放射性心脏损伤小鼠内皮细胞衰老的诊断标志物筛选及免疫浸润分析

doi:10.12307/2026.573

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (6): 1450-1463.doi: 10.12307/2026.573

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放射性心脏损伤小鼠内皮细胞衰老的诊断标志物筛选及免疫浸润分析

赖家铭1，2，宋玉玲3，陈梓曦4，魏镜桓5，蔡浩1，2，李国权1，6

1青海大学医学院基础医学部，青海省西宁市 810016；青海省第五人民医院(省肿瘤医院)，2肿瘤放疗科，3物理技术工程部，4医疗信息管理办公室，5办公室，青海省西宁市 810007；6青海省人民医院肿瘤内科，青海省西宁市 810007

收稿日期:2024-11-22 接受日期:2025-01-21 出版日期:2026-02-28 发布日期:2025-07-16
通讯作者: 李国权，博士，主任医师，青海大学医学院基础医学部，青海省西宁市 810016；青海省人民医院肿瘤内科，青海省西宁市 810007 共同通讯作者：蔡浩，博士，副主任医师，青海大学医学院基础医学部，青海省西宁市 810016；青海省第五人民医院(省肿瘤医院)肿瘤放疗科，青海省西宁市 810007
作者简介:赖家铭，男，1997年生，青海大学在读硕士，主要从事肿瘤放射生物学的研究。
基金资助:
2019年度青海省“昆仑英才·高端创新创业人才”项目直接引进领军人才(QHKLYC-GDCXCY-2019-026)，项目负责人：李国权；青海省卫生健康委指导性课题(2021-wjzdx-79)，项目负责人：蔡浩；青海省卫生健康委指导性课题(J2024013)，项目负责人：蔡浩

Screening of diagnostic markers for endothelial cell Senescence in mice with radiation-induced heart disease and analysis of immune infiltration

Lai Jiaming1, 2, Song Yuling3, Chen Zixi4, Wei Jinghuan5, Cai Hao1, 2, Li Guoquan1, 6

1Department of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, Qinghai Province, China; 2Radiation Oncology Department, 3Physical Technology Engineering Department, 4Office of Medical Information, 5Hospital Office, Fifth People’s Hospital/Cancer Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, Qinghai Province, China; 6Department of Oncology, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, Qinghai Province, China

Received:2024-11-22 Accepted:2025-01-21 Online:2026-02-28 Published:2025-07-16
Contact: Li Guoquan, PhD, Chief physician, Department of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, Qinghai Province, China; Department of Oncology, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, Qinghai Province, China Co-corresponding author: Cai Hao, PhD, Associate chief physician, Department of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, Qinghai Province, China; Radiation Oncology Department, Fifth People’s Hospital/Cancer Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, Qinghai Province, China
About author:Lai Jiaming, Master candidate, Department of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, Qinghai Province, China; Radiation Oncology Department, Fifth People’s Hospital/Cancer Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, Qinghai Province, China
Supported by:
2019 Qinghai Province “Kunlun Talents - High-end Innovation and Entrepreneurial Talents” Project for Directly Introducing Leading Talents, No. QHKLYC-GDCXCY-2019-026 (to LGQ); Qinghai Provincial Health and Wellness Commission Guiding Subject, No. 2021-wjzdx-79 (to CH); Qinghai Provincial Health and Wellness Commission Guiding Project, No. J2024013 (to CH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
放射性心脏损伤：是指由于胸部肿瘤(如乳腺癌、肺癌、纵隔肿瘤等)放射治疗过程中，心脏及相关结构(如冠状动脉、心包、心肌及心脏瓣膜)受到电离辐射作用而导致的急性或慢性损伤。
细胞衰老：是指细胞周期停滞的状态，在这种状态下增殖细胞会对促生长刺激产生耐受，通常由DNA损伤所引起。

背景：放疗显著提高了多种恶性肿瘤患者的生存率。然而，随着治疗后的生存周期延长，许多患者面临放疗相关的心脏毒性风险，尤其是在接受胸部放疗后，放射性心脏损伤的风险显著增加，已成为影响患者生存最为严重的并发症之一。
目的：通过系统转录组学分析，确定放射性心脏损伤内皮细胞衰老的诊断标志物。
方法：首先，从CellAge数据库中筛选出与细胞衰老相关的基因，然后与放射性心脏损伤小鼠模型的转录组训练数据集进行相交分析，识别衰老相关差异表达基因。其次，结合加权基因共表达网络分析和机器学习，识别出放射性心脏损伤中具有关键作用的枢纽基因，并在放射性内皮损伤验证数据集验证这些基因的表达。此外，采用 quanTIseq方法评估放射性心脏损伤相关的免疫浸润状态。通过分析癌症基因组图谱数据库，探讨关键基因的表达水平与接受胸部放疗的食管鳞状细胞癌患者生存期的关联。
结果与结论：①通过转录组学分析鉴别出CCND1为放射性心脏损伤内皮细胞衰老的核心基因，并在放射性心脏损伤小鼠模型中得到验证；②基于这些数据构建的诊断模型表明，CCND1在放射性心脏损伤的诊断中具有较高的特异性和敏感性；③免疫浸润分析显示，放射性心脏损伤小鼠存在显著的免疫反应失调现象，CCND1与多种免疫细胞密切相关；④Kaplan-Meier 生存分析显示，CCND1与接受胸部放疗的食管鳞状细胞癌患者的疾病特异性生存率较差相关。该研究首次系统性揭示 CCND1在放射性心脏损伤内皮细胞衰老中的关键作用。CCND1是一种与细胞周期调控密切相关的基因，其异常表达可能引发细胞衰老，具有作为放射性心脏损伤诊断标志物的潜力。

https://orcid.org/0009-0006-6230-276X(赖家铭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 放射性心脏损伤, 细胞衰老, CCND1, 机器学习, 诊断标志物, 免疫浸润, 加权基因共表达网络分析(WGCNA)

Abstract: BACKGROUND: Radiotherapy significantly improves survival rates in patients with various malignant tumors. However, with prolonged post-treatment survival, many patients face the risk of radiation-related cardiac toxicity. This is especially true after chest radiotherapy, where the risk of radiation-induced heart disease significantly increases, becoming one of the most severe complications affecting prognosis survival.
OBJECTIVE: To identify diagnostic markers of endothelial cellular senescence in radiation-induced heart disease through systematic transcriptomic analysis.
METHODS: Firstly, genes associated with cellular senescence were screened from the CellAge database and intersected with the transcriptomic training dataset of a mouse model of radiation-induced heart disease to identify differentially expressed senescence-related genes. Secondly, weighted gene co-expression network analysis and machine learning were used to identify key hub genes that play critical roles in radiation-induced heart disease. The expression of these genes was validated using a dataset of radiation-induced endothelial injury. Additionally, the quanTIseq method was employed to assess the immune infiltration status related to radiation-induced heart disease. The expression levels of key genes and their association with survival in esophageal squamous cell carcinoma patients receiving chest radiotherapy were explored through the analysis of The Cancer Genome Atlas database.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Systematic transcriptomic analysis identified CCND1 as the core gene of endothelial cellular senescence in radiation-induced heart disease, and this finding was validated in the mouse model of radiation-induced heart disease. (2) The diagnostic model constructed from these data indicated that CCND1 had high specificity and sensitivity for diagnosing radiation-induced heart disease. (3) Immune infiltration analysis revealed significant immune response dysregulation in the mouse model of radiation-induced heart disease, and CCND1 was closely related to various immune cells. (4) Kaplan-Meier survival analysis showed that CCND1 was associated with poorer disease-specific survival in esophageal squamous cell carcinoma patients receiving chest radiotherapy. This study systematically uncovers, for the first time, the pivotal role of CCND1 in endothelial cell senescence associated with radiation-induced heart disease. CCND1, a gene integral to cell cycle regulation, can induce cellular senescence when abnormally expressed. Furthermore, the findings highlight its potential as an early diagnostic marker.

Key words: radiation-induced heart disease, cellular senescence, CCND1, machine learning, diagnostic biomarkers, immune infiltration, weighted gene co-expression network analysis (WGCNA)

中图分类号:

赖家铭, 宋玉玲, 陈梓曦, 魏镜桓, 蔡浩, 李国权, . 放射性心脏损伤小鼠内皮细胞衰老的诊断标志物筛选及免疫浸润分析[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1450-1463.

Lai Jiaming, , Song Yuling, Chen Zixi, Wei Jinghuan, Cai Hao, , Li Guoquan, . Screening of diagnostic markers for endothelial cell Senescence in mice with radiation-induced heart disease and analysis of immune infiltration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(6): 1450-1463.

图/表（结果） 11

2.1 实验动物数量分析共有20只小鼠参加实验，采用随机数字表法将小鼠分为对照组和RIHD模型组，每组10只小鼠进行血常规检测，每组随机选择5只小鼠进行血清肌酸激酶同工酶、丙二醛和超氧化物歧化酶水平检测，每组随机选择5只小鼠进行心脏彩超检测。
2.2 RIHD小鼠的心脏病理学、超声心动图特征、血清氧化应激指标分析在小鼠胸部心脏照射后16周，与对照组相比，苏木精-伊红染色显示模型组小鼠心脏结构发生显著变化，表现为心脏组织中空泡数量增加、细胞间隙扩张，Masson染色显示心脏纤维化面积增大(图2A，B)。左心功能评估结果(图2C-E)显示，模型组小鼠左室射血分数和左室缩短分数较对照组显著下降(P < 0.05)。ELISA结果(图2F-H)显示，与对照组相比，模型组小鼠血清肌酸激酶同工酶和丙二醛水平显著升高(P < 0.05)，而超氧化物歧化酶水平显著降低(P < 0.05)。这表明小鼠心脏照射后16周引发了明显的心脏组织结构改变以及氧化应激反应。
2.3 RIHD小鼠差异表达基因的鉴定和富集分析前期发现小鼠接受心脏照射出现了明显结构改变[26]，为了探寻其中关键的调控基因，进行了RIHD小鼠转录组学测序。首先对RIHD小鼠数据集进行了主成分分析，结果表明两组存在明显区分(图3A)，火山图展示721个上调基因和292个下调基因(图3B)，箱式图显示成功消除了批次效应，实现了良好的数据归一化(图3C)。
GO富集分析表明，差异表达基因主要富集在细胞周期、病毒防御反应、干扰素反应、细菌反应、先天免疫反应以及氧化还原酶活性等生物过程中(图3D)。
KEGG通路分析结果(图3E-G)表明，差异表达基因主要参与细胞周期、p53信号通路、细胞衰老、凋亡、肿瘤坏死因子信号通路等，揭示了RIHD的发病机制涉及复杂的调控网络，尤其是细胞衰老和炎症失调。

2.4 衰老相关差异表达基因的鉴定及富集分析 KEGG分析发现细胞衰老相关基因在RIHD中显著富集，1 013个差异表达基因与882个衰老相关基因进行交集分析，共鉴定出79个衰老相关差异表达基因 (图4A)。Spearman相关性分析揭示了衰老相关差异表达基因之间的显著相互关联(图4B)。GO分析显示：衰老相关差异表达基因显著富集于对细胞衰老的调控、对细胞衰老的负调控作用、细胞衰老、细胞周期蛋白结合、对辐射的响应、细胞周期检查点信号等生物过程(图4C)。KEGG分析表明，衰老相关差异表达基因富集于细胞周期、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、FoxO信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路等(图4D)，进一步证明了细胞衰老在RIHD中的重要作用。
2.5 RIHD基因的识别模块通过WGCNA识别出与RIHD显著相关的基因模块。使用样本聚类和临床特征信息建立了无标度网络(图5A)，最终识别出6个基因模块(图5B，C)，并评估了模块与RIHD状态的关系，其中蓝色模块(314个基因，r=0.89，P=0.02)、棕色模块(44个基因，r=-0.96，P=0.002)与RIHD状态显著相关(图5D)。此外，蓝色模块(314个基因，r=0.888 932 794，P=0.017 818 828)、棕色模块(44个基因，r=-0.963 071 066，P=0.002 020 438)与基因重要性极显著相关(图5E，F)。最终，从这2个模块中筛选出358个关键基因进行后续分析。
2.6 机器学习筛选Hub基因并验证近年来，机器学习技术，尤其是随机森林模型[31]，已被广泛应

用于生物标志物的筛选和疾病预后分析。为筛选RIHD的Hub基因，应用随机森林模型对小鼠RNA-Seq训练数据集进行分析。通过变量重要性排序(图6A)与WGCNA结果的交集分析，最终鉴定出CCND1为Hub基因(图6B)。此外，对训练集进行受试者工作特征曲

线测定，CCND1的曲线下面积为1，具有极高的诊断价值且模型组CCND1表达量较对照组上调(P < 0.05) (图6C，D)。在验证数据集GSE202119中，CCND1的表达模式与训练集一致，显著上调(P < 0.05)，曲线下面积为1，进一步证明了CCND1在RIHD中的关键作用(图6E，F)。此外通过小鼠RIHD模型进行验证，模型组CCND1 mRNA表达较对照组显著上调(P < 0.01)(图6G)。进一步分析显示，CCND1与小鼠的左室射血分数(Pearson系数=0.770)、左室缩短分数(Pearson系数=0.789)呈显著正相关(图6H，I)。这表明CCND1可以作为RIHD中内皮细胞衰老的诊断标志物，且与心功能改变相关。
2.7 单基因GSEA分析为进一步了解CCND1相关的生物学功能和信号通路，采用单基因GSEA方法进行GO和KEGG富集分析。图7A，B分别展示了CCND1在GO和KEGG中的主要富集条目。CCND1参与的生物学过程包括细胞衰老、细胞周期G2/M期转变、细胞周期检查点信号传导、先天免疫反应激活信号通

路、免疫反应调节信号通路、外源性凋亡信号通路、CGAS-STING信号通路等。KEGG通路包括p53信号通路、细胞周期通路、内源性凋亡通路、MAPK信号通路等。GSEA结果提示，CCND1可能在调节细胞衰老、细胞存活、免疫浸润和代谢中发挥重要作用。
2.8 免疫细胞浸润与CCND1在RIHD中的关联性分析小鼠血常规显示，与对照组相比，模型组白细胞(P < 0.05)、中性粒细胞(P < 0.01)、单核细胞(P < 0.001)、血小板(P < 0.05)显著升高(图8A-D)，提示心脏放射后炎症细胞升高。在心血管疾病的发生发展中发现有免疫失调现象导致疾病进一步进展[31-33]，基于此，进行免疫浸润quanTIseq分析，结果显示，模型组与对照组在树突细胞、NK细胞、M2巨噬细胞和中性粒细胞的浸润量方面存在显著差异(P < 0.05) (图8E-I)。考虑到放疗引发免疫失调，使用Pearson相关性分析进一步探讨了CCND1与免疫细胞之间的潜在关联，结果显示CCND1与以下免疫细胞均存在显著正相关性：NK细胞(Pearson系数=0.899)、M2巨噬细胞(Pearson系数=0.890)、中性粒细胞(Pearson系数=0.869)(图8J-M)，这进一步说明CCND1可能通过调控免疫炎症反应在RIHD中发挥作用。
2.9 CCND1在食管鳞癌放疗患者中的预后价值 CCND1在泛癌中与患者预后明显相关[34]，为了解CCND1在食管鳞癌患者中的预后价值，尤其是接受胸部放疗后患者。使用TCGA数据库进行分析，结果显示，CCND1高表达组患者在疾病特异性生存期方面预后较差(P=0.018，图9A，B)，并且与放疗后患者的疾病特异性生存期(P=0.042)显著相关(图9C，D)。这些结果表明，CCND1的高表达是胸部放疗后食管鳞癌患者预后的不良预测因子。通过单变量和多变量COX回归模型构建了1，3，5年的预后风险列线图，并绘制了预后校准曲线(图9E)，结果显示，CCND1在食管鳞癌患者的预后评估中具有良好的预测能力。进一步分析表明，CCND1的表达水平与食

管鳞癌患者的肿瘤临床分期(TNM分期)及是否接受放疗密切相关(图9F)。具体而言，CCND1高表达是接受放疗的食管癌患者疾病特异性生存期的主要不良预后因子[35]。

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引言

胸部肿瘤患者在接受放疗后，罹患心血管疾病的风险显著增加，放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease，RIHD)已成为影响肿瘤患者远期生存的严重并发症之一[1-2]。尽管近年来通过优化放射剂量和靶区分布减少对心脏等器官的损伤，但放疗仍对患者的心血管预后产生显著影响[3-4]。研究表明，冠状动脉事件的发生率与心脏平均辐射剂量呈显著线性关系，每增加1 Gy辐射剂量，相关风险增加7.4%[5]。RIHD一旦发生便不可逆，因此，如何有效诊断和识别放疗后心血管事件的发生，已成为临床治疗中的迫切需求。
研究发现，放射引发的内皮细胞衰老是RIHD发生的重要机制之一[1，6]。尽管内皮细胞对放射诱导的凋亡具有一定抵抗力，但当辐射剂量达到中等至高水平(0.5-10 Gy)时，细胞更容易进入衰老状态或永久性细胞周期停滞[7-8]。内皮细胞衰老后失去再生能力，难以有效维持血管系统的稳态，这种现象可能导致心脏毛细血管和小冠状动脉密度显著降低，进而加剧大血管的动脉粥样硬化[9-10]。此外，衰老的内皮细胞通过衰老相关分泌表型释放促炎因子，加剧氧化应激反应，抑制内皮祖细胞的血管生成能力，这一机制会导致活性氧的过度生成，并降低一氧化氮的生物利用度，直接损害血管功能，成为高血压和其他心血管疾病的诱因[11]。内皮细胞衰老是RIHD的关键机制之一，然而近年来的研究逐渐揭示免疫系统在此过程中发挥的关键作用，免疫细胞的激活，尤其是炎症性免疫反应和巨噬细胞的参与，可能加剧内皮细胞衰老并加速动脉粥样硬化的进程[12-14]。这一研究领域突出表明内皮细胞衰老与免疫系统之间的相互作用对RIHD的临床结局具有重要影响。目前，对于RIHD的管理主要依赖药物干预、手术及介入性治疗。尽管研究仍在继续，某些治疗在特定情况下是有效的，但在疗效和患者耐受性方面仍存在诸多限制[15-18]，而且目前缺乏早期和特异的分子标志物，这限制了临床干预的时效性。因此，亟需开发更早期、更有效的识别和管理策略，发掘与RIHD相关并调控内皮细胞衰老及免疫浸润的诊断标志物成为当前的研究重点。
近年来，基于数据驱动的机器学习模型在心血管领域取得了显著进展，尤其在早期诊断和心血管风险评估方面[19]。机器学习模型通过分析大规模基因表达数据，不仅能够识别关键的风险因素，还为临床医生提供了科学依据，以支持疾病的早期干
预[20]。虽然冠状动脉疾病的诊断已有大量研究[21]，但在RIHD领域，机器学习的应用主要集中于放疗靶区的规划和心脏剂量控制[20-22]。近年来，基于机器学习的算法在生物标志物筛选中展现出巨大潜力，但其在RIHD中的具体应用尚未见报道。此外，关于如何结合生物信息学工具揭示RIHD的分子机制也鲜有系统性研究。
该研究整合多个转录组学数据集，系统构建了RIHD内皮细胞衰老相关的分子交互网络，此外还提出了一种基于机器学习的RIHD诊断模型[23-24]，研究结果揭示了RIHD的分子机制，为临床医生提供了一种新的诊断标志物，以识别心血管高危患者，并为制定个体化治疗方案提供了科学依据[25]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计通过转录组学分析小鼠RIHD的具体调控机制，使用动物实验进行验证，筛选RIHD的诊断标志物。
1.2 时间及地点实验于2023年9月至2024年9月在青海大学医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠20只，体质量(18±2) g，购自北京维通利华有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006，饲养于青海大学医学院，实验动物使用许可证编号为SYXK (青)2021-0002。实验环境温度严格控制在24 ℃，湿度维持在50%-60%，实验室设定了12 h光照与黑暗交替周期，小鼠在此期间可自由进食和饮水。所有动物实验严格遵循《实验动物护理和使用指南》进行，且获得青海省第五人民医院动物伦理委员会的批准，编号为LWP-202303。
1.3.2 实验试剂肌酸激酶同工酶、丙二醛和超氧化物歧化酶ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特公司；三溴乙醇购自大连美仑生物技术有限公司；异氟烷购自欧博方医药科技有限公司；苏木精-伊红高清恒染试剂盒、苏木精-伊红分化液、反蓝液及Masson三色染色液购自武汉塞维尔公司。
1.3.3 实验仪器直线加速器(瑞典，医科达 Infinity)；光学显微镜(德国，蔡司)；全自动血液细胞分析仪(中国深圳，迈瑞 BC-5000 Vet)；多功能酶标仪(瑞士，Infinite F200 Pro)；超高分辨率小动物超声成像系统(加拿大，Vevo 3100LT)。
1.4 实验方法
1.4.1 构建RIHD动物模型 20只小鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法将小鼠随机分为对照组和RIHD模型组，每组10只。造模方法：模型组小鼠腹腔注射1.25%三溴乙醇，注射剂量为0.02 mL/g，充分麻醉后固定于实验台上，观察心尖搏动最明显的位置，并在CT模拟机下进行定位。照射条件：使用直线加速器6 MV X射线照射心前区，使用铅板保护周围未照射部位。心前区剂量率设定为300 MU/min，射野大小为1 cm×1 cm，照射深度为1 cm，使用单射野方式单次照射心脏20 Gy，照射后将小鼠置于温暖、干燥的环境中，等待自然苏醒[26]。对照组不予照射。
1.4.2 取材照射后饲养16周，小鼠吸入异氟烷麻醉后取样。首先进行眼眶取血，取0.2 mL血液置于EDTA抗凝管中进行血常规检测，其余血液于室温放置1 h，1 000×g离心20 min取上清，将血清分装后放入液氮急冻，置于-80 ℃冰箱保存。然后打开小鼠胸腔，完整取出心脏，使用生理盐水仔细清洗，去除血液，一部分立即放入固定液中，另一部分放入液氮急冻后，置于-80 ℃冰箱保存。
1.4.3 小鼠超声心动图测定取样前每组随机选取5只小鼠进行心脏超声心动图检查。使用Vevo 3100成像系统测定小鼠心功能。为了获得准确的心功能参数，检测前去除小鼠胸部的毛发，使用2%异氟烷和空气混合气体吸入麻醉，防止小鼠在检测过程中移动。小鼠仰卧固定于生理监测平台上，眼睛涂抹润滑剂，以防干燥，使用20 MHz超声探头检测心功能相关指标，包括左室射血分数和左室缩短分数。
1.4.4 小鼠心脏病理学观察心脏组织浸泡在40 g/L多聚甲醛中固定48 h后，经梯度脱水后进行包埋，使用切片机将组织蜡块切为6 μm切片。切片经脱蜡和复水处理后，分别进行苏木精-伊红染色及Masson染色，显微镜下观察心脏组织的病理变化。
1.4.5 血清肌酸激酶同工酶、丙二醛、超氧化物歧化酶活性测定按照武汉伊莱瑞特公司提供的肌酸激酶同工酶、丙二醛和超氧化物歧化酶ELISA试剂盒说明书进行实验，测定血清中肌酸激酶同工酶活性、丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性。
1.4.6 血常规分析使用全自动血液细胞分析仪检测白细胞数、血小板数及中性粒细胞数等指标。

1.4.7 RNA提取及实时定量聚合酶链式反应按试剂说明书使用TRIzol试剂(15596018CN，Invitrogen)提取心脏总RNA，提取的RNA经反转录为cDNA (KR118，天根)，然后使用SYBR Green(FP217，天根)进行定量PCR分析，以GAPDH作为内参基因。表1为设计和合成的引物序列(生工，上海)。

1.4.8 RIHD小鼠RNA测序中差异表达基因的鉴定及相关富集分析每组随机选择3份心脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)评估RNA纯度和定量，使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)评估RNA完整性。根据制造商的说明，使用BGISEQ-500RS High-throughput Sequencing Set [stLFR](BGI，深圳，中国)构建测序文库。其中，采样、质量控制、文库构建和测序分析等技术流程均由中国上海OE Biotech Co., Ltd.基因组平台提供支持。差异表达基因的筛选标准为P < 0.05和|log2(fold-change)| ≥ 0.58。差异基因的可视化通过R包“ggplot2”生成火山图。使用R包“cluster Profiler”对差异表达基因进行基因本体论 (gene ontology，GO)及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路的富集分析[27]。对单基因进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，具体步骤如下：首先，计算诊断基因与其他基因的相关性；然后，对所有基因按相关性降序排列，使用clusterProfiler 包中的gseGO和gseKEGG函数进行基因集富集分析。
1.4.9 数据的获取放射性内皮损伤相关数据集来源于NCBI GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，通过关键词 “radiation endothelial”进行检索。数据集限制为内皮细胞的转录组数据，最终筛选出GSE202119数据集。该数据集由GPL24676平台生成，包含10 Gy X 射线处理72 h后的人源主动脉内皮细胞样本(n=3)及相应对照组样本(n=3)。从CellAge数据库中筛选出与细胞衰老相关基因，将差异表达基因与细胞衰老相关基因取交集，生成衰老相关差异表达基因，将RIHD小鼠测序数据集作为训练集，GSE202119数据集作为验证集。
实验分析流程见图 1。

1.4.10 机器学习使用衰老相关差异表达基因进行机器学习分析。使用R包“Random Forest”进行随机森林(random forest，RF)分析[28]，通过OOB误差评估模型性能，计算Mean Decrease Gini值以评估变

量的重要性。使用R包“glm”对衰老相关差异表达基因中的枢纽(Hub)基因进行逻辑回归分析，并通过受试者工作特征曲线评估诊断性能。

1.4.11 加权基因共表达网络分析(WGCNA) 使用R包“WGCNA”构建基因共表达网络[29]，首先过滤表达量变化波动较低(标准偏差≤0.4)的基因。使用pickSoftThreshold函数，以拟合指数> 0.80为标准选择软阈值功率(β)。使用adjacency函数计算邻接矩阵，再使用TOMsimilarity函数转换为拓扑重叠矩阵。通过无监督聚类方法识别6个基因模块。同时，通过热图展示模块特征基因与RIHD的关联。
1.4.12 免疫浸润分析使用quanTIseq免疫浸润算法评估RIHD小鼠数据中免疫细胞的浸润情况[30]，并通过t检验比较各组间差异。使用R包ggplot2绘制热图，采用Pearson相关分析确定Hub基因与免疫细胞的相关性。
1.4.13 生存分析使用R包“survival”进行生存分析，采用log-rank检验评估TCGA数据库中食管鳞癌患者的总生存期和疾病特异性生存期。
1.5 主要观察指标 ①各组小鼠血清肌酸激酶同工酶、丙二醛和超氧化物歧化酶表达水平；②各组小鼠心脏彩超左室射血分数和左室缩短分数；③各组小鼠心脏组织病理切片苏木精-伊红染色、Masson染色结果；④各组小鼠心脏组织转录组测序结果，通过RT-qPCR验证CCND1基因表达。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示，使用GraphPad Prism 10.1.2进行统计分析。正态性检验采用Shapiro-Wilk法。当数据符合正态分布时，采用t检验比较两组间差异。采用Pearson或Spearman相关性检验分析变量之间的相关性。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经青海大学统计学专家审核。

讨论

RIHD是一种常见且严重的并发症，通常在胸部肿瘤放疗后出现。它不仅影响患者的生活质量，还显著增加心血管疾病的风险，给患者和家属带来心理和经济负担[36]。由于RIHD的早期症状通常不明显，这使得早期诊断和临床决策变得更加困难[37]。该研究通过转录组分析鉴定了RIHD内皮细胞衰老与免疫浸润的关键基因CCND1，并在小鼠RIHD模型中进行了验证。
CCND1是细胞周期调控的重要因子，驱动增殖细胞从G1期向S期转变[38]。有趣的是，衰老细胞通常表现出异常升高的CCND1水平[39-42]。这一现象可能通过MEK/ERK途径特异性地激活mTOR，进而导致CCND1升高[39]，CCND1的过度表达可能扰乱正常的细胞周期调控，进而导致血管平滑肌细胞的过早衰老[40]，最终引发心肌功能障碍，并可能导致心力衰竭[43]。在正常情况下，内皮细胞通过精确调控细胞周期维持正常功能。然而，在衰老过程中，CCND1的过度表达破坏了这一平衡，导致细胞周期异常，促使内皮细胞进入衰老状态。衰老细胞通常表现为细胞周期停滞、增殖能力丧失、表型改变，并分泌衰老相关分泌表型。研究表明，在衰老的内皮细胞中，可能通过激活CCND1/P53/P21信号通路增强衰老相关的细胞周期停滞[41，44-45]；此外，长期辐射可导致CCND1过度表达[42]。该研究发现，在RIHD模型中CCND1表达显著上调，并且其表达水平与左室射血分数和左室缩短分数呈正相关，这一结果提示CCND1不仅可能在RIHD的早期损伤中发挥作用，还可能成为心功能障碍的预警标志。研究表明，CCND1过表达与缺氧诱导的心肌损伤[46]、血管平滑肌细胞的衰老、增殖和迁移密切相关，从而引发动脉粥样硬化及再狭窄等病理过程[47-48]。该研究进一步证实了CCND1在通过内皮细胞衰老促进心血管疾病进展中的重要作用。
在RIHD小鼠模型中，白细胞及中性粒细胞数量显著升高。免疫细胞浸润在RIHD的进程中发挥着关键作用[49]，研究表明CCND1的表达水平与NK细胞、中性粒细胞及M2型巨噬细胞的浸润呈正相关，提示CCND1可能通过调控局部炎症反应参与RIHD的发病机制。中性粒细胞及M2型巨噬细胞的异常浸润可能与内皮细胞损伤及病理进展密切相关，尤其是中性粒细胞的浸润可能加剧局部炎症反应，从而促进心血管并发症的发生[50-51]，CCND1的过度表达可促使内皮细胞衰老并释放衰老相关分泌表型，这些分子包括白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α等，具有明显的促炎作用[40，52-53]。这些衰老相关分泌表型分子不仅促进局部炎症反应，还能招募免疫细胞进入受损区域，进一步加剧免疫细胞的浸润。该研究结果表明，CCND1的表达水平与NK细胞、中性粒细胞及M2型巨噬细胞的浸润呈正相关。中性粒细胞的浸润尤其可能通过释放白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等细胞因子加剧局部炎症反应，从而促进血管平滑肌细胞的衰老和血管重构[54]。M2型巨噬细胞则可能通过分泌抗炎细胞因子(如白细胞介素10)促进局部免疫耐受，帮助衰老的内皮细胞修复或清除[55-56]。衰老的内皮细胞通过释放衰老相关分泌表型吸引免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞)进入受损区域，从而促进局部炎症反应并加剧心血管损伤，炎症通路通过调节免疫细胞的浸润，加剧局部炎症反应，促进血管重构，最终导致血管损伤和功能障碍。
通过Kaplan-Meier生存分析，发现CCND1的高表达与经过胸部放疗的食管鳞癌患者较差的疾病特异性生存期显著相关，这一发现与CCND1作为多种肿瘤预后标志物的已有研究结果一致[57]。此外，受试者工作特征曲线分析表明，CCND1具有良好的诊断价值，进一步凸显它作为诊断标志物的潜力。通过监测CCND1的表达水平，临床医生可以在早期识别高风险患者，进而提供个性化干预，减少心血管并发症的发生。
过去的研究者们通过不同的生物过程筛选出有效的RIHD生物标志物，以实现早期诊断和预测。例如，WANG等[58]通过检测心脏损伤生物标志物(脑钠肽、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白)的动态变化，以及它们与心脏放射剂量的关系，来预测RIHD的发生。UNGER等[59]采用RIHD小鼠血浆进行代谢组学与脂质组学联合分析，并结合经胸部放疗的食管癌患者血浆进行代谢组学分析，以预测潜在的生物标志物。AZIMZADEH等[60]则通过局部心脏照射20周后的C57BL/6J小鼠进行蛋白质组学分析，发现促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、白细胞介素1、白细胞介素6)表达显著增强，照射后游离脂肪酸、总胆固醇、低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白水平升高。然而，这些研究大多侧重于预测，未能系统验证Hub基因的诊断性能，也缺乏进一步的机制证据。相比之下，该研究强调了RIHD与内皮细胞衰老的关联，并通过生物信息学分析和小鼠模型实验验证了CCND1在RIHD中的作用。
建立的RIHD小鼠模型为CCND1表达与心脏功能障碍之间的关联提供了重要证据。胸部放射使得小鼠心脏中的CCND1表达显著增加，同时与左室射血分数和左室缩短分数的下降显著相关，这表明CCND1可能作为RIHD的生物标志物，这些发现与先前的研究一致[61]。通过监测CCND1水平，临床医生可以识别放疗后心脏并发症高风险患者，从而促进个性化治疗并改善预后[62]。此外，超声心动图评估显示，辐射小鼠的心脏发生了明显的结构改变，如左心室增大和心肌间质纤维化加重，这些变化凸显了放疗对心脏结构和功能的长期影响，因此对接受放疗的患者进行常规心脏监测是必要的。心脏结构变化提示心脏重塑可能导致心力衰竭及其他心血管并发症。研究结果强调了开发可随时间变化的生物标志物的重要性，以制定早期干预策略，减缓RIHD的进展。未来的研究应关注放射导致心脏结构变化的机制，以及这些变化与患者功能预后的关系，特别是在癌症治疗期间如何保护心脏的新方法。
虽然该研究为RIHD与细胞衰老之间的关系及其分子机制提供了新证据，但仍然存在一些局限性。首先，该研究主要依赖公开数据库，缺乏详细的患者临床数据支持。未来研究应结合多中心临床样本来验证CCND1的诊断价值，以及CCND1在个性化治疗和RIHD管理中的潜在应用。虽然在小鼠模型中验证了CCND1的表达，但具体的分子机制仍需进一步探索，尤其是为抗衰老治疗方案提供新靶点。未来的研究应结合新兴的心脏保护策略，例如：针对CCND1的分子靶向治疗或放射保护剂开发。
该研究通过深入探讨CCND1在RIHD中的角色，拓展了对心脏损伤机制的理解，并为早期诊断和个性化治疗提供了新的思路。CCND1作为生物标志物在临床应用中的潜力，不仅可帮助医生早期识别RIHD高风险患者，也为未来的治疗方案提供了新的靶点。通过跨学科的整合与探索，未来的研究有望进一步揭示RIHD的机制，推动抗衰老治疗的创新，并改善癌症患者的长期健康预后。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

放射性心脏损伤小鼠内皮细胞衰老的诊断标志物筛选及免疫浸润分析

Screening of diagnostic markers for endothelial cell Senescence in mice with radiation-induced heart disease and analysis of immune infiltration

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