紫草素干预骨髓间充质干细胞改善老年小鼠股骨的微结构

doi:10.12307/2025.577

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1609-1615.doi: 10.12307/2025.577

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紫草素干预骨髓间充质干细胞改善老年小鼠股骨的微结构

胡雄科，刘少华，谭谦，刘昆，朱光辉

中南大学湘雅医学院附属儿童医院(湖南省儿童医院)骨科，湖南省长沙市 410000

收稿日期:2024-11-19 修回日期:2025-02-28 接受日期:2025-03-17 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-17
通讯作者: 朱光辉，博士，主任医师，中南大学湘雅医学院附属儿童医院(湖南省儿童医院)骨科，湖南省长沙市 410000
作者简介:胡雄科，男，1985年生，湖南省株洲市人，汉族，博士，主治医师，主要从事骨骼健康问题相关的临床和基础研究。
基金资助:
湖南省中医药科研项目(D2022083)，项目负责人，胡雄科；湖南省儿童骨科学重点实验室(2023TP1019)，项目负责人，朱光辉

Shikonin intervention with bone marrow mesenchymal stem cells improves microstructure of femur in aged mice

Hu Xiongke, Liu Shaohua, Tan Qian, Liu Kun, Zhu Guanghui

Department of Orthopedics, Children's Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University (Hunan Children's Hospital), Changsha 410000, Hunan Province, China

Received:2024-11-19 Revised:2025-02-28 Accepted:2025-03-17 Online:2026-03-08 Published:2025-08-17
Contact: Zhu Guanghui, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Children's Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University (Hunan Children's Hospital), Changsha 410000, Hunan Province, China
About author:Hu Xiongke, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Children's Hospital Affiliated to Xiangya Medical College of Central South University (Hunan Children's Hospital), Changsha 410000, Hunan Province, China
Supported by:
Hunan Provincial Traditional Chinese Medicine Research Project, No. D2022083 (to HXK); Hunan Provincial Key Laboratory of Pediatric Orthopedics, No. 2023TP1019 (to ZGH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

紫草素：是一种萘醌化合物，从紫草根中提取而得，具有多种生物活性，如抗病毒、抗炎、抗菌和抗癌等。
丝裂原活化蛋白激酶家族：哺乳动物细胞中已经鉴定出14种不同的丝裂原活化蛋白激酶家族成员，并且发现其同源物存在于所有真核细胞中。在哺乳动物细胞中研究最多的级联是经典的MAPK、p38和JNK级联，在控制细胞生长和分化过程中起到重要作用。

摘要
背景：紫草素是一种从紫草中提取的紫色萘醌类色素，具有多种生物学活性，还具有一定的骨保护作用，但作用机制尚不明确。
目的：探讨紫草素促进骨髓间充质干细胞成骨分化的分子机制以及在治疗骨质疏松症中的潜在作用。
方法：①用不同浓度(0.1，0.2，0.4 µmol/L)紫草素干预骨髓间充质干细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖情况；②用不同浓度(0.1，0.2，0.4 µmol/L)紫草素+成骨诱导液共同干预骨髓间充质干细胞7，14 d，分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色；③用不同浓度(0.2，0.4 µmol/L)紫草素+成骨诱导液共同干预骨髓间充质干细胞48 h，提取RNA进行RT-PCR分析；④用0.2 µmol/L紫草素干预骨髓间充质干细胞30，60，120 min，通过蛋白质印迹检测MAPK信号通路中p-P38、p-ERK和p-JNK的表达；⑤18月龄C57BL/6小鼠给予紫草素干预2个月，取小鼠股骨进行Micro-CT扫描，取小鼠胫骨进行骨钙素免疫荧光检测。
结果与结论：①CCK-8检测显示紫草素可以促进骨髓间充质干细胞的增殖；②碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示紫草素可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；③RT-PCR检测显示紫草素可以提高成骨相关基因骨钙蛋白、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2的mRNA表达水平；④蛋白质印迹检测显示紫草素可促进骨髓间充质干细胞MAPK信号通路中P38、ERK和JNK的磷酸化；⑤动物实验发现紫草素可以改善老年小鼠股骨的骨微结构，提高胫骨骨钙素的表达。结果表明：紫草素通过MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化，改善骨质疏松小鼠的骨微结构。

https://orcid.org/0000-0002-1503-660X (胡雄科)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 紫草素, 骨质疏松症, MAPK信号通路, 成骨, 工程化干细胞

Abstract: BACKGROUND: Shikonin, a purple naphthoquinone pigment extracted from Lithospermum erythrorhizon, exhibits diverse biological activities. Additionally, shikonin has been demonstrated to possess bone-protective effects. However, its action mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To elucidate the molecular mechanisms by which shikonin promotes osteogenic differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells, and its potential application in the treatment of osteoporosis.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with varying concentrations (0.1, 0.2, and 0.4 µmol/L) of shikonin, and their proliferation was assessed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells were co-treated with different concentrations (0.1, 0.2, and 0.4 µmol/L) of shikonin and osteogenic induction medium. After osteogenesis induction for 7 and 14 days, alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were performed. (3) Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with different concentrations (0.2 and 0.4 µmol/L) of shikonin for 48 hours. RNA was extracted for real-time PCR analysis. (4) Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with 0.2 µmol/L shikonin for 30, 60, and 120 minutes. Expression levels of p-P38, p-ERK, and p-JNK in the MAPK signaling pathway were detected by western blot assay. (5) Eighteen-month-old C57BL/6 mice were treated with shikonin for two months, followed by micro-CT scanning of rat femurs. The tibiae of mice were taken for osteocalcin immunofluorescence detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay indicated that shikonin promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. (2) Alkaline phosphatase staining and alizarin red staining suggested that shikonin enhanced osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. (3) RT-PCR results showed increased mRNA levels of osteogenic gene markers osteocalcin, alkaline phosphatase, bone morphogenetic protein 2, and Runt-related transcription factor 2. (4) Western blot assay revealed that shikonin induced phosphorylation of P38, ERK, and JNK in the MAPK signaling pathway of bone marrow mesenchymal stem cells. (5) Animal experiment findings indicate that shikonin can improve the bone microstructure of the femur of aged mice and increase the expression of osteocalcin in the tibia. The results show that shikonin promotes the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells through the MAPK signaling pathway and improves the bone microstructure of osteoporotic mice.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, shikonin, osteoporosis, MAPK signaling pathway, osteogenesis, engineered stem cell

中图分类号:

胡雄科, 刘少华, 谭谦, 刘昆, 朱光辉. 紫草素干预骨髓间充质干细胞改善老年小鼠股骨的微结构[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1609-1615.

Hu Xiongke, Liu Shaohua, Tan Qian, Liu Kun, Zhu Guanghui. Shikonin intervention with bone marrow mesenchymal stem cells improves microstructure of femur in aged mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1609-1615.

图/表（结果） 2

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨质结构破坏和骨组织微结构改变为特征的慢性疾病。骨质疏松症人群发生骨折的风险较高，并且骨折后恢复的难度较大。目前全球骨质疏松症患者已经超过了2亿，并且每年由骨质疏松症引起的骨折患者超过了900万 [1]。随着年龄的增长，骨密度逐渐降低，患骨质疏松症的风险更高[2]。目前，市场上针对骨质疏松症的药物主要有雌激素[3]、双膦酸盐和降钙素等[4-5]，但整体治疗效果欠佳，同时伴随较多不良反应[6]。目前也有一些分子靶向药物用于治疗骨质疏松症，比如地诺单抗与罗莫珠单抗，但缺乏长期的随访结果，并且价格昂贵[7]。
骨重塑是成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收之间的动态平衡[8]。老年性骨质疏松症主要是由于骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化减弱，骨形成降低所致[9]。有研究证实，骨再生或重塑与骨形成和血管生成密切相关[10]。进一步研究发现，骨髓间充质干细胞的成骨分化功能和血管生成能力下降是骨质疏松症进展的重要机制[11]。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信使家族是一类广泛分布于真核生物中的蛋白激酶，在细胞增殖、凋亡和分化等方面发挥着关键的作用[12]。MAPK家族包括ERK1/2、p38和JNK等亚家族，每个亚家族有不同的活性和底物特异性，调控细胞功能有着独特的作用[12]。ERK信号通路的激活可以促进成骨细胞分化和骨基质合成，而p38和JNK信号通路则参与应激刺激作用下成骨细胞的分化和成熟[13-15]。还有研究证实通过激活MAPK信号通路可以增强血管内皮生长因子的转录，增加血管内皮生长因子表达而促进血管形成[16]。
紫草素是一种萘醌化合物，从紫草根中提取而得，具有多种生物活性，如抗病毒[17]、抗炎[18]、抗菌[19]、抗癌等[20]。已有研究表明，紫草素可通过骨形态发生蛋白2/Smad5信号通路促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化[21]。紫草素还可以抑制破骨细胞的生成，减轻牙周炎诱导的骨质流失[22]。在骨肿瘤方面，紫草素上调细胞内活性氧水平，促进骨肉瘤细胞死亡[23-24]。紫草素可以缓解骨关节炎引起的软骨破坏和关节肿胀[25-26]，具有一定的骨保护作用，但是目前尚没有关于紫草素干预骨髓间充质干细胞影响成骨分化的研究报道。该研究探讨紫草素能否通过MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化和血管形成，从而治疗骨质疏松症。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学和体内动物实验，数据比较采用 t 检验，多组间比较采用 ANOVA-One Way 检验。
1.2 时间及地点 实验于2022年1月至2023年12月在湖南省儿童医院儿科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 18月龄C57BL/6小鼠12只，雄性，体质量约35 g，购买于湖南斯莱克实验动物公司，饲养在湖南省儿童医院儿科研究所动物学部，动物实验机构许可证号：SYXK (湘)2020-0004。
动物实验获得湖南省儿童医院伦理委员会批准，审批编号为KYSQ2021-181。
1.3.2 实验细胞 小鼠骨髓间充质干细胞(CP-M131，武汉普诺赛科技有限公司，中国)，用于后续实验的细胞均为生长状态良好的第5-10代细胞。
1.3.3 实验药物、试剂 紫草素(Sigma，美国)，用PBS稀释；α-MEM(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒(赛业MUXMX-90021，中国)；Osteocalcin抗体(Cell Signaling Technology，sc-376726，1∶200)、p-P38抗体(Cell Signaling Technology，sc-7973，1∶500)、p-JNK 抗体(Cell Signaling Technology，sc-6254，1∶500)、p-ERK抗体 (Cell Signaling Technology，sc-7383，1∶500)和GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，sc-47724，1∶500)。
1.3.4 实验仪器 CO2恒温培养箱(Thermo Fisher，美国)；-80 ℃超低温冰箱(海尔，中国)；低温高速离心机(Eppendorf，德国)；超速离心机(Thermo，美国)；电泳仪(BIO RAD，美国)；凝胶成像系统(BIO RAD，美国)；切片机(徕卡，德国)；倒置荧光显微镜(蔡司，德国)；酶标仪(Thermo Fisher，美国)；荧光定量PCR 仪(ThermoFisher，美国)；Micro-CT分析仪(Brüttisellen，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞增殖检测 使用CCK-8试剂盒按照制造商的说明进行操作。将骨髓间充质干细胞以3×103/孔密度接种到96孔板中，根据已发表文献采用不同浓度紫草素(0，0.1，0.2，0.4 μmol/L)干预1，2，3，4 d[19-21]。干预完成后，加入10 μL CCK-8溶液避光孵育2 h，然后使用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。
1.4.2 成骨诱导分化和矿化评估 将骨髓间充质干细胞以2×104/孔密度接种到24孔板中，在细胞密度达到10%以上时，更换含不同浓度紫草素(0，0.1，0.2，0.4 μmol/L)的成骨诱导培养基，在诱导分化第7天使用碱性磷酸酶染色试剂盒测定碱性磷酸酶活性，在诱导分化第14天使用茜素红S染色试剂盒检测成骨细胞矿化结节形成情况。使用图像分析软件Image J分析染色区域的吸光度值，表示钙化沉积的程度。
1.4.3 RT-PCR 将骨髓间充质干细胞以1×105/孔密度接种到6孔板中，在细胞融合度达到10%以上时，更换含不同浓度紫草素(0.2，0.4 μmol/L)的成骨诱导培养基，在诱导分化第5天采用Trizol法提取细胞总RNA，反转录成cDNA产物用于Real-Time PCR检测相关基因的表达。PCR反应使用小鼠序列的特异性引物，见表1。相对mRNA水平通过比较Ct值法(2-ΔΔCT)计算，使用β-actin作为内参基因进行归一化。

1.4.4 蛋白质印迹分析 将骨髓间充质干细胞以1×105/孔密度接种到6孔板中，在细胞融合度达到80%左右时，更换含0.2 μmol/L紫草素的α-MEM培养基干预30，60，120 min，然后采用RIPA裂解细胞后提取蛋白质，通过12%SDS-PAGE胶电泳分离出蛋白样本，转移到PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭1 h，随后与一抗(p-P38、p-ERK、p-JNK、GAPDH抗体，稀释1∶800)在4 ℃下振荡孵育过夜，用TBST洗涤膜3次，与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育1 h，再用TBST洗涤膜3次，最后曝光显影。使用图像分析软件Image J对蛋白条带进行灰度扫描，计算目标蛋白的相对表达量。

1.4.5 动物实验 将12只18月龄C57BL/6小鼠采用随机数字表法分成对照组和紫草素治疗组，每组6只。参考文献[19-21]，选择3 mg/kg紫草素经尾静脉注射到小鼠体内，对照组注射相同剂量的PBS，每周2次，连续注射2个月后取小鼠同侧股骨和胫骨。所有动物实验程序均按照美国国立卫生研究院(NIH)的《实验动物的护理和使用指南》进行。
1.4.6 Micro-CT分析 小鼠股骨组织经过40 g/L多聚甲醛固定24 h，采用Micro-CT进行扫描。所有数字化数据和3D图像均由Micro-CT的内置软件生成。
1.4.7 免疫荧光检测 小鼠胫骨组织经过40 g/L多聚甲醛固定2 h，采用10%EDTA溶液脱钙处理48 h，用PBS清洗并包埋于石蜡中；切片至7-10 μm厚度并贴于载玻片上，依次进行脱蜡、复水、抗原修复、封闭等步骤；加入特异性抗骨钙素抗体(1∶200)， 4 ℃孵育过夜，PBS清洗后加入荧光标记的二抗室温孵育60 min；PBS清洗后用DAPI进行核染色，最后使用抗荧光淬灭封片剂封固，荧光显微镜观察骨钙素的表达。使用图像分析软件Image J统计单位面积中荧光标记细胞数。
1.5 主要观察指标 ①CCK-8法、碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测紫草素对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响；②RT-PCR检测紫草素对骨髓间充质干细胞成骨相关基因表达的影响：③蛋白质印迹分析检测MAPK信号通路相关蛋白的表达；④Micro-CT检测小鼠股骨骨微结构；⑤免疫荧光检测小鼠胫骨骨钙素的表达。

1.6 统计学分析 实验数据以x±s表示。选择GraphPad Prism 9.5软件对各组之间数据进行t检验或ANOVA统计分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过儿童骨科学湖南省重点实验室统计学专家审核。

讨论

骨稳态是指骨组织在正常生长、发育和修复过程中所维持的一种相对稳定的状态，其中包括骨吸收和骨生成两个方面的平衡[8]。老年性骨质疏松是一种常见的退行性骨疾病，主要特点是骨生成减少，骨质量逐渐下降，引发骨质脆弱[9]，从而增加骨折的风险。甲状旁腺激素类药物、氟化物等可以适当促进成骨细胞增殖和分化，但存在低磷血症和胃肠道疾病等风险[27]。天然化合物由于不良反应小、疗效高等特点，逐渐成为治疗骨质疏松的新方法。已有学者报道，多种来自中草药的活性成分可以促进成骨细胞增殖和分化，改善骨质疏松症[28-29]。该研究发现紫草素可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，通过增强MAPK信号通路中P38、ERK和JNK的磷酸化，改善老年性小鼠的骨骼质量，提示紫草素可作为预防和治疗骨质疏松症的潜在药物。
紫草素是一种紫红色萘醌化合物，主要来源于紫草根。研究表明，紫草素对于多种恶性肿瘤生长抑制具有一定的效果，包括结肠癌、白血病、胃癌、和乳腺癌等[30-33]。除此之外，紫草素还显示出抗炎[18]、抗菌[19]、镇痛的功效[34]。有学者报道紫草素可以通过激活骨形态发生蛋白2/Smad5信号通路促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化[21]，还可以促进MAPK信号通路中p-JNK和p-P38的表达，降低软骨细胞炎症反应，改善骨关节炎症状[35]。MAPK信号通路在骨形成和血管生成过程中发挥重要作用[36-37]。由此推断紫草素可以通过激活MAPK信号通路中p-ERK、p-JNK和p-P38的表达，促进成骨分化和骨形成，改善骨质疏松症。
骨髓间充质干细胞的成骨能力在骨修复和再生中起着至关重要的作用。MAPK信号通路是调控骨髓间充质干细胞成骨向分化的重要途经之一[38-39]。MAPK信号通路包括ERK、JNK、P38等家族成员，参与调节成骨细胞的分化、成熟和骨基质的合成。ERK可以通过调节Runx2的活性和细胞周期调节因子的表达来调控成骨细胞的增殖、分化和凋亡[40-41]，还可以增强碱性磷酸酶活性，参与成骨细胞的生成[42]。
有学者报道，P38信号通路调控碱性磷酸酶活性和Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原的表达，促进干细胞向成骨细胞分化[43]。还有研究发现，骨形态发生蛋白2必须激活P38才能介导成骨分化和成熟[44]。JNK通路参与调节骨髓间充质干细胞或牙周韧带干细胞的成骨分化[45-46]。该研究发现，骨髓间充质干细胞经过紫草素处理后，MAPK信号通路中ERK、P38和JNK的磷酸化上调，骨髓间充质干细胞中成骨相关基因骨钙素、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2表达升高，这些结果表明紫草素可以通过MAPK信号通路途径促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
该研究证实紫草素可以促进骨形成，改善老年小鼠的骨质量，MAPK信号通路中的ERK、P38和JNK参与了这一过程。在体内注射紫草素时，未能设计多个浓度梯度，这在一定程度上限制了研究的深入。在未来的研究工作中，应致力于改进这一不足，以期提升研究的全面性与精确性。总的来看，这项研究为紫草素作为一种潜在的骨质疏松治疗药物提供了科学证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

紫草素干预骨髓间充质干细胞改善老年小鼠股骨的微结构

Shikonin intervention with bone marrow mesenchymal stem cells improves microstructure of femur in aged mice

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