2.1   兔BMSCs的形态   采用全骨髓法获取的兔BMSCs形态呈长梭形，培养至第10天后细胞逐渐增多，簇集生长。经过传代培养后，细胞基本铺满整个T25瓶底，呈漩涡性生长，见图1。



.2   兔BMSCs流式鉴定结果   流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物的表达：CD29(96.7%)、CD44(95.9%)、CD90(97.7%)阳性表达，CD34(0.3%)、HLA-DR(0.5%)阴性表达，符合兔BMSCs的免疫表型，见图2。
2.3   兔BMSCs多向分化能力鉴定   茜素红染色可见红色矿化钙结节；油红O染色可见大量的黄褐色沉着；阿利新蓝染色可见许多蓝色颗粒，细胞质呈现蓝紫色，且细胞之间相互聚集，形成细胞外基质结构，见图3。
2.4   载淫羊藿苷缓释微球、SF/CS/nHA支架、载药微球三维复合支架的扫描电镜及大体图   不同浓度淫羊藿苷缓释微球三维支架在外观上无显著差异，它们都是实心的白色圆柱体，大小可以根据需要塑形(图为SF/CS/nHA-ICA支架制作于96孔板中，高约1 cm，直径约0.5 cm)；淫羊藿苷缓释微球低温真空冷冻干燥后为白色粉末。扫描电镜下观察支架为不规则形网状多孔结构，孔径相间，孔壁凹凸不平；微球呈直径不一的球形，高倍镜下观察可见微球表面有细小孔隙，淫羊藿苷缓释微球均匀分布于三维支架中，见图4。




2.5   不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架对兔BMSCs增殖能力的影响   培养12 h时，10，50 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组吸光度值明显高于其余组(P < 0.05)，0.1，1，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组之间无明显差异；培养24，48 h时，0.1，1，10，50，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)，10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组最为显著；培养72 h时，1，10，50 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)，10，50 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组之间无明显差异，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组吸光度值明显低于其余组，见图5。



2.6   细胞死活染色结果   荧光显微镜下显示，载药支架浸取液培养48 h后，可见大量存活的骨髓间充质干细胞，为绿色荧光；除100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组有大量死细胞外，其他组可见少量死亡细胞，为红色荧光。实验表明，一定浓度范围内的淫羊藿苷缓释微球支架(0.1-50 μmol/L)对BMSCs具有促进增殖作用，高浓度淫羊藿苷缓释微球支架
(100 μmol/L)可能对BMSCs具有一定毒性作用，见图6。



2.7   不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架对BMSCs迁移能力的影响   细胞划痕实验显示：培养24 h时，0.1，10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组细胞迁移率较其余组明显(P < 0.05)，而0.1，10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组间无差异(P > 0.05)；培养48 h 时，10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组划痕区基本被迁移的细胞填满，而其他组虽较于24 h迁移的细胞增多，但10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组细胞迁移区域最大，说明淫羊藿苷可以促进骨髓间充质干细胞的迁移，且10 μmol/L为最佳缓释浓度，见图7。
2.8   茜素红染色结果   成骨诱导14 d后，茜素红染色显示，淫羊藿苷缓释微球支架组矿化结节数量均多于对照组。茜素红半定量检测结果显示，在0.1-10 μmol/L浓度范围内，随淫羊藿苷浓度增加，BMSCs形成的矿化结节数量越多，并与淫羊藿苷浓度呈正比关系，说明淫羊藿苷对BMSCs的成骨能力有促进作用；当淫羊藿苷浓度增加至50，100 μmol/L时，其成骨促进作用相较于0.1-10 μmol/L浓度有所降低，且50，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组细胞状态变差(细胞脱落、翻边)，说明高浓度淫羊藿苷(50，100 μmol/L)可能抑制细胞生长及抑制成骨分化，见图8A-G。
2.9   碱性磷酸酶染色结果   成骨诱导7 d后，碱性磷酸酶染色显示，不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架均增强了BMSCs的成骨分化能力，当载药浓度升至10 μmol/L时，BMSCs的成骨分化能力更为显著，见图9A-F；碱性磷酸酶活性检测结果显示，不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架组BMSCs的碱性磷酸酶活性均出现了显著上升(P < 0.05)，当淫羊藿苷浓度增加至10 μmol/L，碱性磷酸酶活力上升最为显著(P < 0.05)，见图9G。




2.10   不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架对BMSCs成骨及成血管相关蛋白表达的影响   成骨诱导14 d后，与对照组相比，0.1-50 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2、骨钙素、血管内皮生长因子蛋白表达量均明显增强，10 μmol/L最为显著，差异有显著性意义(P < 0.05)，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2、骨钙素、血管内皮生长因子蛋白表达量低于对照组，见图10。

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骨缺损是指由于创伤、肿瘤切除、感染、先天性发育不良或退行性疾病等原因，导致的骨组织部分或完全丧失，骨缺损的病理特点包括缺乏足够的骨基质、血供不足、成骨细胞功能受限等，这些因素限制了机体的自然修复能力，可能导致骨不连、畸形愈合甚至永久功能丧失。骨缺损在临床上是一项重大挑战，尤其是大面积骨缺损和复杂的解剖部位缺损[1]。
目前骨缺损研究的热点方向集中在提高修复效果、缩短愈合时间以及实现个性化治疗。组织工程骨是骨缺损修复研究的核心方向，通过结合种子细胞、生物支架和生长因子，在骨缺损部位诱导新骨形成[2-3]。相比于传统种子细胞-生物支架-生长因子模式，药物递送系统结合骨组织工程支架具有重要的研究意义和临床价值：①提升骨组织工程的治疗效果；②降低全身药物不良反应；③模拟骨组织自然愈合过程；④个性化治疗和精准医学；⑤提高骨移植材料的生物功能性；⑥解决传统骨修复方法的局限性；⑦推动多学科交叉发展。传统缓释系统作用精准、缓释机制成熟，但可能存在免疫反应或不良反应；相比于传统缓释系统，中药缓释递送系统具有安全性高、作用温和、复合调节等优势，但药物提取和标准化存在挑战；未来的研究方向应结合两者优势，开发复合型缓释系统，以实现精准、高效、安全的骨组织修复[4-5]。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类源自骨髓的多能性干细胞，具备自我更新及多向分化的能力，可在适当条件下分化为多种类型细胞，包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。相比其他类型的干细胞(如胚胎干细胞、诱导多能干细胞)，BMSCs具有易于取材、免疫原性低、较强的旁分泌效应、可结合先进的生物材料技术等优势。课题组前期制作了具有良好生物相容性且孔隙率、孔径、机械强度等方面均能满足骨缺损修复基本要求的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石(silk/fibroin/chitosan/nanohydroxyapatite，SF/CS/nHA)三维复合支架[6-8]。淫羊藿苷(Icariin)是从中药淫羊藿中提取的天然活性成分，在心血管保护、抗炎、抗肿瘤、神经保护、抗衰老，特别是骨缺损修复方面具有重要的应用价值。研究表明，淫羊藿苷在一定药物浓度范围内具有促进成骨、抑制破骨的能力，然而，淫羊藿苷搭载于微球缓释递送系统并结合骨组织工程支架的成骨作用及科研转化仍需进一步深入研究，包括载药浓度、药代动力学、毒性评价及长期安全性评估等[9-15]，因此，探究提高淫羊藿苷在体内的利用率、稳定性和缓释性，确保淫羊藿苷在骨缺损部位持续释放并保持有效浓度成为研究新热点[16-20]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞实验。两组间比较采用 t 检验，不同时间点比较采用配对 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2023年12月至2024年12月在遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   新西兰大白兔1只，2月龄，雄性，体质量2 kg，购自重庆康格生物科技有限公司，实验动物合格证号：SCXK(黔)2021-0001，饲养于遵义市第一人民医院中心实验室动物中心，自由饮水，定期喂养。该研究已通过遵义市第一人民医院实验动物伦理委员会审核，编号：伦审(2024)-2-742号。实验动物在全身麻醉下进行所有的手术操作，且最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验试剂和仪器   牛血清白蛋白(Biosharp公司)；DMEM/F12低糖培养基(Gibco公司)；淫羊藿苷(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司)；丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石(Aladdin公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，98%)、甲醇溶液、乙醇溶液、二氯甲烷溶液、浓硝酸溶液、聚乙烯醇粉末、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、氯化钙粉末、二甲基亚砜(中国成都科隆化学试剂公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；细胞计数板(Invitrogen公司)；胰酶、双抗、茜素红S染色液、碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒、活细胞/死细胞双染试剂盒；PAGE凝胶制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、高效RIPA裂解液、CCK-8试剂盒(索莱宝公司)；双色预染蛋白Marker(10-250 kD)、ECL超灵敏化学发光检测试剂盒、快速封闭液(5×)(雅酶生物公司)；PVDF膜(0.45 μm，Millipore公司)；CD29抗体、CD34抗体、CD44抗体、CD90抗体、HLA-DR抗体(北京博奥森公司)；Coralite488-conjugated Goat Anti-Rabbit lgG(H+L)(Proteintech 公司)；CO2 恒温培养箱(Panasonic公司)；成骨诱导培养基、成脂诱导培养基(Procell 公司)；成软骨诱导培养基(Sciencell公司)；Ⅰ型胶原蛋白(Proteintech，67288-1-Ig)；Runt相关转录因子2(Proteintech，20700-1-AP)；骨钙素(Abcam，ab133612)；血管内皮生长因子(Proteintech，19003-1-AP)；T25培养瓶、15 mL离心管、50 mL离心管(Bioland公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   BMSCs的分离与培养   取2 kg新西兰大白兔1只，用1%戊巴比妥钠肌肉注射麻醉，待麻醉成功后，采取仰卧位固定四肢，双膝关节备皮、消毒，铺无菌手术巾，使用2%利多卡因局部麻醉，无菌骨髓穿刺针接20 mL注射器，注射器预先吸取5 mL含肝素的DMEM/F12低糖培养基，抽取双侧股骨、胫骨骨髓5 mL，上下颠倒轻轻摇匀后转移至15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，重复离心2次后弃上清，加入6 mL DMEM/F12完全培养基重悬细胞后转移至25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中静置培养，3 d后首次半换液，以后每两三天换液1次，在显微镜下观察细胞生长状态。待细胞长满瓶底 80%-90%汇合度时，用0.25%胰酶消化细胞，以1∶2比例传代培养，依次记为第1代(P1)、第2代(P2)、第3代(P3)，依次类推[21-22]。
1.4.2   流式细胞术检测BMSCs表型以及多向分化潜能鉴定   取第3代生长状态良好的 BMSCs，待细胞生长至90%汇合度时用0.25%胰酶消化，以1 000×g离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤细胞，重复2次，调整细胞浓度为1×109 L-1。取6支流式管，分别标记空白对照组、实验组(CD29、CD34、CD44、CD90、HLA-DR)。取6份100 μL细胞悬液分别置于空白对照组和实验组流式管，按照说明书在实验组流式管中分别加入一抗(CD29、CD34、CD44、CD90、HLA-DR)，避光孵育30 min，洗涤后用500 μL PBS重悬制备单细胞悬液，上流式细胞仪检测，结果用FlowJo 10.10.0软件分析。
选取第3代生长状态良好的BMSCs，待细胞生长至约90%汇合度时用0.25%胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，添加含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，制备成细胞悬液，调整细胞浓度至2×109 L-1，接种至6孔板中，每孔1 mL细胞悬液。当细胞融合度达到70%-80%时，分别加入成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基和成脂诱导培养基，培养14 d后进行茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色。所有染色操作严格按照各自试剂盒的使用手册执行，在显微镜下观察和拍照记录实验结果。
1.4.3   不同浓度淫羊藿苷缓释微球制备与表征   称取1 mg淫羊藿苷，按相应分子质量(676.66 kD)换算后，加入147.8 μL二甲基亚砜溶液充分溶解，配制成浓度为10 mmol/L的原液，-20 ℃备用。药物稀释：将原液浓度为10 mmol/L的淫羊藿苷单体用完全培养基(含体积分数1%胎牛血清、10%双抗的DMEM/F12培养基)按相应比例稀释至 0.1，1，10，50，100 μmol/L的浓度梯度，即：①取原液10 μL，加入1 mL培养基稀释至100 μmol/L；②取①中溶液500 μL，加入500 μL培养基稀释至50 μmol/L；③取②中溶液200 μL，加入800 μL 培养基稀释至10 μmol/L；④取③中溶液100 μL，加入900 μL 培养基稀释至1 μmol/L；⑤取④中溶液100 μL，加入900 μL培养基稀释至0.1 μmol/L。
采用复乳溶剂挥发法制备淫羊藿苷缓释微球。将上述不同浓度淫羊藿苷溶液和10 mg牛血清白蛋白溶于100 μL去离子水中，为水相。将100 mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于2 mL有机溶剂二氯甲烷中，制得油相。将水相加入油相中，在冰浴条件下超声处理得到初乳。然后，将初乳加入10 mL 2%聚乙烯醇水溶液中，形成复乳。将复乳转移至400 mL 10%氯化钠水溶液中，使用磁力搅拌器搅拌4 h，4 ℃、3 000 r/min离心20 min，弃去上清液，用超纯水洗涤沉淀3次，再次离心收集得到缓释微球，用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，得到的沉淀即为不同浓度的淫羊藿苷缓释微球，称质量并记录数据，置于4 ℃保存。将缓释微球固定、脱水、干燥、喷金处理，扫描电镜观察缓释微球形态。
1.4.4   载淫羊藿苷缓释微球的SF/CS/nHA三维复合支架制作与表征   SF/CS/nHA复合支架制作[23]：将丝素蛋白、壳聚糖和纳米羟基磷灰石以1∶1∶1体积比溶解调配成混合溶液，在65-85 ℃的恒温条件下用磁力搅拌器搅拌4 h，确保溶液充分混合。将混合溶液迅速倒入96孔板，置于-80 ℃冰箱中冷冻24 h。冷冻后，放入真空干燥机中真空冷冻干燥处理48 h。干燥后，将支架浸泡在含有甲醇和氢氧化钠的混合溶液中预处理10 h，用超纯水多次清洗，再次进行真空干燥。然后，将支架浸泡在由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合的交联剂溶液中，反应交联10 h。最后，将复合支架放入-80 ℃冷冻24 h，再进行48 h的真空干燥，密封保存备用。将制作的SF/CS/nHA支架放入96孔板中，取不同浓度淫羊藿苷缓释微球分散于双蒸水中形成混悬液，取200 μL微球混悬液均匀滴于支架上，立即放入-80 ℃冰箱中冷冻24 h，真空冷冻干燥机干燥24 h，制备成淫羊藿苷缓释微球-SF/CS/nHA三维复合支架，环氧乙烷低温消毒备用。将复合支架固定、脱水、干燥、喷金处理，扫描电镜观察支架孔径及淫羊藿苷缓释微球在支架上的分布情况。
1.4.5   CCK-8检测不同浓度淫羊藿苷缓释支架对兔BMSCs增殖的影响   取第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度为2×105 L-1，充分混匀后以每孔100 μL 细胞悬液接种至含有不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架的96孔板中，分为对照组(0 μmol/L)和淫羊藿苷缓释微球支架组(0.1，1，10，50，100 μmol/L)，每组设置5个复孔，分别于12，24，48，72 h根据 CCK-8 试剂盒说明操作，酶标仪检测 450 nm处的吸光度值。
1.4.6   活死染色   将5种不同浓度淫羊藿苷缓释支架(0.1，1，10，50，100 μmol/L)浸泡在含有DMEM/F12完全培养基的15 mL离心管中，得到含不同浓度载药支架浸取液的完全培养基。取第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度为1×107 L-1，以每孔500 μL接种至24孔板中，待细胞贴壁后分别用含有0(对照组)，0.1，1，10，50，100 μmol/L载药支架浸取液的完全培养基培养48 h，根据活死染色试剂盒说明，将BMSCs置于活死染液中染色30 min，无菌PBS洗涤3次后置于荧光显微镜下观察，活细胞染色显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光。采用Image J软件计算培养48 h时各组支架内的细胞存活率(绿色荧光面积占比)。
1.4.7   划痕实验   将第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度至1×107 L-1，以每孔1 mL接种到6孔板中，待细胞汇合度达到85%-90%时，使用无菌移液器200 μL吸头在细胞表面划出无细胞的划痕区，然后用含有0，0.1，1，10，50，100 μmol/L载药支架浸取液的完全培养基进一步培养，分别在培养0，24，48 h用倒置光学显微镜观察并拍摄图像。采用Image J软件计算培养24，48 h时相较于0 h的细胞迁移率[(细胞迁移区域面积/0 h划痕区域面积)×100%]。
1.4.8   茜素红染色   取第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 L-1，以每孔500 μL接种于12孔板，待细胞汇合度为60%时，更换为含0，0.1，1，10，50，100 μmol/L载药支架浸取液的成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素/链霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸酯、10 nmol/L地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸的DMEM/F12培养基)，每3 d换液1次，成骨诱导14 d后，40 g/L多聚甲醛固定，1%茜素红染色，倒置显微镜下观察矿化结节并拍照记录。然后，每孔加入1 mL 10%十六烷基吡啶，37 ℃孵育30 min，多功能酶标仪检测562 nm波长下的吸光度值。
1.4.9   碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性检测   取第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度为5×104 L-1，以每孔500 μL接种于12孔板，待细胞汇合度为60%时，更换为含0，0.1，1，10，50，100 μmol/L载药支架浸取液的成骨诱导液。①碱性磷酸酶染色：成骨诱导7 d 后，根据检测试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色。②碱性磷酸酶活性检测：成骨诱导7 d 后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液，使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，将每组蛋白浓度调至一致后，按照碱性磷酸酶定量试剂盒说明书进行碱性磷酸酶定量检测和分析。
1.4.10   Western blot 检测成骨相关蛋白的表达   取第3代兔BMSCs消化成细胞悬液，调整细胞浓度为1×107 L-1，以5 mL/瓶接种于T25培养瓶，用DMEM/F12完全培养基培养，每隔3 d换液1次，待细胞生长汇合度达60%左右，更换为含0，0.1，1，10，50，100 μmol/L载药支架浸取液的成骨诱导液进行培养，诱导14 d后用冰PBS冲洗3遍，按照试剂盒提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸变性15 min，待冷却后放入-20 ℃冰箱保存备用。Western blot步骤：制备SDS-PAGE凝胶，加入蛋白样品和Marker 后，将电压调至90 V恒压电泳，待电泳至溴酚蓝离最底部大约1 cm处停止电泳，取出玻板；准备6张滤纸及大小适中的PVDF(0.45 μm)膜，甲醇激活PVDF膜，按照顺序放置凝胶和PVDF膜，放入装满电转液的转膜槽中，电流400 mA，转膜45 min，转膜结束后将膜放入TBST中快速涮洗3次后加入5%脱脂牛奶，摇床上室温封闭30 min。根据抗体使用说明书，按照推荐的比例稀释一抗，所用抗体包括：GAPDH(1∶1 000)、Runt相关转录因子2(1∶2 000)、骨钙素(1∶1 000)、血管内皮生长因子(1∶2 000)以及Ⅰ型胶原(1∶2 000)。将稀释后的抗体加入样本中，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，加入稀释后的二抗[Goat Anti-Rabbit IgG-H&L (HRP) 1∶5 000]，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5 min，将PVDF膜浸入ECL化学发光试剂中，用滤纸吸去多余的液体，在凝胶成像仪下显影和曝光。利用Image J软件对目标蛋白的灰度值进行统计分析，计算目的蛋白的相对表达量。
1.5   主要观察指标   ①扫描电镜下空白支架、淫羊藿苷微球、载淫羊藿苷微球支架的微观结构及大体观；②含不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架对BMSCs增殖活性、迁移能力的影响；③含不同浓度淫羊藿苷缓释微球支架对BMSCs成骨及成血管相关蛋白表达的影响。

1.6   统计学分析   应用 SPSS 29.0统计软件进行数据分析处理。数值变量资料用x±s表示，两组组间比较采用 t 检验，多组组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法通过遵义医科大学相关统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

BMSCs在骨缺损修复中具有显著优势[24-28]：①强大的成骨分化能力：BMSCs能够自我更新并分化为成骨细胞，通过Wnt/β-catenin、BMP/Smad 等信号通路促进骨形成，加速骨修复过程；②促进骨再生和矿化：BMSCs可以分泌成骨相关因子(如骨形态发生蛋白2、碱性磷酸酶)，增强骨基质的合成并促进矿化，提高新生骨质量；③良好的生物相容性：BMSCs可与生物支架材料(如丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架)结合，形成细胞-材料复合体系，提升组织工程支架的成骨性能；④调节骨微环境：BMSCs能够分泌细胞因子(如血管内皮生长因子、转化生长因子β)调控局部炎症反应，促进血管生成，为骨组织修复提供必要的营养和血供支持；⑤免疫调节作用：BMSCs可以通过抑制T细胞增殖、调节巨噬细胞极化等机制，减轻骨修复过程中的免疫排斥反应，提高移植存活率；⑥适用于多种骨缺损模型：研究表明，BMSCs在长骨缺损、颅骨缺损、椎体修复等多种动物模型中均表现出良好的成骨效果，具有广泛的临床应用潜力；⑦可结合缓释系统增强治疗效果：结合药物及生长因子缓释系统，BMSCs的成骨能力可进一步增强，通过持续释放促骨生长因子，改善骨组织修复效果[29-30]。未来的研究将集中于提高细胞移植效率、优化细胞与支架材料的整合以及探索更加高效的成骨诱导方法。
载药缓释系统与骨组织工程结合可通过精准调控药物释放促进骨修复，提高治疗效果，同时降低全身不良反应。它能模拟骨愈合动态过程，提升骨移植材料的生物活性，优化个性化治疗策略，克服传统骨修复局限，推动多学科交叉发展，具有重要的科学价值和临床应用前景。中药缓释系统因独特的优势及亮点逐渐成为骨组织工程中新兴的研究热点。中药缓释系统在骨组织工程中具有安全性高、作用温和、复合调节等优势，但药物提取和标准化存在挑战；传统缓释系统作用精准、缓释机制成熟，但可能存在免疫反应或不良反应。未来的研究方向应结合两者优势，开发复合型缓释系统，以实现精准、高效、安全的骨组织修复。淫羊藿苷具有抗氧化、抗炎、促骨形成等多重生物活性，有助于改善骨修复过程中的微环境。通过缓释系统(如纳米载体、水凝胶、聚合物基材料等)，淫羊藿苷能够在骨缺损部位持续释放，提供长时间的生物活性，增强疗效。相比于传统药物，淫羊藿苷不良反应较小，能更好地适应长期治疗。未来的研究将集中于开发更高效、智能化的缓释载体，并推动临床转化，为骨组织工程提供更加理想的治疗方案[31-36]。然而，淫羊藿苷浓度对成骨作用及毒性的影响需要综合考虑。研究表明，低浓度的淫羊藿苷对成骨细胞具有显著的增殖和分化促进作用，同时毒性较低，高浓度的淫羊藿苷促成骨效果增强，但部分细胞可能出现轻微毒性反应，具体表现为细胞活性降低[37-38]；当浓度过高时，淫羊藿苷可能对成骨细胞产生抑制作用甚至毒性，表现为细胞凋亡增加、线粒体功能受损等[40-42]。目前，探索三维骨组织工程复合支架上淫羊藿苷的缓释浓度研究更是少之又少[31-43]。
该研究使用含有不同缓释浓度淫羊藿苷的培养体系，分别观察其对兔BMSCs增殖、迁移、成骨能力的影响。细胞增殖实验表明，相较于对照组(0 μmol/L)，各实验组的细胞吸光度值自12 h起呈上升趋势，特别是在48 h时，10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组的吸光度值显著高于其他组。随着培养时间的延长和淫羊藿苷浓度的增加，100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组在72 h后的吸光度值明显低于其他组。这一结果表明，淫羊藿苷缓释微球能显著促进兔BMSCs的增殖，尤其在0.1-50 μmol/L
浓度范围内效果最为明显，当淫羊藿苷浓度继续提高时，其促增殖活性逐渐降低，表明BMSCs的增殖能力与淫羊藿苷的浓度呈依赖关系，并存在一个最适浓度区间。细胞活死染色实验结果同样显示一定浓度范围内随着淫羊藿苷浓度增加，BMSCs数量增多(绿色荧光)，而100 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组死细胞数量(红色荧光)明显高于其他组，说明适宜浓度淫羊藿苷对兔BMSCs有促进增殖作用，而高剂量淫羊藿苷可能具有一定的细胞毒性。细胞划痕实验结果显示，培养48 h 时10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组无细胞区域基本被迁移的细胞填满，说明淫羊藿苷可以促进BMSCs迁移，且10 μmol/L淫羊藿苷缓释微球支架组迁移能力最强。Western blot分析结果表明，随着培养基中淫羊藿苷缓释浓度的逐渐增加，成骨和成血管相关蛋白的表达水平也呈现上升趋势，当浓度达到10 μmol/L时，成骨和成血管相关蛋白表达最高；然而，进一步提高淫羊藿苷浓度时，成骨和成血管相关蛋白表达开始出现下降，这表明载药支架能够促进兔BMSCs的成骨分化，且该效应具有浓度依赖性，过高浓度的药物反而会导致相关蛋白表达下降，甚至出现微弱表达的现象。
淫羊藿苷对成骨的作用呈“双相效应”：适宜浓度可促进成骨，而高浓度可能抑制成骨，甚至诱导细胞凋亡，其抑制机制涉及 Wnt/β-catenin负反馈、氧化应激、ERK/MAPK信号失衡、NF-κB激活及线粒体功能障碍[44-45]。因此，在骨组织工程应用中，淫羊藿苷的剂量控制至关重要，应选择适宜的缓释系统以避免高浓度带来的负面效应。
结合实验结果，可知在一定浓度范围内淫羊藿苷缓释对兔BMSCs增殖、迁移和成骨分化均有促进作用，但相关研究仍处于初步阶段，淫羊藿苷缓释系统相关研究具有一定局限性：①药物溶解度与生物利用度稍低；②缓释微球的释放控制不稳定；③高浓度淫羊藿苷具有一定的细胞毒性；④载体材料的相容性和降解问题；⑤体内稳定性及代谢问题及缺乏大规模临床研究。未来研究应聚焦于提高溶解度、优化缓释系统、探索安全剂量、改进载体材料及加强临床验证，以推动淫羊藿苷缓释系统在骨组织工程领域的实际应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

淫羊藿苷：是一种从传统中药植物淫羊藿中提取的天然黄酮类化合物，淫羊藿苷作为淫羊藿的主要作用成分，因潜在的药理作用而备受关注，特别是在骨骼健康、免疫调节、心血管疾病等方面。

药物缓释：作为一种药物载体递送系统，能够有效地缓慢释放药物并改善药物的生物利用度，尤其是在骨组织工程中，不仅使药物定向释放，还能结合支架材料进一步促进骨组织的修复。#br#

骨组织工程主要依赖于种子细胞、支架材料和生物活性因子的协同作用。骨髓间充质干细胞是一类来源于骨髓的成体干细胞，其具有多向分化潜能和强大的自我更新能力，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。骨髓间充质干细胞作为重要种子细胞，相比其他类型的干细胞(如胚胎干细胞、诱导多能干细胞)，在骨组织工程中具有易于取材、免疫原性低、具有较强的旁分泌效应、可结合先进的生物材料技术等优势。中药缓释系统在骨组织工程领域可实现骨再生、改善微环境、降低毒副作用，并与生物材料结合拓展应用，其优势在于天然药物的精准释放、智能响应释药、复合多功能支架及多靶点协同作用，推动多学科交叉发展，具有重要的科学价值和临床应用前景。淫羊藿苷(Icariin，ICA)缓释系统可精准递送成骨活性药物，促进骨生成，抑制骨吸收，并增强骨修复材料的生物活性。在智能控释技术、抗炎抗氧化协同效应及与3D打印等先进材料结合方面具有明显优势，为骨组织工程提供高效、安全的治疗策略，推动中药现代化发展。#br#

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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