凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原构建的骨修复材料

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (2): 202-208.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.008

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原构建的骨修复材料

李振珺^1，2，齐社宁¹，赵红斌²，王维^1，2，李根²，张晓敏²，宋学文²

¹兰州大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000；²解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2016-10-27 出版日期:2017-01-18 发布日期:2017-02-27
通讯作者: 齐社宁，博士，硕士生导师，教授，兰州大学基础医学院，甘肃省兰州市 730000
作者简介:李振珺，女，1993年生，甘肃省兰州市人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事组织工程方面的研究。
基金资助:
甘肃省科技重大专项 (1203FKDA036)

Palygorskite/hydroxyapatite/polycaprolactone/collagen composite scaffold for bone repair

Li Zhen-jun^{1, 2}, Qi She-ning¹, Zhao Hong-bin², Wang Wei^{1, 2}, Li Gen², Zhang Xiao-min², Song Xue-wen²

¹School of Basic Medical Sciences of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; ²Institute of Orthopaedics, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2016-10-27 Online:2017-01-18 Published:2017-02-27
Contact: Qi She-ning, M.D., Master’s supervisor, Professor, School of Basic Medical Sciences of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Li Zhen-jun, Studying for master’s degree, School of Basic Medical Sciences of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu Province, China; Institute of Orthopaedics, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
Supported by:
the Major Project of Gansu Provincial Science and Technology, No. 1203FKDA036

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
凹凸棒石：又称坡缕石或坡缕缟石，是一种具链层状结构的含水富镁硅酸盐黏土矿物，在其结构中存在晶格置换，棒晶中含有不定量的Na⁺ 、Ca ²⁺ 、Fe ³⁺ 、Al ³⁺等，凹凸棒石具有独特的分散、耐高温、抗盐碱等良好的胶体性质和较高的吸附脱色能力，并具有一定的可塑性及黏结力，有较好的生物活性和相容性。
羟基磷灰石：理论组成成分为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，钙磷比约为1.67，是一种较好的功能材料，它与人体骨骼的无机质成分和结构基本一致，以无机盐的形式呈现。缺钙羟基磷灰石钙磷比约为1.50，与自然骨成分最为接近，并且具有更好生物相容性和活性，是很好的骨组织替代材料和载体。

背景：骨移植是修复骨缺损的惟一方法，但传统的骨移植方法均存在一定的弊端。骨组织工程可达到修复或重建骨的目的，为骨缺损患者的治疗带来新的选择。
目的：构建一种新型有效提高骨缺损修复的组织工程支架材料。
方法：采用化学沉淀辅以微波辐射法制备出不同Ca/P比(1.50/1.67)的羟基磷灰石，采用溶液灌注-溶剂挥发法、离子滤沥法等制备凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原、凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原、凹凸棒石/聚己内酯/胶原(对照组)复合材料。利用扫描电子显微镜、红外光谱仪、表面接触测定仪、万能力学机等，分别进行材料表征、有效成分、亲水性和力学性能评价，用动物实验评价材料与宿主的组织相容性。
结果与结论：①精确控制pH值范围能合成不同Ca/P比的羟基磷灰石；②与凹凸棒石/聚己内酯/胶原复合材料相比，构建的凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原和凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原复合材料的力学性能、透气性、亲水性明显增强(P < 0.05)，孔隙率、吸水膨胀率明显降低(P < 0.05)；③动物实验结果显示，支架材料与宿主无免疫炎性反应，具有良好的组织相容性；④结果提示，构建的凹凸棒石/羟基磷灰石(1.50，1.67)/聚己内酯/胶原复合支架材料有可能成为较为理想的骨组织修复替代支架材料。

ORCID: 0000-0001-6498-6794(李振珺)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 凹凸棒石, 缺钙羟基磷灰石, 胶原, 聚己内酯, 骨修复支架材料

Abstract:

BACKGROUND: Bone transplantation is the only method for the repair of bone defects. However, traditional bone transplantation has some disadvantages. Bone tissue engineering, as a new treatment strategy, can achieve the desire therapeutic outcomes.
OBJECTIVE: To fabricate a new tissue-engineered scaffold for improving bone repair effectively.
METHODS: Hydroxyapatites (HA) with different Ca/P (1.50/1.67) ratios were synthesized by chemical precipitation method and microwave radiation method. Composite scaffolds of palygorskite (APC)/HA/polycaprolactone (PCL)/ collagen (COL), APC/calcium deficiency HA (CDHA)/PCL/COL, and APC/PCL/COL (control group) were prepared by solution perfusion-solvent evaporation and ion leaching method. The material characterization, active ingredients, hydrophilic property, and mechanical properties were evaluated by scanning electron microscope, infrared spectrometer, surface contact measuring instrument and universal mechanics, respectively. The histocompatibility of the implant with the host was assessed through animal experiments.
RESULTS AND CONCLUSION: By precise control of pH range, HA with different Ca/P ratios could be synthesized. The mechanical properties, air permeability, hydrophilic property of the APC/HA/PCL/COL and APC/CDHA/PCL/COL composite materials were significantly increased compared with the APC/PCL/COL composite material (P < 0.05), while the porosity, water absorption expansion rate were significantly decreased (P < 0.05). Results from our animal experiments showed that no immune inflammatory reaction was observed suggesting that the composite materials hold good histocompatibility. To conclude, the APC/HA (1.50/1.67)/PCL/COL composite materials are promising bone substitutes in bone tissue repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Collagen, Hydroxyapatites, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李振珺，齐社宁，赵红斌，王维，李根，张晓敏，宋学文. 凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原构建的骨修复材料[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(2): 202-208.

Li Zhen-jun, Qi She-ning, Zhao Hong-bin, Wang Wei, Li Gen, Zhang Xiao-min, Song Xue-wen. Palygorskite/hydroxyapatite/polycaprolactone/collagen composite scaffold for bone repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(2): 202-208.

图/表（结果） 9

2.1 羟基磷灰石X射线能量色散谱仪成分分析结果如图1所示，图1A中，Ca元素的原子百分比为21.28，P元素原子百分比为12.06，符合天然羟基磷灰石的钙磷比1.67；图1B中，Ca元素的原子百分比为18.49，P元素的原子百分比为17.33，符合缺钙羟基磷灰石的钙磷比1.50。

2.2 羟基磷灰石红外图谱红外光谱结果如图2所示，样品在3 433.3 cm，637.1 cm^-1处均出现了羟基的强吸收峰，在1 045.1 cm^-1，1 095.3 cm^-1，570.2 cm^-1处均出现了PO₄^3-的吸收峰，证明该产物是羟基磷灰石^[17]；样品在1 410 cm^-1至1 470 cm^-1间出现了碳酸根微弱的吸收峰，这可能是在合成羟基磷灰石陈化过程中，空气中的CO₂进入与羟基磷灰石发生了键合，加入的碳酸根使得羟基磷灰石从仿生结构上接近于天然骨^[18]。

2.3 成型复合材料的大体观察如图3所示，成型复合材料呈浅灰色，无特殊气味。样品a为凹凸棒石/聚己内酯/胶原组，表面较为平滑、均匀且致密；b、c分别为凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原与凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原组，两者表面无差异，均有较粗糙有凸起形成，且有肉眼可见均匀致密的孔隙(见b、c)；复合材料按压均有明显的硬度，具有较高的可塑性。

2.4 复合材料扫描电镜微观结构观察复合材料扫描电镜结果如图4所示。0.00组复合材料疏松且孔隙较多, 且孔隙内部结构也较为疏松，可见复合材料微结构均匀且疏松连接，凹凸棒石颗粒清楚可见(见图4A-C)；1.50组和1.67组复合材料表面可见大小不等的孔隙，其孔隙与0.00组相比明显减小，材料连接致密(见图4D-I)。

2.5 复合材料红外光图谱如图5所示，3 433 cm^-1为羟基磷灰石中羟基伸缩振动引起的特征峰，563 cm^-1为羟基磷灰石PO₄^3-的弯曲特征峰，表明了a、b两组复合材料中有羟基磷灰石的存在^[18]；1 660 cm^-1为酰胺Ⅰ带的C=O伸缩振动特征峰，1 556 cm^-1的特征峰是有N-H弯曲振动引起的，表明复合材料中胶原和聚己内酯的存在^[19]；1 110 cm^-1是Si-O-Si反对称伸缩振动引起的吸收峰，表明复合材料中有凹凸棒石的存在。确认了3组复合支架材料中的各成分。

2.6 复合材料的力学特性图6为复合材料干态和湿态压缩应力应变曲线，结果显示，干态下3组材料均压缩0.5 mm，其最大压缩应力分别为(25.17±0.56) MPa(0.00组)，(34.53±0.29) MPa(1.50组)和(46.66±1.76)MPa(1.67组)，相比差异有显著性意义(P < 0.05)；湿态下3组复合材料均压缩0.7 mm，其最大压缩应力分别为(0.46±0.67) MPa，(0.69±1.28) MPa和(0.82±0.93) MPa，相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 复合材料的接触角测定接触角结果如图7所示，0.00组复合材料的接触角为115°，1.50组复合材料的接触角为95°，1.67组复合材料的接触角为93°，随着羟基磷灰石的增加材料的接触角与无羟基磷灰石材料比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.8 复合材料孔隙率、吸水膨胀率、透气性测定结果结果见表1，复合材料孔隙率0.00组与1.50及1.67组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；不同Ca/P的羟基磷灰石/凹凸棒石复合材料的孔隙率差异无显著性意义(P > 0.05)。透气性0.00组与1.50和1.67组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；不同Ca/P的羟基磷灰石/凹凸棒石复合材料之间，透气性随Ca含量的增加而增大，其差异有显著性意义(P < 0.05)。膨胀率0.00组与1.50及1.67组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；不同Ca/P的羟基磷灰石/凹凸棒石复合材料间，吸水膨胀率随Ca含量的增加而减小，其差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.9 复合材料的生物相容性苏木精-伊红染色结果显示，3组植入材料组中材料与自体骨均紧密结合，材料中可见大量的非炎性细胞浸润(黑色箭头所示)，未见材料与组织发生明显的免疫反应。其中1.50和1.67组与0.00组比较，材料与宿主骨组织连接处有骨样细胞存在，且1.50组有少量新骨生成(绿色箭头所示)且材料部分被降解，结果见图8。

参考文献

[1]Neufurth M, Wang X, Schröder HC, et al. Engineering a morphogenetically active hydrogel for bioprinting of bioartificial tissuederived from humanosteoblast-like SaOS-2 cells. Biomaterials. 2014;35(31): 8810-8819.

[2]Hashemibeni B, Dehghani L, Sadeghi F, et al. Bone Repair with Differentiated Osteoblasts from Adipose-derived Stem Cells in Hydroxyapatite/Tricalcium Phosphate In vivo. Int J Prev Med. 2016;7:62.

[3]徐世希,欧阳丽娜,丁劲松. 凹凸棒石黏土及其应用进展[J].中南药学, 2009,7(6): 441-445.

[4]王浩,张里程,石涛,等. 胶原-羟基磷灰石-硫酸软骨素-骨形态发生蛋白骨修复材料的性质评估[J]. 北京大学学报(医学版), 2011, 43(5):730-734.

[5]Castilho M, Moseke C, Ewald A, et al. Direct 3D powder printing of biphasic calcium phosphate scaffolds for substitution of complex bone defects. Biomaterial. 2014;6(1):015006.

[6]Xue J, He M, Liu H, et al. Drug loaded homogeneous electrospun PCL/gelatin hybrid nanofiber structures for anti-infective tissue regeneration membranes. Biomaterials. 2014;35(34):9395-9405.

[7]艾合麦提,玉素甫,陈统一,等. 可降解聚己内酯修复骨缺损的实验研究[J].中国修复重建外科杂志, 2005, 19(6): 439-442.

[8]张达江,王亮.Ⅰ型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景[J]. 生物技术通讯,2006,17(2):265-269.

[9]何立志,冯祖德. 不同Ca/P纳米缺钙羟基磷灰石的微波合成和表征[J]. 广州化工,2009,37(4):74-76.

[10]王学江,李玉宝. 羟基磷灰石纳米针晶与聚酰胺仿生复合生物材料研究[J]. 高技术通讯，2001,11(5):1-5.

[11]王迎军, 杜昶, 赵娜如, 等. 仿生人工骨修复材料研究[J]. 华南理工大学学报,2012,40(10):51-58.

[12]李强. 可注射骨组织工程材料的制备与性能研究[D]. 华中科技大学,2009.

[13]帅丽. 缺钙纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料的制备[D]. 重庆大学,2010

[14]吴晓东. 生物活性骨组织工程支架的研究及介孔羟基磷灰石的初步探讨[D]. 吉林大学,2012.

[15]朱爱臣. 一种可用于引导组织再生技术的淀粉/PVA膜的制备及性能研究[D].北京化工大学,2010.

[16]Park HJ, Yu SJ, Yang K, et al. Paper-based bioactive scaffolds for stem-mediated bone tissue engineering. Biomaterial. 2014;35(37):9811-9823.

[17]Li H, Xue K, Kong N, et al. Silicate bioceramics enhanced vascularization and osteogensis through stimulating in teractions between endothelia cells and bone marrow stromal cells. Biomaterials. 2014;35(12):3803-3818.

[18]Hettiaratchi MH, Miller T, Temenoff JS, et al. Heparin microparticle effects on presentation and bioactivity of bone morphogenetic protein-2. Biomaterials. 2014;35(25):7228-7238.

[19]Cholas R, Kunjalukkal Padmanabhan S, et al. Scaffolds for bone regeneration made of hydroxyapatite microspheres in a collagen matrix. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016;63: 499-505.

[20]Castilho M, Moseke C, Ewald A, et al. Direct 3D powder printing of biphasic calcium phosphate scaffolds for substitution of complex bone defects. Biofabrication. 2014;6(1):015006.

[21]Xue J, He M, Liu H, et al. Drug loaded homogeneous electrospun PCL/gelatin hybrid nanofiber structures for anti-infective tissue regeneration membranes. Biomaterials. 2014;35(34):9395-9405.

[22]贾帅军. 定向结构软骨支架复合骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的研究[D]. 第四军医大学,2012.

[23]Han B, Perelman N, Tang B, et al. Collagen-targeted BMP3 fusion proteins arrayed on collagen matrices or porous ceramics impregnated with Type I collagen enhance osteogenesis in a rat cranial defect model. Orthop Res.2002;20(4):747-755.

[24]Kume S, Kato S, Yamagishi S, et al. Advanced glycation end-products attenuate human mesenchymal stem cells and prevent cognate differentiation into adipose tissue, cartilage, and bone. Bone Miner Res. 2005;20(9):1647-1658.

引言

骨缺损修复材料是临床需求量最大的生物医用材料之一，近年来研究的热点是模仿天然骨本身的成分、结构特性及矿化过程，对材料的组成、结构进行设计与调控，或者对传统材料进行仿生功能化修饰，获得新型仿生人工骨修复材料。天然骨的有机成分包括胶原蛋白、蛋白质、糖类、脂类等；无机成分主要是以磷酸钙及其磷酸盐类的形式存在，其中，磷酸钙主要以羟基磷灰石的形式存在。近年来，大量的科学家致力于组织工程骨的研究，国内外的许多科学家已经证明了羟基磷灰石和缺钙羟基磷灰石的成骨效果^[1-2]，对于凹凸棒石的成骨性能却鲜有报道。

凹凸棒石又称坡缕石或坡缕缟石，是一种具链层状结构的含水富镁硅酸盐黏土矿物，在其结构中存在晶格置换，棒晶中含有不定量的Na⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺等^[3]，凹凸棒石具有独特的分散、耐高温、抗盐碱等良好的胶体性质和较高的吸附脱色能力，并具有一定的可塑性及黏结力，有较好的生物活性和相容性^[4]。羟基磷灰石的理论组成成分为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，钙磷比约为1.67，是一种较好的功能材料，它与人体骨骼的无机质成分和结构基本一致，以无机盐的形式呈现^[5]。缺钙羟基磷灰石钙磷比约为1.50，与自然骨成分最为接近,并且具有更好生物相容性和活性，是很好的骨组织替代材料和载体^[6]。聚己内酯是一种半晶型的高聚物^[5]，具有很好的柔韧性、生物相容性、生物降解性，以及良好的渗透性^[7]。Ⅰ型胶原为生物体提供了机械支撑作用，在骨骼与结缔组织中形成和保持骨架的完整性，并维护器官与组织的完整性，保障其正常功能的行使^[8]。

实验用凹凸棒石、聚己内酯、胶原混合不同钙磷比的羟基磷灰石，采用化学沉淀法、微波辐射法、溶液灌注-溶剂挥发法、离子滤沥法等构建凹凸棒石/羟基磷灰石(1.50，1.67)/聚己内酯/胶原生物替代材料，以期用于骨组织缺损修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照，多因素单水平实验。

1.2 时间及地点于2014年9月至2016年3月在解放军兰州军区总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级雄性Wistar大鼠9只，体质量(150±10) g，由兰州大学基础医学院动物实验科提供，许可证号：SYXK(甘)2011-0001，符合国家实验动物检疫标准。

1.3.2 主要仪器冷冻干燥机(军事医学科学院)、磁力搅拌器、恒温水浴振荡器、万能力学测试机(日本岛津公司)、扫描电子显微镜(日本电子公司)、接触角测定仪(OCA20 Dataphysics Germany)、低速离心机(LD4-2A，北京医用离心机厂)、高速冷冻离心机(长沙天创仪器表总厂有限公司)、电子分析天平(梅得勒-托利多仪器(上海)有限公司)、一次性塑料注射器、pH仪(杭州陆恒生物科技有限公司)、自动包埋机(TB-718E，湖北泰维医疗科技有限公司)、石蜡切片机(LEICASP1600，德国)、AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪、调速平板振荡器(常州国华电器有限公司)、X射线能量色散普仪、正置相差显微镜(奥林巴斯公司，日本)等。

1.3.3 主要试剂胶原蛋白(自制)、六氟异丙醇(HFIP，Sigma公司，美国)、凹凸棒石(由中科院兰州化学物理研究所提供)、NaCl、不同Ca/P羟基磷灰石(自制)、聚己内酯(Sigma公司，美国)、氨水(分析纯)、四水合硝酸钙(分析纯)、磷酸氢二铵(分析纯)、液体石蜡(天津市百世化工有限公司)、六氟异丙醇、石油醚、甲醇、氯仿、无水乙醇、盐酸、乙酸等。

1.4 实验方法

1.4.1 合成羟基磷灰石根据反应产物的不同，NH₃•H₂O控制其条件，将Ca(NO₃)₂•₄H₂O和(NH₄)₂HPO₄作为反应物发生如下反应：

Ca(NO₃)₂+(NH₄)₂HPO₄+NH₃•H₂O→Ca₁₀-X(PO₄)₆- X(HPO₄)X(OH)₂-X+NH₄NO₃+H₂O

从上述方程可知^[9]，精确调节pH值和不同反应温度来制备不同Ca/P的羟基磷灰石。将Ca(NO₃)₂•4H₂O和(NH₄)₂HPO₄配制成0.2 mol/L的溶液，量取两种溶液各 150 mL。将盛有Ca(NO₃)₂•4H₂O溶液的1 000 mL大烧杯置于40 ℃恒温水浴振荡器中，pH仪实时监测温度和pH值。氨水(1∶2)调节Ca(NO₃)₂•4H₂O溶液pH值至7.3，移液枪将(NH₄)₂HPO₄以3-5 mL/min的速度滴入1 000 mL大烧杯中，滴加过程中始终用氨水(1∶2)将反应体系的pH值维持在7.3-7.9，反应结束后，取出烧杯，加入500 mL蒸馏水，700 W微波炉中微波辐射30 min，室温陈化24 h后，蒸馏水洗涤7次，1 200 r/min离心5 min分离得到白色沉淀^[10]， 70 ℃烘箱中烘干12 h，得到Ca/P比为1.50的缺钙羟基磷灰石。Ca/P=1.67的羟基磷灰石原理同上，反应体系中pH值维持在8.0-8.3^[11]。

1.4.2 复合材料的制备 0.6 gⅠ型胶原，0.4 g凹凸棒石，0.4 g羟基磷灰石(羟基磷灰石/缺钙羟基磷灰石)，0.2 g聚己内酯，1.5 g NaCl溶于10 mL六氟异丙醇中^[12]，得到复合材料原浆，对照组无羟基磷灰石。常温下搅拌过夜。通风橱内将混合物倒入小玻璃皿中，并不停搅拌，待85%的六氟异丙醇挥发后，将原浆置直径10 cm的注射器塑料模具中，不断推动使原浆凝固，将混合物取出，通风橱中除去残余六氟异丙醇。材料制成直径约8 mm，厚约3 mm薄片， 37 ℃烘箱中6-8 h。蒸馏水沥盐，0.1% AgNO₃溶液检测洗脱液，待NaCl完全洗干净后，乙醇梯度脱水，得到复合材料，根据羟基磷灰石含量的不同分别标记对照组0.00组(凹凸棒石/聚己内酯/胶原)、1.50组(凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原)、1.67组(凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原)，37 ℃烘箱中24 h，备用。

1.4.3 羟基磷灰石成分分析将合成的羟基磷灰石样品研磨成粉末，使其质地均匀，取少量样品，采用X射线能量色散谱仪检测羟基磷灰石的成分。测试条件：低真空模式，电压20 kV，工作距离10 mm，放大倍率100-300。

1.4.4 羟基磷灰石的红外光谱表征取粉末状羟基磷灰石样品，利用傅里叶变换红外光谱仪检测材料的红外光谱表征。

1.4.5 复合材料的微观结构上述复合材料在真空冷冻干燥机中干燥12 h后，常规喷金后，扫描电子显微镜下观察材料表面的微观结构。

1.4.6 复合材料的红外光谱表征材料原浆在制备过程中进行了12 h不间断的强力搅拌，得到的复合材料质地与成分均匀，测量时取体积约1 mm³的复合材料利用AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪测定红外吸收光谱。

1.4.7 复合材料结构力学性能的测试上述材料打磨成直径5 mm，厚1 mm大小均匀的圆形薄片，利用万能力学机进行干态复合材料的压缩实验，压缩速度为1 mm/min，每个样品重复2次。材料湿态处理，先将干态材料称质量，然后置于0.01 mol/L PBS中，浸泡1 min，取出，滤纸轻轻吸去多余水分后称质量，得增质量30%的湿态复合材料。利用万能力学机进行复合材料的湿态压缩实验，每个样品重复3次。

1.4.8 复合材料表面接触角的测定蒸馏水滴与材料表面接触1 min后，利用表面接触测定仪(OCA20)室温检测复合支架材料的接触角，每组重复3次。

1.4.9 复合材料孔隙率的测定取5 mL的青霉素瓶，加入4 mL的乙醇后称质量，得到质量m₁，然后放入直径8 mm，厚度3 mm的复合材料，待乙醇将复合材料完全浸没后，记号笔标记液面高度，静置24 h后，取出，称得青霉素瓶的质量为m₂，然后滴加乙醇至青霉素瓶，使液面升至标记处，称得青霉素瓶的质量为m₃，记录数据取平均值。根据公式：孔隙率=(m₁-m₂)/(m₃-m₂)×100%，计算材料的孔隙率，每组3个样品，每个样品重复3次^[13]。

1.4.10 复合材料吸水膨胀率的测定 5 mL青霉素瓶加入蒸馏水，将不同类型的材料(0.00/1.50/1.67)浸泡24 h后取出，滤纸吸干材料表面水分，分析天平称得质量为m₁；复合材料置37 ℃烘箱中24 h，称得质量为m₂，每组材料取3个样品，每个样品重复3次，按照公式：吸水膨胀率= (m₁-m₂)/m₁×100%计算材料的吸水膨胀率^[14]。

1.4.11 复合材料透气性的测定选取表面积均匀直径为8 mm的复合材料进行透气性的测定。5 mL青霉素瓶中加入4 mL蒸馏水，置入直径为8 mm的复合材料后，封口膜密封瓶口，设一个敞口作为对照，敞口对照的面积大小与材料一致；测量透气部位的面积为S，称得质量为m₁后，37 ℃烘箱中放置24 h，取出，称得质量为m₂，根据公式：透气性=(m₁-m₂)×10⁴/S/24，计算复合材料(T_材料)和对照组(T_对照)的透气性；根据公式：透气率=T_材料/T_对照计算材料的透气率。每组测定3个样品，重复3次^[15]。

1.4.12 动物实验选用雄性Wistar大鼠9只，体质量(150±10) g, 分为凹凸棒石/聚己内酯/胶原组、凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原组、凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原组，每组3只。10%水合氯醛按0.004 mL/g的剂量腹腔注射麻醉动物，固定，无菌环境下手术暴露颅骨，0.5 mm电钻钻孔，分别植入不同材料^[9]。术后30 d于大鼠颅骨部缺损区取材，体积分数10%甲醛固定，脱钙，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜观察材料与自体骨组织的相容性及降解情况并拍照^[16]。

1.5 主要观察指标苏木精-伊红染色法观察1个月后大鼠颅骨部缺损区新骨的生成面积、骨细胞的数量及复合支架材料的降解情况。

1.6 统计学分析采用SPSS软件对实验数据进行单因素方差分析，实验数据以x(_)±s形式表示，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在骨组织工程中理想的骨修复支架材料应符合以下要求：①骨诱导性及传导性；②可塑性、易加工性和可消毒性；③生物相容性；④生物降解性；⑤多孔性；⑥合适的强度及力学性能。

凹凸棒石具有很好的柔韧性、可塑性和生物相容性，并含有Si²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等离子。研究表明，凹凸棒石作为一种无毒、化学性能稳定的非金属矿产，由于具有纳米结构、大的比表面积和空间和较好的骨诱导性和生物相容性，对骨修复有积极的促进作用。凹凸棒石还可以提供丰富的硅元素，人体需要有机硅帮助吸收和利用无机钙，有机硅与矿物质的吸收有着直接关系，甚至恢复身体的自我修复功能，同时，凹凸棒石具有较大的膨胀容，太过柔韧等缺陷。羟基磷灰石晶体为六晶方系，属P₆₃/m空间群，其结构为六角主体，分子结构和组成成分与天然骨的无机成分很相似，是人体骨骼的主要无机成分，具有良好的生物活性，能够与骨组织形成骨键合^[20]，天然羟基磷灰石的钙磷比约为1.67，而自然骨的钙磷比约为1.50。许多研究表明，羟基磷灰石植入骨缺损区有较好的修复效果^[21]，这是因为羟基磷灰石以固体或离子状态广泛存在于人体内，并动态参与骨组织吸收与重建及钙离子和磷离子代谢过程。然而两种羟基磷灰石均具有抗弯曲强度低，抗疲劳度不佳，脆性大，柔韧性不足，塑形困难的缺陷，不利于新生骨的改建，不能完全满足骨替代材料的要求。聚己内酯作为一种聚合型聚酯，能够为复合支架材料提供力学强度，能在体内与细胞较好相容，可为复合材料提供力学强度并作细胞与组织的支架^[22]；胶原是构成细胞外基质的骨架，能够给骨细胞提供生物环境，并在骨细胞的生长、迁移、发育中起作用，缺点是缺乏力学强度，降解速度快等^[23]。由于NaCl最终通过沥盐法除去，六氟异丙醇最终全部挥发，故整个材料原浆体系将NaCl和六氟异丙醇的质量忽略。本实验反复调整聚己内酯的加入量，最终以聚己内酯质量占材料原浆体系的12.5%为基准，加入0.2 g聚己内酯，此时材料的力学强度与骨的莫氏硬度最为接近。胶原约占骨组织成分的30%，本实验采用0.6 g胶原，占原浆体系的37.5%，与自然骨接近。有研究表明，NaCl占材料原浆反应体系的50%左右时，材料孔隙率可达80%，本实验考虑到搅拌过程对NaCl的损耗，故选用1.5 g作为致孔剂，通过离子滤沥法形成孔隙，多孔的结构利于细胞的黏附、组织形成以及代谢物交换。对照组各物质的质量与实验相一致。

由于凹凸棒石具有极强的吸附性，对照组复合材料能和细胞黏附且容易形成组织，但是由于较大的膨胀容，加入致孔剂后孔隙率变大，过大的孔隙率不利于复合材料的力学强度。为了提高凹凸棒石的性能，本实验加入了不同钙磷比例的羟基磷灰石，制备出凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原(1.67组)和凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/聚己内酯/胶原(1.50组)复合材料，同时加入了胶原和聚己内酯，并采用易挥发、能够使材料原浆快速成型的六氟异丙醇作为溶剂，NaCl作为制孔剂，并对3组复合材料进行综合评价。

本实验研究结果显示，羟基磷灰石的加入明显改善了凹凸棒石复合材料的性能。极大的优化了复合材料的孔隙率，透气性和吸水膨胀率，显著改善了凹凸棒石的膨胀容，这样的改变有利与细胞进入复合材料生长代谢，以及支架与组织之间的物质交换与营养代谢。羟基磷灰石的加入使得复合材料致密化，吸水膨胀率变小，有利于支架的塑形，在植入动物体内后维持自身形态而不易变形，有较好的支撑作用^[1]。凹凸棒石本身就有较好的亲水性，在加入羟基磷灰石后，亲水性变得更好，这样的改变利于复合材料与组织更好的相容。本实验表明，干态下，凹凸棒石与羟基磷灰石复合后，力学强度明显增大，这是因为羟基磷灰石的硬度明显改善了凹凸棒石的柔韧性，使材料的硬度与自然骨更为接近(人骨的莫氏硬度为4至5)^[24]，且钙磷比越大，复合材料硬度越大，这是因为钙是人骨的主要成分，可以有效增强骨质密度。松质骨的压缩强度在17 MPa左右，而凹凸棒石/羟基磷灰石复合材料的最大压缩强度为(46.66±1.76) MPa(1.67组)，明显可以满足骨替代材料的力学强度；湿态下，复合材料均变得柔软膨胀，较干态下力学强度明显变小，1.67组仍表现出了最高的力学强度。3组材料差异有显著性意义。

动物实验中，将3组复合材料分别植入大鼠颅骨1个月，苏木精-伊红结果显示材料与连接紧密，材料有轻微降解且有骨样细胞形成，有很好的生物相容性，能够明显促进骨生成。结果表明，1.50和1.67组复合材料的成骨效果明显优于对照组，且以1.50组效果最佳，有大量软骨细胞和少量新骨生成，自体骨与复合材料连接较为紧密，这是因为凹凸棒石和缺钙羟基磷灰石均具有很好的组织相容性，且凹凸棒石在动物体内释放多种对动物有利的金属离子，且缺钙羟基磷灰石钙磷比1.50与自体骨最为接近，以离子状态存在于动物体内，动态参与骨组织吸收与重建及钙离子和磷离子代谢过程，因此具有较优异的性能。

结论：①精确调节反应物的pH值可合成不同钙磷比的羟基磷灰石；②羟基磷灰石的加入极大的改善了凹凸棒石的性能，最终得到的复合支架材料的物理特性既具有凹凸棒石的柔性韧性和生物相容性，又有羟基磷灰石力学强度和生物活性，还能发挥聚己内酯和胶原的优越性，既能发挥各自性能的优势，又能弥补一些各自的缺点；③3组复合支架材料均具有良好的生物相容性，无炎症无排异反应；④综合评定凹凸棒石/缺钙羟基磷灰石/胶原/聚己内酯(1.50组)具有较好的力学强度，适宜的孔隙率和吸水膨胀率，且透气性良好；⑤初步断定，1.50组为较好的骨替代支架复合材料；⑥该复合材料为一种新的骨组织工程材料，在后续的研究中将进一步评价材料对骨缺损修复效果的研究，以期获得更好的预期效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

凹凸棒石/羟基磷灰石/聚己内酯/胶原构建的骨修复材料

Palygorskite/hydroxyapatite/polycaprolactone/collagen composite scaffold for bone repair

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[2]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[3]	王坤, 何本祥. 川续断皂苷VI修复兔肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 211-217.
[4]	刘家利, 索海瑞, 杨翰, 王玲, 徐铭恩. 填充结构对3D打印聚己内酯支架力学性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2612-2617.
[5]	文科, 卢彦青, 侯楠, 马瑞娜, 崔鹏程, 吕蝶, 徐小丽. 生物材料与组织工程技术在鼓膜缺损重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1620-1624.
[6]	董志恒, 高艳, 刘贞, 韩晓谦. 构建淫羊藿苷/聚己内酯纳米纤维膜及体外促成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1510-1514.
[7]	李璇, 孙一民, 李龙飙, 王振铭, 杨静, 汪成林, 叶玲. 纳米改性聚己内酯微球的构建及对牙髓细胞的生物学效应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1530-1536.
[8]	赵紫熙, 徐俊, 丁敏, 李喜文, 张靖航, 王鹏华. 医用胶原蛋白海绵外敷糖尿病足溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和基质金属蛋白酶2，9的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1544-1550.
[9]	杨腾云, 李彦林, 刘德健, 王国梁, 郑竹君. 转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 45-51.
[10]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[11]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[12]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[13]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[14]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[15]	房昕, 郭金铭, 刘品端. 不同浓度富血小板血浆修复兔膝骨关节炎软骨缺损的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(35): 5588-5593.