路来起作用，这些因子可作为细胞骨架调节的主要因素。然而，现阶段作者仍不能阐述LIPUS调节钙离子摆动性及促进钙离子内流的具体机制，在接下来的研究中需要进一步探讨。

2.1.2 整合素整合素是一种介导细胞骨架和细胞外基质之间连接的跨膜受体，它能将细胞外的化学成分与力学状态等有关信息传入细胞，因而是胞内信号和胞外信号整合的关键。目前已证实LIPUS的刺激可以引起细胞表面整合素的改变。利用LIPUS每日照射鼠初级成骨细胞20 min后，发现其表面整合素α2、α5、β1、β3表达量增加，整合素β1和β3聚集成簇^[11]。同样，Watabe^[12]利用LIPUS照射鼠成骨细胞也发现整合素α2、α5、β1明显上调。另外，也有研究发现，LIPUS照射初级成纤维细胞后，其DNA合成水平上调，但当使用阻断抗体或

整合素β1抑制剂后，DNA合成能力回落^[13]。目前研究认为，整合素介导的细胞黏附因子是多蛋白、大分子的复合物，这些大分子复合物通过连接细胞肌动蛋白骨架和细胞外基质，参与黏附相关的信号通路。它们在成熟过程中通过改变自身组成来提供牵引力，同时转换为传导信号来促进细胞迁移。整合素的上调触发了黏附相关信号分子的磷酸化，如局部黏附激酶(FAK)、Src和p130Cas，进一步激活ERK和MAP激酶，将信号分子传入细胞核，从而影响细胞的迁移和基因调控^[14-16]。Whitney等^[17]发现LIPUS持续刺激人初级软骨细胞可以促进FAK、Src、CrkII和Erk1/2的磷酸化，证实了LIPUS是经该通路进行信号传导的。另外，在LIPUS治疗兔早期关节炎的软骨细胞中，发现整合素参与了FAK、MAPK、Erk1/2和c-Jun氨基末端激酶的调控，表明整合素是LIPUS引起的机械信号传导与细胞内信号之间的重要连接分子^[18]。

2.1.3 一氧化氮一氧化氮是一种自由基气体，是骨生成过程中参与调控的重要因素^[19]。当细胞受到外界机械力刺激时，细胞内一氧化氮会产生相应的改变。研究表明，LIPUS可以引起人类成骨细胞内一氧化氮含量上调，同时该过程促进了细胞内血管内皮生长因子的表达^[20^]。Tang等^[21]研究发现，小鼠前驱成骨细胞在受到LIPUS刺激后一氧化氮浓度上升，他们认为这种增长受到诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的调节。诱导型一氧化氮合酶是骨代谢过程中一种十分重要的激酶，一氧化氮的生成必须需要诱导型一氧化氮合酶进行催化。因而参与调解诱导型一氧化氮合酶表达的信号通路倍受学者关注。Hou等^[22]发现LIPUS刺激可直接通过经典的NF-κB通路来诱导诱导型一氧化氮合酶的表达，也可通过激活Ras、Raf-1、MEK、Erk和IKKα/β等激酶来上调诱导型一氧化氮合酶的表达。已有的实验表明，在大鼠炎症模型中，骨髓内诱导型一氧化氮合酶的表达明显活跃，产生的一氧化氮刺激破骨细胞骨吸收以达到骨重建的目的^[23]，另一方面，iNOS-NO通路也可以通过下调细胞周期蛋白D1抑制剂ATF3表达，从而促进细胞的有丝分裂^[24-25]。

2.1.4 前列腺素前列腺素是一组复杂的、多功能的骨代谢调节因子，其中前列腺素E2在骨组织中表达量最为丰富，参与骨形成和骨吸收的过程^[26]。实验证明，经LIPUS照射后，在不同种群成骨细胞系中前列腺素E2的分泌量均有所增加^[27-28]。研究发现，LIPUS刺激可以促进小鼠成牙骨质细胞环氧合酶2基因表达，环氧合酶2是前列腺素E2生成过程中的一种限速酶，LIPUS通过影响EP2/EP4受体信号通路，来上调环氧合酶的表达，增加前列腺素合成，从而提高了成牙骨质细胞的分化能力^[29]。Naruse等^[30]也证实了在环氧合酶2基因敲除小鼠中，前列腺素E2表达明显下降，导致小鼠对LIPUS的刺激不敏感。但当小鼠经过前列腺素E2受体激动剂预处理后，LIPUS可显著提高其软骨内成骨的能力。另外，研究发现LIPUS照射还可以通过提高血液中前列腺素来募集骨髓间充质干细胞至需要修复的组织，同时产生的前列腺素还可诱导血管内皮生长因子来促进血管生成^[31]。最近，Sani等^[32]研究MLO-Y4型骨细胞时发现，将LIPUS和流体剪力二者联用，PGHS-2和前列腺素E2的合成量大大提高，显著优于单独使用流体剪力的作用。以上实验证明了LIPUS可通过上调前列腺素的含量，进而促进骨组织与周围血管生成。

2.1.5 骨形成蛋白骨形态发生蛋白是转化生长因子β家族中的一员，在不同组织中具有不同的功能，根据具体情况调节细胞活动^[33]。骨形态发生蛋白信号通过转录因子Smad家族来激活其他下游通路，其中包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，如p38和ERK1/2来调控参与骨形成^[34]。Suzuki等^[35]发现经LIPUS照射鼠类成骨细胞7天后，其细胞内骨形态发生蛋白2因子、骨形态发生蛋白7因子和骨形态发生蛋白受体(BMPR-I，II)表达显著升高。

骨形态发生蛋白2因子和骨形态发生蛋白7因子是骨愈合中重要因素，参与了间充质干细胞向成骨和软骨细胞系分化的过程^[36-37]，目前已经成为美国食品药监局(FDA)批准的骨折愈合治疗的药物。但是由于骨形成蛋白在体内多种组织中发挥着多功能因子的作用，因此骨形成蛋白在治疗骨折时的剂量需要得到严格的管理和控制，进而来降低其对人体其他系统产生的不良反应。与此同时，LIPUS和成骨相关生长因子的协同治疗骨折越来越被人认知，因而LIPUS和骨形成蛋白联合应用可作为骨折愈合的有效治疗手段。有研究者利用含有骨形态发生蛋白2因子的脂质体注射入小鼠骨缺损区域，经LIPUS照射后缓慢释放，可以提高骨重建过程中骨形成蛋白应用的安全性和有效性^[38]。

然而，在体外实验中LIPUS和骨形态发生蛋白因子的协同作用却仍然存在争议。Lai等^[39]利用LIPUS和骨形态发生蛋白2因子联合刺激人类间充质干细胞3 d后，Runx2、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、碱性磷酸酶等相关基因的表达量无显著性差异。与上述体外实验结果不同的是Lee等^[40]利用LIPUS联合骨形态发生蛋白7因子促进了人血肿前驱细胞成骨分化。与单独使用骨形态发生蛋白7因子相比，LIPUS联合骨形态发生蛋白7因子治疗21 d后，细胞内碱性磷酸酶，骨钙素，Runx2和骨桥蛋白OPN含量上升。就目前的研究而言，骨形态发生蛋白因子和LIPUS的联合治疗，在动物实验中已经观察到良好的疗效，但仍需要更深入的体外实验来解释二者协同作用的机制。

2.2 LIPUS对组织再生的影响

2.2.1 骨生成骨的生成是一个非常复杂的过程，主要牵涉到成骨细胞骨形成以及破骨细胞骨重塑。有实验证明，经LIPUS照射1 d后，鼠骨髓源细胞系ST2和鼠成骨细胞中的胰岛素样生长因子立即高表达^[41]。胰岛素样生长因子用于调控Osterix(Osx)的表达，Osx是一种促进前驱成骨细胞向成熟成骨细胞分化的转录因子。经过LIPUS照射7 d后，鼠前驱成骨细胞系表现出成骨细胞的特性，并且Osx在2周内持续性高表达^[42]。经LIPUS照射后，鼠骨髓间充质干细胞中早期反应基因c-jun、c-myc、Egr-1显示表达增强^[43]。C-myc和Egr-1基因编码转录因子可以提高成骨细胞的增殖和分化。c-jun和c-fos蛋白相结合形成催化蛋白AP-1转录因子复合体。AP-1在绑定区与数个启动子相遇，这对于成骨标志因子I型胶原蛋白(Col-1)和骨钙蛋白(OC)的表达尤为重要^[44]。在LIPUS照射1 d之内这些蛋白就开始上调，随后其他重要的成骨标志因子开始上调，例如，骨结合素(ON)、骨唾液酸糖蛋白(BSP)、碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白2，在细胞层面上共同证明了LIPUS照射可促进成骨基因的显著表达^[45-46]。

2.2.2 软骨形成软骨是一种对力学刺激高度敏感的组织。在骨愈合的第3阶段，增殖的间充质干细胞开始分化成软骨细胞，同时软骨内成骨开始发生。作为外界生物力学刺激的靶向目标，软骨通常需经历一系列复杂的增殖和代谢改变。Ting等^[47]报道LIPUS能传递一种持续的波能，调控转化生长因子β3的表达，从而激活去分化的牛关节软骨组织向软骨特性组织分化，软骨相关标志物Col1、基质金属蛋白酶1上调，基质金属蛋白酶13，基质金属蛋白酶2表达量明显上升，并且P38的磷酸化水平增加。Guha等^[48]研究显示在多孔3D支架上培养人类间充质干细胞，LIPUS照射持续14 d后，实验组软骨形状细胞增多，COL2A1、SOX-9、ACAN蛋白表达量增加。另有研究显示，脂肪干细胞在LIPUS刺激后2周开始向软骨分化，并且Col2A、Col2B及Col10的表达量显著上调^[49]。除了分化状态，软骨细胞的活力也受LIPUS的影响。数项研究表明兔源、牛源软骨细胞以及人类髓核细胞系HNPSV-1的增殖均在LIPUS照射2周后显著增加^[50-52]。

此外，在骨关节炎的发生机制中，基质金属蛋白酶家族基质金属蛋白酶的异常活跃以及Ⅱ型胶原蛋白的动态平衡失调，逐渐成为骨关节炎发病机理的研究热点。国内学者对LIPUS在该领域的作用进行了一定的探讨。杜登悝等^[53]利用不同强度LIPUS辐照人骨关节炎细胞，显示细胞凋亡率减少，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖高于对照，而基质金属蛋白酶13在mRNA水平上表达有所下降。同样的，在兔膝关节软骨细胞外基质中，徐守宇等^[54]发现LIPUS也可降低基质金属蛋白酶3，7，13的表达，加速Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的合成，从而促进损伤软骨的修复。刘洋等^[55]经甲苯胺蓝染色后发现，LIPUS可诱导人关节炎软骨的细胞形态及胞内高尔基体恢复正常，胞内与胞膜上可观察到多糖颗粒，证实LIPUS延缓了Ⅱ性胶原降解，抑制基质金属蛋白酶的表达，对关节软骨取得较理想的修复效果。

2.2.3 血管生成实验证明，LIPUS可以上调人下颌成骨细胞和鼠源前驱成骨细胞内白细胞介素8的分泌。白介素8是血管内皮细胞增殖和分化的诱导剂，因而对骨折愈合中的血管生成尤为重要。LIPUS可以促进人成骨细胞、外周血单核细胞和成骨细胞产生更多的血管内皮生长因子。血管内皮生长因子是成血管过程中非常重要的因子，它调控了内皮细胞的有丝分裂和募集，同时，也参与了成骨细胞的分化和破骨细胞的激活^[31]。另一个调控骨折愈合过程中成血管的重要生长因子是成纤维细胞生长因子，据报道其可以通过LIPUS刺激后在人成骨细胞中表达升高。成纤维细胞生长因子通过某种未知的机制来提高干细胞和成骨细胞的迁移和有丝分裂来促进骨折的愈合^[56]。此外，研究表明在LIPUS照射细胞外基质可上升血小板衍生生长因子浓度，从而提高间充质干细胞的增殖能力^[57]。

2.3 LIPUS的临床研究

2.3.1 骨折治疗 LIPUS可以对骨折患者保守治疗起到积极作用。Nolte等^[58]针对美国药品监督局注册的5年内跖骨骨折患者数据进行分析，他们将患者基于人群的年龄、性别、体质量、骨折的严重程度和吸烟状况因素进行倾向性匹配，结果得出LIPUS提高了非手术患者跖骨骨折的治愈率，统计学上 LIPUS可显著提高1年内非手术患者跖骨骨折的治愈率，单独使用LIPUS保守治疗跖骨骨折即可得到与手术干预相当的治愈率，说明LIPUS可在相对无创的条件下促进骨折愈合，Nolte推荐其作为跖骨骨折患者的首选保守治疗手段。

LIPUS还可有助于复杂骨折患者的术后康复。Kinami等^[59]进行了一项多中心回顾性队列研究探讨LIPUS对新鲜骨折手术患者的影响。纳入2009年8月和2010年7月之间14家医学机构中股骨或胫骨骨干骨折手术治疗的患者，对超声治疗组与阴性对照组进行了全面比较，结果显示在骨折部位、骨折类型、软组织条件以及固定方法的组间差异无统计学意义，而治疗组与对照组之间存在的差异存在显著性，特别是涉及C型骨折或闭合性骨折病例中，应用LIPUS治疗的骨折术后患者愈合时间缩短约30%。同时，LIPUS治疗还可使患者更早的进行负重行走，更早的解除外固定支架，获得更高骨矿物质含量，减少了术后并发症。因而，当骨折部位力学环境相对稳定时，LIPUS对于C型粉碎性下肢骨干骨折患者术后的康复治疗非常重要。

然而，也有报道称低强度脉冲超声无法促进骨愈合，Hannemann 等^[60]对1980年至2013年关于LIPUS治疗骨折的随机临床试验进行了系统性回顾，结果显示LIPUS可以降低急性骨折后骨不连发生的结论并不充分，但是Meta分析从影像学上证明了LIPUS可以缩短非手术治疗急性骨折的愈合时间。就此，Watanabe等^[61]针对LIPUS治疗长骨骨折延迟愈合患者和骨不连患者的疗效因素进行了回顾性队列研究分析，结合影像学和统计学分析得出影响LIPUS治疗延迟骨愈合和骨不连效果的3个关键因素：骨折的稳定度、骨折间隙宽度和萎缩性骨不连。因而，在临床应用LIPUS过程中，如何有效控制相关影响因素可能是未来LIPUS治疗骨科疾病的发展方向。

2.3.2 骨缺损治疗 LIPUS可缩短骨缺损的愈合时间。Salem等^[62]对22例胫骨缺损牵张成骨术后患者进行LIPUS辅助治疗后发现，经LIPUS辅助治疗后患者新骨生成速度，骨痂成熟速度以及每日骨痂密度均显著优于对照组，同时使用LIPUS组可以明显缩短外固定时间。在LIPUS治疗组中患者需要外固定平均时间33 d，而对照组需要45 d。经计算，LIPUS组的愈合指数为12 d/cm，其骨痂成熟速度相比对照组加快27%，因而LIPUS是在牵张成骨中高效、无创促进骨痂成熟的辅助方法。LIPUS治疗作用下，愈合时间和外固定的时间缩短，预防了骨延迟愈合或者假性关节的形成，以及其他固定支架相关的并发症，如钉道感染、关节挛缩等。Dudda等^[63]应用LIPUS作为胫骨缺损牵张成骨的辅助治疗，也获得了胫骨延长的良好效果。在LIPUS的辅助治疗下，愈合时间和外固定支架使用时间均可大大缩短，再次证明LIPUS在牵张成骨中的应用对于骨延长是一种很好的辅助治疗方法，对愈合时间具有积极意义，同时不产生任何后遗症或者副作用。

同样的，Tsumaki等^[64]将21例处于同一分级并且在双膝内翻畸形程度相似的骨关节炎患者进行双侧一期开放楔形胫骨高位截骨术。牵引治疗完成后，测量牵引区域骨痂内部骨密度。然后，随机选择一侧肢体进行LIPUS每天20 min的超声处理直到取出外固定支架。对侧肢体作为阴性对照不进行LIPUS治疗。治疗4周后，治疗组骨痂骨密度平均增加(0.20±0.12) g/cm²，与对照组(0.13±0.10) g/cm²相比差异具有统计学意义。同时骨愈合时间以及外固定架拆除时间较对照组明显缩短，LIPUS在牵引成骨整合阶段可加速骨痂成熟，因而Tsumaki主张老年患者开放楔形胫骨高位截骨术后应加用LIPUS作为辅助治疗。

此外，在治疗上肢骨缺损包括尺骨截骨治疗、尺骨撞击综合征和桡骨截骨治疗Kienbock病时，Urita等^[65]发现利用LIPUS可以缩短皮质骨愈合和膜内成骨两种骨愈合的时间。并且在此项研究中，所有截骨术均达到了完全愈合。对于皮质骨形成，治疗组平均愈合时间为57 d，对照组为76 d。对于膜内成骨，治疗组为121 d而对照组为148 d。LIPUS缩短皮质骨愈合时间达27%，同时膜内成骨愈合时间缩短18%，说明LIPUS可以加速前臂截骨术后骨折愈合，使患者尽早行功能锻炼并缩短恢复劳动的时间，在未来的工作中，需要建立一套系统有效的LIPUS辅助骨缺损修复的临床治疗体系。

2.3.3 关节炎治疗 LIPUS还是关节炎和软骨修复患者的潜在治疗手段。Jia等^[66]研究发现，聚焦式LIPUS治疗膝关节骨性关节炎具有显著疗效，探讨了LIPUS治疗膝关节骨性关节炎患者的功能恢复和健康情况。他们选取106例双侧膝关节骨性关节炎患者随机分为两组，Ⅰ组LIPUS 联合双氯芬酸钠治疗，Ⅱ组假照射联合双氯芬酸钠。经过10 d治疗后，Ⅰ组干预治疗的疗效通过测量目测类比(VAS)疼痛变化评估，WOMAC评分以及LI评分显著改善，此外运动范围、移动速度以及SF-36量表中多项指标显著升高。并且，在LIPUS干预前以及干预治疗后4周和12周的随访过程中，没有任何相关不良副作用的报道。总之，目前的研究表明，聚焦式LIPUS是治疗膝关节骨性关节炎的一种有效安全的治疗方式，可以减少疼痛，改善患肢功能，提高生活质量。该研究为未来LIPUS应用研究做出了重要贡献，特别是在LIPUS处理膝关节骨关节炎患者膝关节疼痛、僵硬以及生活质量等方面提高了重要参考依据。

相似报道，Lovola-Sanchez等^[67]证实，患有膝关节炎并且膝关节内侧间隙1级或2级的患者，进行LIPUS照射20个疗程后，患者胫骨内侧软骨体积、厚度明显增加。因此，LIPUS对轻度至中度膝关节骨性关节炎患者的软骨修复过程有积极的影响作用。然而，由于样本量的限制，未来仍需要进行更大样本量的随机对照试验，来更充分说明LIPUS对轻中度膝关节骨性关节炎患者的治疗作用。同时需要更深入探讨最佳的超声剂量参数及应用，才能更准确评估LIPUS对轻度至中度膝关节骨性关节炎患者的软骨修复的影响。

2.3.4 与骨、软骨再生材料的联合应用目前，LIPUS与再生材料的联合应用已经取得了理想的生物相容性。Zhou等^[68]观察到在含RGDS肽和纳米羟基磷灰石的改良3D生物打印支架上联合LIPUS刺激，骨髓间充质干细胞的增殖，碱性磷酸酶活性，钙沉积和总蛋白含量较对照组显著提高，证实了LIPUS联合3D打印技术可协同刺激干细胞的成骨分化。同时，Nagasaki等^[69]提出，LIPUS可协调纳米羟基磷灰石生物材料支架上脂肪干细胞的分化成骨。国内学者郭杨等^[70]研究发现，LIPUS联合同种异体软骨细胞-藻酸钙复合物修复膝关节缺损，胶原染色显示阳性表达面积、吸光度均有上升，并且治疗效果随疗程增加而更为显著。刘青等^[71]利用LIPUS刺激可使钛种植体周围骨小梁更致密，生物力学效果更坚韧，提升了材料与骨的结合紧密性和组织相容性。此外，秦丽梅等^[72]在羟基磷灰石/磷酸钙三维支架上观察成骨细胞，在受LIPUS作用后细胞密度以及细胞长入支架深度均明显提高，并且DNA含量随治疗时间而增加，说明了LIPUS可促进成骨细胞在羟基磷灰石/磷酸钙三维支架上的增殖与活力。因此，作者认为LIPUS与再生材料的联合应用是非常有价值的，且高效无创，为再生材料在骨与软骨修复领域的应用提供了良好的辅助手段。

参考文献

[1] Rubin C, Bolander M, Ryaby JP, et al. The use of low-intensity ultrasound to accelerate the healing of fractures. J Bone Joint Surg Am.2001;83-A(2): 259-270.

[2] Moed BR, Kim EC,van Holsbeeck M,et al.Ultrasound for the early diagnosis of tibial fracture healing after static interlocked nailing without reaming: histologic correlation using a canine model. J Orthop Trauma.1998;12(3): 200-205.

[3] Moed BR, Subramanian S,van Holsbeeck M, et al. Ultrasound for the early diagnosis of tibial fracture healing after static interlocked nailing without reaming: clinical results. J Orthop Trauma.1998;12(3): 206-213.

[4] Buchtala V. Present state of ultrasound therapy. Dia Med. 1950;22(70): 2944-2950.

[5] Maintz G.Animal experiments in the study of the effect of

ultrasonic waves on bone regeneration. Strahlentherapie.

1950; 82(4): 631-638.

[6] Parvizi J, Parpura V, Greenleaf JF, et al. Calcium signaling is

required for ultrasound-stimulated aggrecan synthesis by rat chondrocytes. J Orthop Res.2002; 20(1): 51-57.

[7] Alvarenga EC,Rodrigues R,Caricati-Neto A,et al.Low-intensity pulsed ultrasound-dependent osteoblast proliferation occurs

by via activation of the P2Y receptor: role of the P2Y1 receptor. Bone.2010;46(2): 355-362.

[8] Doroudi M,Plaisance MC,Boyan BD,et al.Membrane actions of 1alpha,25(OH)2D3 are mediated by Ca(2+)/calmodulin- dependent protein kinase II in bone and cartilage cells. J Steroid Biochem Mol Biol.2015;145: 65-74.

[9] Sun S,Liu Y,Lipsky S,et al.Physical manipulation of calcium oscillations facilitates osteodifferentiation of human mesenchymal stem cells. FASEB J.2007;21(7):1472-1480.

[10] Kim TJ, Seong J, Ouyang M, et al. Substrate rigidity regulates Ca2+ oscillation via RhoA pathway in stem cells. J Cell Physiol. 2009;218(2): 285-293.

[11] Tang CH, Yang RS, Huang TH, et al. Ultrasound stimulates cyclooxygenase-2 expression and increases bone formation through integrin, focal adhesion kinase, phosphatidylinositol 3-kinase, and Akt pathway in osteoblasts. Mol Pharmacol. 2006; 69(6): 2047-2057.

[12] Watabe H,Furuhama T,Tani-Ishii N,et al.Mechanotransduction activates alpha(5)beta(1) integrin and PI3K/Akt signaling pathways in mandibular osteoblasts. Exp Cell Res.2011; 317(18): 2642-2649.

[13] Zhou S, Schmelz A, Seufferlein T, et al. Molecular mechanisms of low intensity pulsed ultrasound in human skin fibroblasts.J Biol Chem.2004;279(52): 54463-54469.

[14] Sato M, Nagata K, Kuroda S, et al. Low-intensity pulsed ultrasound activates integrin-mediated mechanotransduction pathway in synovial cells. Ann Biomed Eng.2014;42(10): 2156-2163.

[15] Angle SR,Sena K,Sumner DR, et al. Osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells by various intensities of low-intensity pulsed ultrasound. Ultrasonics. 2011; 51(3): 281-288.

[16] Cheng K, Xia P, Lin Q, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on integrin-FAK-PI3K/Akt mechanochemical transduction in rabbit osteoarthritis chondrocytes. Ultrasound Med Biol.2014;40(7): 1609-1618.

[17] Whitney NP,Lamb AC,Louw TM,et al.Integrin-mediated mechanotransduction pathway of low-intensity continuous ultrasound in human chondrocytes. Ultrasound Med Biol. 2012;38(10): 1734-1743.

[18] Xia P, Shen S, Lin Q, et al. Low-Intensity Pulsed Ultrasound Treatment at an Early Osteoarthritis Stage Protects Rabbit Cartilage From Damage via the Integrin/Focal Adhesion Kinase/Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling Pathway. J Ultrasound Med.2015; 34(11):1991-1999.

[19] Saura M, Tarin C, Zaragoza C. Recent insights into the implication of nitric oxide in osteoblast differentiation and proliferation during bone development. Scientific World J. 2010;10: 624-632.

[20] Wang FS,Kuo YR,Wang CJ,et al.Nitric oxide mediates ultrasound-induced hypoxia-inducible factor-1alpha activation and vascular endothelial growth factor-A expression in human osteoblasts. Bone.2004;35(1):114-123.

[21] Tang CH, Lu DY, Tan TW, et al. Ultrasound induces hypoxia-inducible factor-1 activation and inducible nitric-oxide synthase expression through the integrin/integrin-linked kinase/Akt/mammalian target of rapamycin pathway in osteoblasts. J Biol Chem.2007;282(35): 25406-25415.

[22] Hou CH, Lin J, Huang SC, et al. Ultrasound stimulates NF-kappaB activation and iNOS expression via the Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway in cultured preosteoblasts. J Cell Physiol. 2009;220(1): 196-203.

[23] Herrera BS, Martins-Porto R, Maia-Dantas A, et al. iNOS-derived nitric oxide stimulates osteoclast activity and alveolar bone loss in ligature-induced periodontitis in rats. J Periodontol.2011;82(11): 1608-1615.

[24] Jung DH, Kim KH, Byeon HE, et al. Involvement of ATF3 in the negative regulation of iNOS expression and NO production in activated macrophages. Immunol Res.2015; 62(1): 35-45.

[25] Wang G, Yan Q, Woods A, et al. Inducible nitric oxide synthase-nitric oxide signaling mediates the mitogenic activity of Rac1 during endochondral bone growth. J Cell Sci.2011; 124(Pt 20): 3405-3413.

[26] Kawaguchi H,Pilbeam CC,Harrison JR,et al.The role of prostaglandins in the regulation of bone metabolism. Clin Orthop Relat Res.1995;(313): 36-46.

[27] Kokubu T, Matsui N, Fujioka H, et al. Low intensity pulsed ultrasound exposure increases prostaglandin E2 production via the induction of cyclooxygenase-2 mRNA in mouse osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun.1999;256(2): 284-287.

[28] Reher P, Harris M, Whiteman M, et al. Ultrasound stimulates nitric oxide and prostaglandin E2 production by human osteoblasts. Bone.2002;31(1): 236-241.

[29] Rego EB, Inubushi T, Kawazoe A, et al. Ultrasound stimulation induces PGE(2) synthesis promoting cementoblastic differentiation through EP2/EP4 receptor pathway. Ultrasound Med Biol.2010;36(6): 907-915.

[30] Naruse K, Sekiya H, Harada Y, et al. Prolonged endochondral bone healing in senescence is shortened by low-intensity pulsed ultrasound in a manner dependent on COX-2. Ultrasound Med Biol.2010;36(7):1098-1108.

[31] Hidaka K, Miyamoto C, Kawata A, et al.13. Effect of Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS) on Remote Bone Marrow in Rats With Healing Socket. J Orthop Trauma, 2016; 30(8): S5-6.

[32] Saini V, Yadav S, McCormick S. Low-intensity pulsed ultrasound modulates shear stress induced PGHS-2 expression and PGE2 synthesis in MLO-Y4 osteocyte-like cells. Ann Biomed Eng.2011;39(1): 378-393.

[33] Murray SS, Brochmann Murray EJ, Wang JC, et al. The history and histology of bone morphogenetic protein. Histol Histopathol.2016;31(7): 721-732.

[34] Ruschke K, Hiepen C, Becker J, et al. BMPs are mediators in tissue crosstalk of the regenerating musculoskeletal system. Cell Tissue Res.2012;347(3):521-544.

[35] Suzuki A, Takayama T, Suzuki N, et al. Daily low-intensity pulsed ultrasound stimulates production of bone morphogenetic protein in ROS 17/2.8 cells. J Oral Sci.2009; 51(1): 29-36.

[36] Shen B, Wei A, Whittaker S, et al. The role of BMP-7 in chondrogenic and osteogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in vitro. J Cell Biochem.2010;109(2): 406-416.

[37] Hernandez-Hurtado AA, Borrego-Soto G, Marino-Martinez IA, et al. Implant Composed of Demineralized Bone and Mesenchymal Stem Cells Genetically Modified with AdBMP2/AdBMP7 for the Regeneration of Bone Fractures in Ovis aries. Stem Cells Int. 2016;2016: 7403890.

[38] Huang W, Hasegawa T, Imai Y, et al. Low-intensity pulsed ultrasound enhances bone morphogenetic protein expression of human mandibular fracture haematoma-derived cells. Int J Oral Maxillofac Surg.2015;44(7): 929-935.

[39] Lai CH, Chen SC, Chiu LH, et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound, dexamethasone/TGF-beta1 and/or BMP-2 on the transcriptional expression of genes in human mesenchymal stem cells: chondrogenic vs. osteogenic differentiation. Ultrasound Med Biol.2010;36(6): 1022-1033.

[40] Lee SY,Koh A,Niikura T,et al.Low-intensity pulsed ultrasound enhances BMP-7-induced osteogenic differentiation of human fracture hematoma-derived progenitor cells in vitro. J Orthop Trauma.2013;27(1): 29-33.

[41] Naruse K, Miyauchi A, Itoman M, et al. Distinct anabolic response of osteoblast to low-intensity pulsed ultrasound. J Bone Miner Res.2003;18(2): 360-369.

[42] Celil AB, Campbell PG. BMP-2 and insulin-like growth factor-I mediate Osterix (Osx) expression in human mesenchymal stem cells via the MAPK and protein kinase D signaling pathways. J Biol Chem.2005; 280(36): 31353-31359.

[43] Sena K, Leven RM, Mazhar K, et al. Early gene response to low-intensity pulsed ultrasound in rat osteoblastic cells. Ultrasound Med Biol.2005;31(5):703-708.

[44] Bozec A, Bakiri L, Jimenez M, et al. Fra-2/AP-1 controls bone formation by regulating osteoblast differentiation and collagen production. J Cell Biol.2010;190(6):1093-1106.

[45] Gleizal A, Li S, Pialat JB, et al. Transcriptional expression of calvarial bone after treatment with low-intensity ultrasound: an in vitro study. Ultrasound Med Biol.2006;32(10): 1569-1574.

[46] Yang RS, Lin WL, Chen YZ, et al. Regulation by ultrasound treatment on the integrin expression and differentiation of osteoblasts. Bone.2005;36(2):276-283.

[47] Ting SY, Montagne K, Nishimura Y,et al. Modulation of the Effect of Transforming Growth Factor-beta3 by Low-Intensity Pulsed Ultrasound on Scaffold-Free Dedifferentiated Articular Bovine Chondrocyte Tissues. Tissue Eng Part C Methods. 2015; 21(10):1005-1014.

[48] Guha Thakurta S,Budhiraja G,Subramanian A.Growth factor and ultrasound-assisted bioreactor synergism for human mesenchymal stem cell chondrogenesis. J Tissue Eng.2015;6: 2041731414566529.

[49] Shafaei H, Esfandiari E, Esmaeili A, et al. Optimizing a novel method for low intensity ultrasound in chondrogenesis induction. Adv Biomed Res.2013;2:79.

[50] Kobayashi Y,Sakai D,Iwashina T,et al.Low-intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation, proteoglycan synthesis and expression of growth factor-related genes in human nucleus pulposus cell line. Eur Cell Mater.2009;17: 15-22.

[51] Subramanian A, Turner JA, Budhiraja G, et al. Ultrasonic bioreactor as a platform for studying cellular response. Tissue Eng Part C Methods.2013;19(3): 244-255.

[52] Jia L, Chen J, Wang Y, et al. Focused Low-intensity Pulsed Ultrasound Affects Extracellular Matrix Degradation via Decreasing Chondrocyte Apoptosis and Inflammatory Mediators in a Surgically Induced Osteoarthritic Rabbit Model. Ultrasound Med Biol.2016;42(1): 208-219.

[53] 杜登悝,易刚,唐赢. 低强度脉冲超声对人骨性关节炎软骨细胞的影响[J]. 第三军医大学学报, 2016,38(21): 2320-2325.

[54] 徐守宇,张丽梅,姚新苗. 低强度脉冲超声对兔膝骨关节炎软骨细胞外基质的影响及机制[J]. 中国骨伤, 2014,27(9): 766-771.

[55] 刘洋,刘宁,刘昭铭. 低强度脉冲式超声对关节软骨的修复[J].中国组织工程研究, 2016,20(29): 4284-4289.

[56] Uchida K, Urabe K, Naruse K, et al. 5. Accelerated Fracture Healing Targeting Periosteal Cells: Possibility of Combined Therapy of Low-Intensity Pulsed Ultrasound (LIPUS), Bone Graft, and Growth Factor (bFGF). J Orthop Trauma.2016; 30(8): S3.

[57] Bernardi M, Albiero E, Alghisi A, et al. Production of human platelet lysate by use of ultrasound for ex vivo expansion of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Cytotherapy.2013;15(8): 920-929.

[58] Nolte P, Anderson R, Strauss E, et al. Heal rate of metatarsal fractures: A propensity-matching study of patients treated with low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) vs. surgical and other treatments. Injury.2016;47(11): 2584-2590.

[59] Kinami Y, Noda T, Ozaki T. Efficacy of low-intensity pulsed ultrasound treatment for surgically managed fresh diaphyseal fractures of the lower extremity: multi-center retrospective cohort study. J Orthop Sci.2013;18(3): 410-418.

[60] Hannemann PF, Mommers EH, Schots JP, et al. The effects of low-intensity pulsed ultrasound and pulsed electromagnetic fields bone growth stimulation in acute fractures: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Arch Orthop Trauma Surg.2014;134(8): 1093-1106.

[61] Watanabe Y, Arai Y, Takenaka N, et al.Three key factors affecting treatment results of low-intensity pulsed ultrasound for delayed unions and nonunions: instability, gap size, and atrophic nonunion. J Orthop Sci.2013;18(5): 803-810.

[62] Salem KH, Schmelz A. Low-intensity pulsed ultrasound shortens the treatment time in tibial distraction osteogenesis. Int Orthop.2014;38(7):1477-1482.

[63] Dudda M, Hauser J, Muhr G, et al. Low-intensity pulsed ultrasound as a useful adjuvant during distraction osteogenesis: a prospective, randomized controlled trial. J Trauma.2011;71(5):1376-1380.

[64] Tsumaki N,Kakiuchi M,Sasaki J,et al.Low-intensity pulsed ultrasound accelerates maturation of callus in patients treated with opening-wedge high tibial osteotomy by hemicallotasis. J Bone Joint Surg Am.2004; 86-A(11): 2399-2405.

[65] Urita A, Iwasaki N, Kondo M, et al. Effect of low-intensity pulsed ultrasound on bone healing at osteotomy sites after forearm bone shortening. J Hand Surg Am. 2013;38(3): 498-503.

[66] Jia L,Wang Y, Chen J, et al. Efficacy of focused low-intensity pulsed ultrasound therapy for the management of knee osteoarthritis: a randomized, double blind, placebo-controlled trial. Sci Rep.2016;6: 35453.

[67] Loyola-Sanchez A, Richardson J, Beattie KA, et al. Effect of low-intensity pulsed ultrasound on the cartilage repair in people with mild to moderate knee osteoarthritis: a double-blinded, randomized, placebo-controlled pilot study. Arch Phys Med Rehabil.2012;93(1): 35-42.

[68] Zhou X, Castro NJ, Zhu W, et al. Improved Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis in 3D Bioprinted Tissue Scaffolds with Low Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation. Sci Rep.2016; 6: 32876.

[69] Nagasaki R, Mukudai Y, Yoshizawa Y, et al. A Combination of Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Nanohydroxyapatite Concordantly Enhances Osteogenesis of Adipose-Derived Stem Cells From Buccal Fat Pad. Cell Med.2015;7(3): 123-131.

[70] 郭杨,马勇,董睿.低强度脉冲超声对同种异体软骨细胞-藻酸钙凝胶复合物修复兔膝关节软骨缺损的影响[J].中国修复重建外科杂志, 2013,27(8): 928-934.

[71] 刘青,梁建飞.低强度的脉冲超声对钛种植体骨结合的影响[J].中国超声医学杂志, 2015,31(2):164-166.

[72] 秦丽梅,吴琳. 低强度脉冲超声波作用下羟基磷灰石/磷酸三钙三维支架上成骨细胞的生物学行为的研究[J]. 生物医学工程与临床, 2014,18(6): 517-522.

[73] Poolman RW, Agoritsas T, Siemieniuk RA, et al. Low intensity pulsed ultrasound (LIPUS) for bone healing: a clinical practice guideline. BMJ.2017;356:j576.

引言

低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)是一种频率超过人耳听阈(20 kHz)以上，其强度为1-100 mW/cm²的声波^[1]。目前LIPUS已作为一种安全有效治疗手段广泛用于临床。起初，LIPUS仅仅用于临床诊断，包括重要脏器，胎儿发育以及评估骨折愈合过程中骨痂生长情况^[2-3]。然而近年来深入研究下，发现LIPUS对力学敏感性较高的骨与软骨组织再生有显著的促进作用。早在1950年，Buchtala^[4]和Maintz^[5]就在动物实验中发现，诊断级别的超声扫描仪可以刺激骨的修复。随后，越来越多的学者通过基础研究和临床实验验证了这一观点。LIPUS通过机械波刺激细胞和组织产生相应的力学信号，引起细胞信号通路中相关分子的变化，同时加速受作用区域的血供和新陈代谢，促进骨与软骨组织的修复。文章从细胞分子机制、组织再生、临床应用多角度切入，综述低强度脉冲超声对骨与软骨再生的促进作用，为临床提供科学的理论依据。

1 资料和方法 Data and methods

1.1 资料来源以“低强度脉冲超声，钙离子，整合素，一氧化氮，前列腺素，骨形成蛋白”为中文检索词，以“LIPUS, calcium, integrin, nitric oxide, prostaglandin，BMP”为英文检索词，由第一作者由第一作者运用计算机检索Cochrane Library、Pubmed、中国生物医学文献服务系统(CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)以及万方数据资源系统中1990年1月至2017年2月发表的相关文献。

1.2 入选标准文献所述内容与和低强度脉冲超声促进骨与软骨再生密切相符。选择该领域有代表性或权威性的原创文章。

1.3 排除标准 ①与纳入标准不相关的文章；②重复性研究的文章；③可靠性差的文章。

1.4 数据提取与质量评估符合要求的所有文章，通过文献题目和摘要进行初步筛选，排除重复性研究，同一领域相关研究优先选择权威杂志或近期发表的文献。初筛后的文章进行全文阅读，判断是否与入选标准相符合的文献，最终选择80篇文章做进一步分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程