慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.015

中国组织工程研究

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系

熊玮¹，董少红¹，张键²，李江华¹，吴美善¹，廖碧红¹，庞新利¹，罗林杰¹

¹暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院心内科，广东省深圳市 518020；²中国科学院深圳先进技术研究院，广东省深圳市 518055

出版日期:2015-05-14 发布日期:2015-05-14
通讯作者: 董少红，博士，主任医师，暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院心内科，广东省深圳市 518020
作者简介:熊玮，男，1975年生，湖北省当阳市人，汉族，2012年暨南大学毕业，博士，副主任医师，主要从事冠心病方面的研究。
基金资助:
深圳市科技创新重点资助课题(201201022)

Construction of mouse CMKLR1 gene knock-down vascular smooth muscle cell lines mediated by lentivirus vector

Xiong Wei¹, Dong Shao-hong¹, Zhang Jian², Li Jiang-hua¹, Wu Mei-shan¹, Liao Bi-hong¹, Pang Xin-li¹,
Luo Lin-jie¹

¹Department of Cardiology, Second Clinical Medical College of Jinan University/Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China; ²Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, Guangdong Province, China

Online:2015-05-14 Published:2015-05-14
Contact: Dong Shao-hong, M.D., Chief physician, Department of Cardiology, Second Clinical Medical College of Jinan University/Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
About author:Xiong Wei, M.D., Associate chief physician, Department of Cardiology, Second Clinical Medical College of Jinan University/Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific Innovation Plan of Shenzhen, No. 201201022

摘要/Abstract

摘要：

背景：趋化素在动脉粥样硬化时的表达水平上调，趋化素及其受体CMKLR1可能参与了动脉粥样硬化的病理过程。
目的：建立CMKLR1基因缺陷性小鼠血管平滑肌细胞株。
方法：以小鼠CMKLR1基因mRNA序列作为干扰靶点，设计3组靶向CMKLR1基因的shRNA序列，构建慢病毒载体，筛选出干扰最佳的shRNA，在293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养小鼠血管平滑肌细胞，转染慢病毒形成CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞株，用real-time PCR检测感染慢病毒后细胞中CMKLR1 mRNA水平。
结果与结论：基因测序结果表明慢病毒载体构建成功，慢病毒的滴度约为8.7×10⁶TU/mL，pLVX-shRNA3对CMKLR1基因的抑制效果最显著(P < 0.001)。将pLVX-shRNA3转染至血管平滑肌细胞中形成基因缺陷细胞株，用real time PCR血管平滑肌细胞中CMKLR1 mRNA水平，该细胞株中CMKLR1 mRNA水平显著下降(P < 0.001)，表明慢病毒介导的siRNA可有效沉默小鼠血管平滑肌细胞中CMKLR1基因的表达。

关键词: 组织构建, 组织工程, 血管平滑肌细胞, 趋化素, CMKLR1, RNA干扰, 慢病毒

Abstract:

BACKGROUND: Levels of chemerin are elevated in arteriosclerosis, indicating chemerin and its receptor (CMKLR1) may participate in the pathological process of arteriosclerosis.
OBJECTIVE: To establish the stable CMKLR1 gene knock-down mouse vascular smooth muscle cell lines.
METHODS: Three shRNA sequences targeting the coding region of mouse CMKLR1 mRNA were synthesized and employed to construct lentivirus recombinant vectors. The best pLVX-shRNA was picked up to package recombinant lentivirus in 293T cells, which were infected in cultured mouse vascular smooth muscle cells. The CMKLR1 mRNA level of vascular smooth muscle cells was verified by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The lentiviral vectors were successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing. The titer of lentivirus reached 8.7×106 TU/mL in the packaging cells, and pLVX-shRNA3 showed the most significant interfering effects on CMKLR1 gene (P < 0.001). The pLVX-shRNA3 was chosen to establish the stable CMKLR1 gene knock-down vascular smooth muscle cell lines, in which the expression of CMKLR1 mRNA was also significantly inhibited shown on real-time PCR (P < 0.001). We finally confirmed that the expression of CMKLR1 gene can be effectively silenced by lentivirus-mediated siRNA in mouse mouse vascular smooth muscle cells.

Key words: Myocytes, Smooth Muscle, Chemotactic Factors , RNA Interference

中图分类号:

R318

熊玮，董少红，张键，李江华，吴美善，廖碧红，庞新利，罗林杰. 慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.015.

Xiong Wei, Dong Shao-hong, Zhang Jian, Li Jiang-hua, Wu Mei-shan, Liao Bi-hong, Pang Xin-li,Luo Lin-jie. Construction of mouse CMKLR1 gene knock-down vascular smooth muscle cell lines mediated by lentivirus vector [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.20.015.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：重复测量，细胞水平体外实验。
时间及地点：实验于2014年7至12月在深圳市人民医院临床医学研究中心完成。
材料：SPF级NIH小鼠购自广东省实验动物中心。实验过程对动物的处置办法符合科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。
实验方法：
血管平滑肌细胞培养和鉴定：按照作者之前建立的方法培养小鼠血管平滑肌细胞^[18]。培养成功后采用免疫荧光法进行鉴定。

慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系实验试剂：
试剂	来源
DMEM培养基、0.25%胰酶、FBS	Gibco公司
小鼠a-SMA抗体	自博士德公司
Lipofectamine2000	Invitrogen公司
BamHⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶	Thermo公司
T₄DNA ligase	NEB公司
MinElute Reaction Cleanup Kit、Endo-free Plasmid Max Kit	Omega公司
PrimeScript RT reBamHnt Kit、Lenti-X Lentiviral Expression Systems	Takara公司
引物	由生工公司合成

CMKLR1基因shRNA寡核苷酸链的设计与合成：在Genbank上找到小鼠CMKLR1基因的全序列(Accession No：NM1142343)。利用在线计软件设计3条21nt的siRNA序列。然后根据siRNA的序列设计合成2条shRNA寡核苷酸单链，设计如下：BamH Ⅰ酶切位点+19nt靶核苷酸序列+茎环结构(TTC AAG AGA)+靶序列互补序列+ RNA PolyIII聚合酶转录中止位点(TTT TTT)+EcoR Ⅰ酶切位点，针对每个基因分别命名为CMKLR-1、CMKLR-2、CMKLR-3，同时设计对照shRNAc，在上海生工生物有限公司进行合成。

CMKLR1-1 siRNA靶序列(5^’-3^’)：GCA TAG AAG CTT TAC CAA GA

CMKLR1-1 top寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：GAT TCG CAT AGA AGC TTT ACC AAG ATT CAA GAG ATC TTG GTA AAG CTT CTA TGT TTT TT

CMKLR1-1 bottom寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：AAT TAA AAA ACA TAG AAG CTT TAC CAA GAT CTC TTG AAT CTT GGT AAA GCT TCT ATG CG

CMKLR1-2 siRNA靶序列(5^’-3^’)：GCT CTT TAG CAT CCA CCA AT

CMKLR1-2 top寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：GAT CCG CTC TTT AGC ATC CAC CAA TTT CAA GAG AAT TGG TGG ATG CTA AAG AGT TTT TT

CMKLR1-2 bottom寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：AAT TAA AAA ACT CTT TAG CAT CCA CCA ATT CTC TTG AAA TTG GTG GAT GCT AAA GAG CG

CMKLR1-3 siRNA靶序列(5^’-3^’)：GAC ACC CAA GGA TAT GTC T

CMKLR1-3 top寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：GAT CCG ACA CCC AAG GAT ATG TCT TTC AAG AGA AGA CAT ATC CTT GGG TGT CTT TTT T

CMKLR1-3 bottom寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：AAT TAA AAA AGA CAC CCA AGG ATA TGT CTT CTC TTG AAA GAC ATA TCC TTG GGT GTC G

shRNAc siRNA靶序列(5^’-3^’)：GCT TCG ACA TTT AAC CAA T

shRNAc top寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：CCG GTG CTT CGA CAT TTA ACC AAT TTC AAG AGA ATT GGT TAA ATG TCG AAG CTT TTT TG

shRNAcbottom寡核苷酸链序列(5^’-3^’)：CCG GTG CTT CGA CAT TTA ACC AAT TTC AAG AGA ATT GGT TAA ATG TCG AAG CTT TTT TG

RNAi慢病毒载体构建：用灭菌的超纯水将合成的shRNA寡核苷酸链进行溶解，调整终浓度为20 μmol/L，各取5 μL shRNA寡核苷酸链shRNA top和shRNA bottom混合均匀后，加热退火形成双链的shRNA，4 ℃保存。
将pLVX-shRNA1载体用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶进行双酶切，酶切反应结束后，使用MinEluteReaction Cleanup Kit回收纯化酶切产物，用T4 ligase连接双链shRNA寡核苷酸链与酶切pLVX-shRNA载体。连接得到的载体相应命名为：pLVX- CMKLR1shRNA1、pLVX-CMKLR1shRNA2、pLVX- CMKLR1shRNA3和pLVX- shRNAc。
转化连接产物至大肠杆菌JM107感受态中，涂布含Ampicillin LB平板上，挑取阳性克隆单菌落，送上海生工测序鉴定。大量培养测序成功的重组质粒菌液，收集菌液，按照Endo-free Plasmid Max Kit试剂盒说明提取质粒。将重组质粒转染到NI3T3细胞，48 h后用TRIZOL提取RNA，按照反转录试剂盒说明(PrimeScript RT reBamHnt Kit)反转录为cDNA，采用real-time PCR法检测CMKLR1的mRNA水平，以筛选最佳干扰效果的shRNA，
慢病毒包装：按照Lenti-X Lentiviral Expression Systems试剂盒说明书步骤将重组质粒shRNAc、pLVX- CMKLR1 shRNA、pLVX-GFP和病毒包装质粒共转染到293T细胞包装慢病毒，48 h收集含病毒的上清培养基，超速离心纯化。经计算慢病毒的滴度约为8.7×10⁹ TU/L。
CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞株构建：培养血管平滑肌细胞，将病毒转染细胞，用2 mg/L的Puromycin对细胞进行筛选，每隔2 d换液1次，共筛选7 d。筛选完成后，提取细胞中RNA，反转录成cDNA，用real time PCR法检测血管平滑肌细胞中CMKLR1 mRNA水平。
主要观察指标：①血管平滑肌细胞培养及鉴定结果。②慢病毒载体基因测序结果。③pLVX-CMKLR1shRNA筛选结果。④CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞构建和鉴定结果。
统计学分析：所有数据以x±s表示，使用SPSS 12.0统计学软件，采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异具有显著性。

讨论

CMKLR1是趋化素的主要受体，在趋化素被发现之前CMKLR1就被发现。1996年Owman等[8]从B淋巴母细胞的cDNA文库中发现一个新cDNA序列，该序列编码的蛋白质与G蛋白耦联家族受体家族具有高度同源性，命名为CMKLR1(Chemokine like receptor 1)。因为未找到相应的配体，CMKLR1曾一直被认为是一个孤儿受体。1997年，Chemerin在治疗银屑病患者的过程中通过减差杂交法在患者的皮肤中发现了一种新的蛋白，该蛋白可被维甲酸诱导表达，故被命名为维甲酸受体应答元件。1998年Samson等^[19]发现该蛋白与神经肽具有同源性，并有介导抗原递呈的作用。2003年，Meder和Wittamer等先后在卵巢癌患者的腹水和外周血中分离纯化出趋化素，并证实趋化素是CMKLR1的配体^[12-13]。最近研究发现，趋化素还存在另外两个受体：CCRL、GPR1，CCRL主要在肥大细胞表达，GPR1主要在造血组织如胸腺、骨髓等表达[14-15]。
早期的研究已经证实了趋化素与代谢综合征的相关性，在2型糖尿病患者中也发现其血清趋化素水平明显升高，在进行减肥手术后趋化素水平明显下降[14]。最近，Spiroglou等^[3]研究发现，人冠状动脉周围的脂肪组织及冠状动脉病变部位的血管平滑肌细胞和泡沫细胞均可高表达趋化素，且冠状动脉粥样硬化病变的严重程度与趋化素的水平正相关；在猝死患者的尸体解剖中也发现，冠状动脉不稳定斑块中的泡沫细胞和内皮细胞均存在趋化素高表达。冠心病患者血浆趋化素显著升高，与冠状动脉病变支数、心率、血压、纤维蛋白原、空腹血糖和肌酐水平等密切相关^[4]。Yoo等^[20]检测了58例肥胖患者的血清趋化素，发现趋化素与踝肱指数、体质量指数、胰岛素抵抗、低密度脂蛋白、三酰甘油、超敏C反应蛋白等正相关，与颈动脉内膜厚度不相关，认为循环趋化素水平升高是动脉粥样硬化的独立危险因素。国内学者也发现，冠心病患者血浆趋化素显著升高，与冠状动脉病变支数、心率、血压、白细胞数量、中性粒细胞比例、hsCRP、纤维蛋白原、空腹血糖和肌酐水平等密切相关^[21]。以上研究均表明趋化素信号通路与动脉粥样硬化的发生具有相关性。
最近，Kaur等[15]发现人血管内皮细胞存在CMKLR1受体，肿瘤坏死因子a、白细胞介素1β、白细胞介素6等可使其表达上调；趋化素与CMKLR1受体结合后可通过活化P42/44MEK信号通路，诱导血管内皮细胞增殖和新生血管形成。
Watts等[22]发现趋化素在血管周围的脂肪组织中高表达，而CMKLR1则在血管中膜及内膜均有表达，用CMKLR1受体的激动剂趋化素9可以呈浓度依赖的促进胸主动脉收缩，相反CMKLR1受体的拮抗剂CCX832可以抑制去甲肾上腺素和前列腺素F2α诱导的胸主动脉收缩。
目前对于趋化素在动脉粥样硬化中的作用还存在争议，如Lehrke等^[23]认为血清趋化素水平虽与血糖、血脂水平正相关，但不能预测冠脉病变的发生。
血管平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞，其增殖和迁移是导致动脉粥样硬化、血管介入后发生再狭窄的主要原因。鉴于研究发现冠心病时趋化素/CMKLR1信号通路被激活，作者采用RNAi的方法设计和合成了3个shRNA，与慢病毒载体结合构建了pLVX-CMKLR1 shRNA，经DNA测序证实慢病毒载体构建成功，用荧光定量PCR发现pLVX-CMKLR1 shRNA3对CMKLR1基因的抑制作用最显著(P < 0.001)。将挑选出来的pLVX-CMKLR1 shRNA3包装形成慢病毒并感染血管平滑肌细胞形成细胞系，定量PCR证实该细胞系CMKLR1 mRNA水平明显下降(P < 0.001)，表明CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系构建成功。
在下一步的研究中，将利用该细胞系研究趋化素/ CMKLR1信号通路被沉默后血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的变化情况，同时构建冠心病和再狭窄动物模型，将病毒转染到体内研究趋化素/CMKLR1信号通路对冠状动脉粥样硬化和颈动脉损伤后再狭窄的作用。

慢病毒载体构建小鼠CMKLR1基因缺陷性血管平滑肌细胞系

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