.1 设计 细胞学实验,动物实验。研究方案设计见图1。
1.2 时间及地点 实验于2023年5月至2025年1月在中国人民解放军北部战区总医院中心实验室、动物实验中心室完成。
1.3 材料
1.3.1 材料、试剂与仪器 新型国产聚乙醇酸神经导管(由北京华融科创生物科技有限公司提供,规格2.3 mm×40 mm);Neurotube®(Synovis Micro Companies Alliance,Inc.,美国,规格2.3 mm×40 mm);人成纤维细胞(上海康朗生物科技有限公司,上海);原代成纤维细胞培养基(工业微生物菌种工程技术研究中心,河南);戊巴比妥钠(北部战区总医院动物实验中心提供);CCK-8试剂(北京兰杰柯科技有限公司);苏木精-伊红染液(索莱宝科技有限公司,北京);pH计pHS-3E(上海仪电科学仪器公司,上海);光学解剖显微镜 (Leica,德国);酶联免疫分析仪BK-EL10C(Thermo Fisher Scientific,芬兰);正置光学显微镜(Nikon,日本)。
1.3.2 实验动物 健康成年雄性SD大鼠60只,SPF级,8周龄,体质量约290 g,购自辽宁长生生物技术有限公司,合格证号:SCXK(辽)2020-0001。实验方案经中国人民解放军北部战区总医院伦理委员会审查并批准[批准号:研伦审第(2020)9号]。
1.4 实验方法
1.4.1 体外降解实验 取9支试管,并准备6份裁剪好的新型国产聚乙醇酸神经导管(10 mm长)。空白对照组(n=3)每支试管内加入15 mL PBS;换液组(n=3)每支试管内加入15 mL PBS溶液和1份神经导管,每3 d更换一次PBS;不换液组(n=3)每支试管内加入1份神经导管和15 mL PBS,实验全过程不更换液体。将3组试管置于37 ℃恒温箱内20周,每周用电子pH计测量每支试管内液体的pH值,计算平均值。
1.4.2 材料浸提液的制备 将新型国产聚乙醇酸神经导管材料灭菌处理后,按0.14 g/mL的比例浸入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的人成纤维细胞培养基中,置于37 ℃、体积分数5%CO2环境条件下浸提72 h,收集新型国产聚乙醇酸神经导管浸提液。
1.4.3 细胞实验
实验分组:对照组使用人成纤维细胞培养基培养人成纤维细胞,实验组使用新型国产聚乙醇酸神经导管浸提液培养人成纤维细胞,置于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中。
人成纤维细胞形态观察:培养6 d后,通过显微镜观察两组细胞生长状态。
CCK-8实验:培养7 d,将两组人成纤维细胞分别接种于96孔板中,细胞密度为5×103/孔,培养0,24,48,72 h,每孔避光条件下加入10 µL CCK-8试剂,放入细胞培养箱内继续孵育
4 h,取出96孔板,采用酶联免疫分析仪检测各孔450 nm波长处的吸光度值。每组每个时间点设置3个复孔。
Transwell实验:待两组人成纤维细胞处于对数生长期时,将两组细胞分别接种至Transwell小室上室中,细胞浓度为5×107 L-1,体积200 µL;在Transwell小室下室添加600 µL含体积分数10%胎牛血清的培养基,将Transwell板放入孵箱中孵育24 h;移出Transwell小室,结晶紫染色,用棉签蘸去多余的结晶紫染液,通过显微镜选取3个视野拍照,使用Image J软件计数细胞迁移数量。
划痕实验:待两组人成纤维细胞生长融合达到80%-90%时分别接种于6孔板内,细胞密度为2×104/孔,将细胞孔板置入细胞培养箱内,等待8 h细胞贴壁后,用100 µL枪头在6孔板内表面进行划线,无菌PBS冲洗,每孔加入无血清培养基培养,分别在0,12,24,48 h在显微镜下观察,随机取3个视野进行拍照。通过Image J 软件分析每个时间点两组的划痕面积,计算迁移率。
迁移率=(0 h划痕面积-观察时间点划痕面积)/0 h划痕面积×100%
1.4.4 动物实验
大鼠体内神经导管埋植手术:将60只SD大鼠进行人工饲养14 d,确保其适应环境良好且无手术禁忌证。将大鼠随机分为对照组(n=30)和实验组(n=30)。裁剪10 mm长的Neurotube®和新型国产聚乙醇酸神经导管各30支并称质量。腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,手术操作在无菌条件下进行,切开右侧股二头肌后侧皮肤后逐层解剖,对照组在股二头肌与臀大肌之间植入一支Neurotube®,实验组在股二头肌与臀大肌之间植入一支新型国产聚乙醇酸神经导管,缝合创口。
神经导管的降解性、组织学与主要脏器组织学观察:术后第2,4,8,12,20周,每个时间点每组随机取6只大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死,取出埋植的神经导管进行大体观察并称质量,计算降解率。取出大鼠的肝脏、肾脏与神经导管周围部分组织进行苏木精-伊红染色,在显微镜下观察组织形态。
降解率=(0周神经导管质量-观察时间点神经导管质量)/0周神经导管质量×100%
神经导管周围组织Masson染色:术后第20周,获取神经导管周围组织制成标本后进行Masson染色,在显微镜下观察两组组织肌纤维形态和组织纤维化程度。
1.5 主要观察指标 新型国产聚乙醇酸神经导管的降解特性与生物毒性。
1.6 统计学分析 采用SPSS 26软件对实验数据进行分析,所有计量资料采用x±s形式表示,采用两独立样本t检验,以α=0.05为检验水准,P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经中国医科大学生物统计学专家审核。