激素性股骨头坏死衰老关键基因的生物信息学鉴定和验证

doi:10.12307/2025.787

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5608-5620.doi: 10.12307/2025.787

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激素性股骨头坏死衰老关键基因的生物信息学鉴定和验证

丘博元1，2，刘飞1，童思文1，欧志学2，王伟伟1

1广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530000；2桂林市中医医院关节与运动医学科，广西壮族自治区桂林市 541000

收稿日期:2024-10-11 接受日期:2024-11-12 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-25
通讯作者: 欧志学，主任医师，博士，教授，桂林市中医医院关节与运动医学科，广西壮族自治区桂林市 541000 并列通讯作者：王伟伟，医师，广西中医药大学在读博士，广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:丘博元，男，1998年生，广西壮族自治区玉林市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨关节退变与缺血性疾病的中医防治研究。
基金资助:
广西中医药大学研究生教育创新计划项目(YCSY2023067)，项目负责人：丘博元；广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026412)，项目负责人：欧志学；广西壮族自治区中医药管理局自筹经费科研课题(GXZYZ20210372)，项目负责人：欧志学

Bioinformatics identification and validation of aging key genes in hormonal osteonecrosis of the femoral head

Qiu Boyuan1, 2, Liu Fei1, Tong Siwen1, Ou Zhixue2, Wang Weiwei1

1Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Joint and Sports Medicine, Guilin Traditional Chinese Medicine Hospital, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-10-11 Accepted:2024-11-12 Online:2025-09-18 Published:2025-02-25
Contact: Ou Zhixue, Chief physician, MD, Professor, Department of Joint and Sports Medicine, Guilin Traditional Chinese Medicine Hospital, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Co-corresponding author: Wang Weiwei, Physician, PhD candidate, Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Qiu Boyuan, Master candidate, Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Department of Joint and Sports Medicine, Guilin Traditional Chinese Medicine Hospital, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Guangxi University of Chinese Medicine Graduate Education Innovation Program, No. YCSY2023067 (to QBY); Guangxi Natural Science Foundation Project, No. 2023GXNSFAA026412 (to OZX); Guangxi Zhuang Autonomous Region Traditional Chinese Medicine Administration Self-Financing Scientific Research Project, No. GXZYZ20210372 (to OZX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
激素性股骨头坏死：是一种因长期或大量使用皮质醇类药物导致股骨头血供中断而坏死的严重慢性疾病。
衰老：是指细胞及器官的逐渐退化并伴随相关功能的下降，与大多数慢性疾病关系密切。

背景：激素性股骨头坏死与衰老紧密相连，但调控靶点和机制尚不明确。通过生物信息学联合机器学习分析并加以实验验证，确定细胞衰老介导激素性股骨头坏死发生发展的关键基因，将为激素性股骨头坏死的防治提供新思路。
目的：使用生物信息学分析筛选激素性股骨头坏死的衰老核心基因并进行实验验证，以探讨其作用机制。
方法：从GEO数据库的GPL15207平台获取了GSE123568 数据集，其中包含了30例激素性股骨头坏死患者与10名健康对照的外周血清样本基因表达谱；从CellAge数据库获取了279个细胞衰老相关基因的数据。对激素性股骨头坏死基因谱进行差异分析及加权基因共表达网络(WGCNA)分析，两者与衰老相关基因取交集再取并集得到激素性股骨头坏死衰老潜在基因，并进行GO和KEGG富集分析。机器学习方法筛出枢纽基因，构建Nomogram模型，进行共识聚类及免疫浸润分析。最后收集临床股骨头样本通过qPCR及Western blot检测方法进行验证。
结果与结论：①共获得41个潜在基因，主要富集在衰老及氧化应激反应等生物过程，以及FoxO及肿瘤坏死因子信号通路中。②机器学习鉴定后得到枢纽基因过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3、胰岛素受体底物2和丝裂原活化蛋白激酶激酶11，Nomogram模型预测能力良好。③共识聚类分析将患者分为a，b和c共3组，过氧化氢酶、叉头框蛋白O3、胰岛素受体底物2和丝裂原活化蛋白激酶激酶11在3个分子亚型之间表达存在差异(P < 0.05)，免疫浸润结果显示活化CD4+ T细胞、活化CD8+ T细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞的丰度在3个分子亚类中存在差异(P < 0.05)。④qPCR和Western blot结果显示，激素性股骨头坏死组过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3和丝裂原活化蛋白激酶激酶11比对照组表达降低(P < 0.05)，胰岛素受体底物2的表达升高(P < 0.05)。⑤上述结果证实，通过结合生物信息学与机器学习深入分析，并进一步实验验证，最终确定了5个激素性股骨头坏死衰老相关枢纽基因，分别是过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3、胰岛素受体底物2及丝裂原活化蛋白激酶激酶11，这些基因可能通过调控细胞衰老过程为未来激素性股骨头坏死的预防和治疗提供潜在的分子靶点。
https://orcid.org/0009-0003-9712-5431(丘博元)；https://orcid.org/0000-0002-0595-6154(欧志学)；https://orcid.org/0000-0003-0841-0496(王伟伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 衰老, WGCNA分析, 机器学习, 免疫浸润分析, 实验验证

Abstract: BACKGROUND: Hormonal osteonecrosis of the femoral head is strongly associated with aging, but the regulatory targets and mechanisms are still unclear. Through bioinformatics combined with machine learning analysis and experimental verification, the key genes of hormonal osteonecrosis of the femoral head mediated by cell senescence will be identified, which will provide new ideas for the prevention and treatment of hormonal osteonecrosis of the femoral head.
OBJECTIVE: To screen and validate the senescence core genes of hormonal osteonecrosis of the femoral head using bioinformatics analysis to explore its mechanism of action.
METHODS: The GSE123568 dataset was obtained from the GPL15207 platform of the GEO database, which contained the gene expression profiles of peripheral serum samples of 30 hormonal osteonecrosis of the femoral head patients and 10 healthy controls. Data on 279 cellular senescence-related genes were obtained from the CellAge database. Differential analysis and weighted correlation network analysis (WGCNA) were performed on hormonal osteonecrosis of the femoral head gene profiles, and both were intersected with senescence-related genes and then concatenated to obtain hormonal osteonecrosis of the femoral head senescence potential genes, and GO and KEGG analyses were performed. The machine learning method screened out the pivotal genes, constructed nomogram model, and performed consensus clustering and immune infiltration analysis. Finally, clinical femoral samples were collected for validation by qPCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 41 potential genes were obtained, which were mainly enriched in biological processes such as aging and oxidative stress response, as well as FoxO and tumor necrosis factor signaling pathways. (2) The pivotal genes catalase, connective tissue growth factor, forkhead box protein O3, insulin receptor substrate 2, and mitogen-activated protein kinase kinase 11 were obtained after machine learning identification, and the predictive ability of nomogram model was good. (3) The patients were classified into three groups, namely a, b and c, by the consensus clustering analysis. Catalase, forkhead box protein O3, insulin receptor substrate 2, and mitogen-activated protein kinase kinase 11 were differentially expressed among the three molecular subtypes (P < 0.05). Results of immune infiltration showed that the abundance of immune cells, such as activated CD4+ T cells, activated CD8+ T cells, and eosinophils, differed among the three molecular subclasses (P < 0.05). (4) The results of qPCR and western blot assay showed that the expression of catalase, connective tissue growth factor, forkhead box protein O3, and mitogen-activated protein kinase kinase 11 was lower in hormonal osteonecrosis of the femoral head group compared to the control group (P < 0.05), and the expression of insulin receptor substrate 2 was elevated (P < 0.05). (5) It is concluded that through in-depth analysis combined with bioinformatics and machine learning, and further experimental verification, five hormonal osteonecrosis of the femoral head age-related hub genes were finally identified. These genes are catalase, connective tissue growth factor, forkhead box o3, insulin receptor substrate 2, and serine/threonine kinase 11. These genes may provide potential molecular targets for the prevention and treatment of hormonal osteonecrosis of the femoral head in the future by regulating the cellular aging process.

Key words: hormonal osteonecrosis of the femoral head, aging, WGCNA analysis, machine learning, immune infiltration analysis, experimental validation

中图分类号:

丘博元, 刘飞, 童思文, 欧志学, 王伟伟. 激素性股骨头坏死衰老关键基因的生物信息学鉴定和验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5608-5620.

Qiu Boyuan, Liu Fei, Tong Siwen, Ou Zhixue, Wang Weiwei. Bioinformatics identification and validation of aging key genes in hormonal osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5608-5620.

图/表（结果） 10

2.1 激素性股骨头坏死衰老基因的差异分析使用 “limma “R软件包和|logFC|> 0.8和Padj < 0.05的筛选标准鉴定了858个DEGs，其中432个基因在激素性股骨头坏死中上调，426个基因下调。使用热图和火山图描述了差异特征，见图2A，B。图2C显示了激素性股骨头坏死差异基因与衰老相关基因集之间的交集情况。这些交集产生了21个DEG-衰老基因。
2.2 WGCNA分析和激素性股骨头坏死潜在衰老基因的鉴定使用“WGCNA”R包将前25%基因的表达方差作为筛选条件，剔除波动性较低的基因，并使用4 708个基因构建了共表达网络。选取18作为最佳软阈值(R2=0.9)来构建无标度网络，见图3A。随后，利用聚类分析确定高度相似的模块，最小模块大小设为100个基因。利用动态杂交剪切获得了3个基因模块，其中一个蓝色模块(881个基因)与激素性股骨头坏死的相关性(cor)最高(cor=0.72；P < 0.001)，见图3B。此外，在蓝色模块中，GS和MM之间也有很强的相关性(cor=0.73；P < 0.001)，见图3D。将蓝色模块中的881个基因与衰老相关基因集取交集，得到了31个WGCNA-衰老基因，见图3E。将DEGs-衰老基因和WGCNA-衰老基因进行取并集，发现了41个激素性股骨头坏死潜在衰老基因，见图3F。GO和KEGG富集分析弦图见图3G，结果表明激素性股骨头坏死潜在衰老基因主要富集在衰老、氧化应激反应、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、转录调节复合物、DNA结合转录因子结合、抗氧化活性、FOXO信号通路及肿瘤坏死因子信号通路等方面。具体见表3，4。
2.3 激素性股骨头坏死衰老枢纽基因的鉴定结果为了进一步明确激素性股骨头坏死衰老枢纽基因，此研究使用了LASSO和SVM-RFE两种机器学习算法来进行鉴定，见图4A-D。结合两种算法的结果(交集)，共得到了5个激素性股骨头坏死衰老枢纽基因，它们分别是过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3、胰岛素受体底物2和丝裂原活化蛋白激酶激酶11，见图4E。其中，Student’s t检验结果显示，过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3 和丝裂原活化蛋白激酶激酶11 在激素性股骨头坏死中低表达，而胰岛素受体底物2在激素性股骨头坏死中高表达，见图4F。
2.4 激素性股骨头坏死衰老枢纽基因风险预测模型的构建此研究根据激素性股骨头坏死衰老枢纽基因的表达建立了一个激素性股骨头坏死诊断nomogram图，以获得一个更适用于临床的激素性股骨头坏死诊断模型，见图5A。通过构建该模型的临床决策曲线和临床校准曲线，明显可见该模型对激素性股骨头坏死具有较高的预测能力，见图5B，C。
2.5 不同分子亚型之间的差异分析和免疫浸润分析结果累积分布函数(Cumulative Distribution Function，CDF)图显示当k=3时波动较小，共识矩阵的热图显示了清晰明确的边界，见图6A，B。PCA图显示，a，b和c 组显著区分

开来，见图6C。综合上述结果，确定k=3为最佳聚类数目。基因表达箱图和基因表达热图显示，激素性股骨头坏死衰老中枢基因的表达在3个亚类之间存在显著性差异，见图6D，E。ssGSEA 免疫渗透分析表明，活化CD4+ T细胞、活化CD8+ T细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、未成熟树突状细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、滤泡辅助T

细胞、Th17细胞及Th2细胞的丰度在3个分子亚类中有显著差异，见图 6F。图6G显示了5个激素性股骨头坏死衰老中枢基因与 23个免疫细胞之间的相关性。
2.6 枢纽基因的实验验证结果通过生物信息数据分析明确了激素性股骨头坏死衰老枢纽基因(过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3、胰岛素受体底物2和丝裂原活化蛋白激酶激酶11)，并基于Nomogram模型，验证了衰老枢纽基因对激素性股骨头坏死诊断的预测能力。为了进一步验证上述结果，使用股骨头临床样本进行实验验证。其中股骨颈骨折需进行人工全髋关节置换患者的股骨头作为对照组，激素性股骨头坏死需进行人工全髋关节置换患者的股骨头作为激素性股骨头坏死组，见图7A。
对两组共16个样本提取RNA进行qPCR检测，每组分别随机挑选3个样本并提取蛋白进行Western blot验证。qPCR的结果显示，与对照组相比衰老枢纽基因过氧化氢酶(P < 0.01)、结缔组织生长因子(P < 0.01)、叉头框蛋白O3(P < 0.01)和丝裂原活化蛋白激酶激酶11(P < 0.01)

表达降低，胰岛素受体底物2(P < 0.05)的表达升高，见图7B。Western blot结果显示，在对照组中过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3和丝裂原活化蛋白激酶激酶11表达高，胰岛素受体底物2表达低，见图7C，这与qPCR检测结果一致，也与之前分析和预测结果大致相符。这些结果初步验证了此研究预测模型的稳定性，为激素性股骨头坏死的早期诊断和治疗提供了新的方向。

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引言

随着糖皮质激素在临床实践中的广泛应用，激素性股骨头坏死的发病率逐年增加，成为非创伤性骨坏死的一个主要原因[1]。虽然糖皮质激素已被认为是激素性股骨头坏死的病理原因，但动态的病理过程通常涉及多目标、多途径及多阶段合作，分子与生物过程相互影响，其具体发病机制仍有待进一步探索[2]。衰老是细胞及器官的逐渐退化并伴随相关功能的下降，细胞衰老后将转为衰老相关分泌表型，其特征是释放促炎因子及趋化因子等，这些因子可促使周围细胞加速老化从而导致各种疾病的发生[3-4]。
大多数慢性疾病都与衰老诱导的全身慢性炎症密切相关[4-5]。
相关研究表明，激素性股骨头坏死的发生可能与衰老相关分泌表型通过改变细胞周期、调整成骨成脂相关因子的表达量及加速组织氧化损伤，使骨髓间充质干细胞成骨成脂分化平衡打破有关[6-7]。TANG等[8]的研究证实了糖皮质激素可上调miR-601的表达，靶向作用于抗衰老因子SIRT1(sirtuin 1)沉默其表达，使骨髓间充质干细胞衰老而诱导激素性股骨头坏死的发生。以上证据均表明，细胞衰老可通过多种途径促进激素性股骨头坏死的发生发展，是激素性股骨头坏死的危险因素，但相关研究较少，其具体机制仍未被完全阐明。
机器学习可以从大量数据中自动学习其规律，是一种强大的数据分析工具，机器学习的加入为预测各种疾病的分子机制、识别复杂的生物信号提供了强有力的帮助[9-11]。此研究主要采用差异分析、加权基因共表达网络分析和2种机器学习算法筛选激素性股骨头坏死衰老枢纽基因，并在临床样本中对得到的枢纽基因进行验证，从而在细胞衰老的角度进一步阐释激素性股骨头坏死的发病机制，同时也为激素性股骨头坏死的早期诊断提供新的方向。另外，近年来利用骨髓间充质干细胞构建组织工程骨治疗激素性股骨头坏死的研究正在快速发展[12]，而衰老导致的骨髓间充质干细胞分化异常是激素性股骨头坏死发病的重要原因[6-7]，未来可针对此研究得出的基因靶点进行调控，提高疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计生物信息学分析及机器学习筛选得到衰老枢纽基因，并进行体外股骨头组织分组实验验证。研究工作流程见图1。
1.2 时间及地点实验于2024年2-7月在广西中医药大学仙葫校区及桂林医学院临桂校区科学实验中心完成。
1.3 资料
1.3.1 数据库数据收集从GEO 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载GSE123568 数据集。该数据集来自GPL15207平台，包含30例激素性股骨头坏死患者和10名健康对照，样本类型为外周血清。在滤除重复的探针或没有相应基因符号的探针后，将剩余探针依平台的注释信息转为同源基因符号。此外，还从CellAge数据库(https://genomics.senescence.info/cells/)下载了279个细胞衰老相关基因[13]。

1.3.2 股骨头样本收集该研究使用的股骨头组织均来自于桂林市中医医院行人工全髋关节置换手术的患者，样本在术中取下后都被迅速储存在-80 ℃冰箱中，直到它们被投入使用。此临床方案于2021年6月经桂林市中医医院伦理委员会批准，伦理批准号：2021-KY-zckt-002-07，每位参与者均提供了知情同意书。
激素性股骨头坏死组样本取自8例激素性股骨头坏死患者(男5例，女3例，年龄39-72岁，平均55.88岁)的股骨头坏死区，Ficat分期为Ⅲ期或Ⅳ期。股骨颈骨折组样本取自8例股骨颈骨折患者(男6例，女2例，年龄60-91岁，平均73.63岁) 的股骨头远离骨折端且非坏死区域，Garden分型均为Ⅳ型。
纳入标准：①激素性股骨头坏死患者有明显的疼痛及活动受限，疼痛控制不佳，疾病已严重影响生活质量，影像学显示有明显股骨头坏死表现，Ficat分期为Ⅲ-Ⅳ期； ②股骨颈骨折患者有明显的疼痛及功能障碍，影像学显示骨折有明显的移位，稳定性差，保守治疗效果不佳，Garden分型为Ⅳ型。
排除标准：①合并其他骨病，如骨关节炎、佩吉特病及骨肿瘤；②有严重的基础疾病；③不同意研究方案的患者。
进一步对两组患者的临床特征信息进行统计分析，两组患者的性别、手术部位及目测类比评分均无显著性差异(P > 0.05)，详见表1。

1.4 方法
1.4.1 激素性股骨头坏死衰老差异基因的鉴定使用R软件的“limma包(3.54.2)”对数据集中的激素性股骨头坏死患者外周血清基因表达谱进行的差异分析得到差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中设置筛选条件为|log2FC|> 0.8和P < 0.05，并通过R软件中的“ggplot2(3.5.1)”和“pheatmap(1.0.12)” R包对DEGs绘制火山图和热图(TOP50)。同时，与衰老相关基因取交集绘制韦恩图，获得DEGs-衰老基因。
1.4.2 加权共表达网络分析及模块选择采用“WGCNA (1.72-5)”包对全部基因进行加权基因共表达网络(WGCNA)分析，以期识别高度协调变化的基因集，并筛选特征基因[14]。首先构建无尺度拓扑网络，要求模块内最小基因数不少于100，计算基因的表达相关性系数，构建相似性矩阵，将相似性矩阵转化为拓扑重叠矩阵，得到基因间的相异度 (1-TOM)，利用层次聚类函数将表达谱相似的基因归于一个模块内。将模块同是否发生激素性股骨头坏死进行关联分析，采用皮尔逊相关系数计算模块同激素性股骨头坏死的关联性，取相关系数最大且P < 0.05的模块作为关键模块[15]。同时，将关键模块内基因与衰老相关基因取交集绘制韦恩图，获得WGCNA-衰老基因。
1.4.3 激素性股骨头坏死潜在衰老基因的基因本体论(gene ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析 GO和KEGG富集分析能够从系统生物学角度帮助研究者理解复杂的生物过程，以了解候选关键基因的生物学机制和信号通路[16]。结合上述DEGs-衰老基因和WGCNA-衰老基因取并集，从而获取激素性股骨头坏死潜在衰老基因并绘制韦恩图。通过DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov)进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中P < 0.05被认为是量化最重要的生物学机制和途径的标准指标。此外，使用“ggplot2”R语言包绘制了富集分析和弦图。
1.4.4 通过机器学习筛选枢纽基因采用最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)、支持向量机递归特征消除(support vector machine recursive feature elimination，SVM-RFE)2种机器学习算法分析激素性股骨头坏死衰老枢纽基因。LASSO回归既考虑了回归系数的拟合优度，也考虑了这些系数的绝对大小，以便进行有效的特征选择。“glmnet”包用于执行LASSO回归分析，10倍交叉验证选择最优的正则化参数[17]。
SVM-RFE是一种基于SVM最大区间原理的序列后验项选择算法，是应用最广泛、最优秀的特征选择算法之一。在这项研究中，使用“e1071(1.7-14)”包去除所得到差异基因的递归特征，使用“kernlab(0.9-32)”和“caret(6.0-94)”软件包进行SVM-RFE分析[18]。使用维恩图对2种算法的输出进行相交[19]，并将交集基因鉴定为激素性股骨头坏死衰老枢纽基因。同时采用Student’s t检验以确定激素性股骨头坏死衰老枢纽基因在对照组和激素性股骨头坏死组中的表达差异性。
1.4.5 Nomogram模型的构建为了进一步了解激素性股骨头坏死衰老枢纽基因在临床激素性股骨头坏死预测方面的情况，此研究构建了一个Nomogram模型，使用R软件中的“RMS(6.8-0)”和“rmda(1.6)”包来实现。并通过决策曲线分析(decision curve analysis，DCA)和校准曲线进行验证，以衡量Nomogram模型的识别能力。
1.4.6 基于激素性股骨头坏死衰老枢纽基因的分子亚型鉴定考虑到激素性股骨头坏死衰老枢纽基因存在的表达差异，此研究使用“ConsensusClusterPlus”包进行共识聚类分析来区分激素性股骨头坏死中不同的分子亚型[20]，并绘制主成分分析(principal component analysis，PCA)散点图，检验聚类的可靠性，进一步确定聚类类型是否正确。同时采用单因素方差分析检验以确定激素性股骨头坏死衰老枢纽基因在不同分子亚型中的表达差异性，以P < 0.05表示差异有显著性意义。
1.4.7 不同分子亚型之间免疫浸润细胞的鉴定和相关性分析为了对激素性股骨头坏死衰老关键枢纽基因在每个样本中免疫细胞进行量化，利用“GSEABase”和“GSVA”包对不同分子亚型进行单样本基因组富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)[21]。参考文件在MsigDB数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)中以“IMMUNITY”为关键词来获取。采用“spearman”函数对激素性股骨头坏死关键枢纽基因与免疫细胞的相关性进行分析，并通过“pheatmap(1.0.12)”软件包绘制热点图。
1.4.8 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)分析将10个股骨头组织样本使用组织研磨机破碎后再用骨组织RNA提取试剂盒(#160902，Aidlab)提取总RNA。互补DNA使用带有gDNA橡皮擦的初级快捷药方™RT试剂试剂盒(#AM2071；Invitrogen&trade)获得。SYBR Green qPCR混合物(#A46012；Applied Biosystems)在7500实时PCR系统(赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，MA，美国)中进行RT-qPCR，共40个周期。以GAPDH基因为内参，采用2-ΔΔCt法计算各基因与GAPDH基因的相对表达量。基因引物序列设计及合成由中国Sangon Biotech公司负责，每个基因的引物序列见表2。

1.4.9 免疫蛋白印迹实验验证每组各随机挑选3个样本进行Western blot验证。使用高效的RIPA裂解缓冲液(R0010，Solarbio)，每组样品用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次后，在液氮中压碎，加入研磨珠使用组织匀浆机进行研磨，提取组织蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒(PC0020，Solarbio)测定总蛋白的含量。然后将样品加热到95 ℃ 5 min，以使蛋白质变性用10% SDS-PAGE分离后，将20 μg的蛋白样品转移到PVDF膜上。在脱脂牛奶中阻断非特异性结合1 h后，膜与一抗过氧化氢酶(ZW021168，Abmart，1∶1 000)、结缔组织生长因子(PU456569，Abmart，1∶500)、叉头框蛋白O3(PA5461，Abcam，1∶800)、胰岛素受体底物2(PA5455，Abmart，1∶1 000)、丝裂原活化蛋白激酶激酶11(PK11527，Abmart，1∶800)和β-actin(P30002，Abmart，1∶2 000)孵育过夜。然后将适当的二抗在膜上孵育。使用Image Lab 3.0软件，使用电化学发光检测试剂(Invitrogen)对免疫印迹实验结果进行定量和观察。
1.5 主要观察指标激素性股骨头坏死衰老关键基因在组织中的表达差异；衰老关键基因在临床股骨头样本中的表达差异验证。
1.6 统计学分析使用SPSS 23.0软件进行统计学分析，Graphpad Prism 9.0软件绘图。上述实验均重复3次，数据经检验呈正态分布，以 x±s表示。采用独立样本t检验进行组间差异分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

衰老与骨组织退变关系密切，例如，SUO等[22]发现，衰老发生时ZMPSTE24表达降低，而其缺乏将会导致锌金属蛋白酶合成减少，从而加速关节软骨的退变及骨关节炎的进展。OKAMOTO等[23] 发现细胞衰老相关基因和衰老相关分泌表型如p16INK4a，p21，p53和白细胞介素6与股骨头坏死退变程度相关。CHEN等[24]的研究揭示了成纤维细胞样滑膜细胞的衰老对骨关节炎的进展有着重要意义，并通过靶向抑制METTL3减缓成纤维细胞样滑膜细胞的衰老实现了限制小鼠骨关节炎的发展。这些研究表明细胞衰老在骨科疾病进展中发挥着重要作用。
目前虽已有相关证据表明，激素性股骨头坏死的发生发展与细胞衰老有关[6-8]，但具体机制仍有待探究。为了进一步探明衰老基因在激素性股骨头坏死中的作用机制，此研究运用GEO及CellAge数据库筛选获得了21个DEG-衰老基因。进一步采用WGCNA分析对激素性股骨头坏死的差异基因进行优化，并再次与所获取的衰老基因进行交集，最终获得了11个激素性股骨头坏死潜在衰老基因并进行GO和KEGG富集分析。结果表明，激素性股骨头坏死潜在衰老基因主要富集在衰老、氧化应激反应、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、转录调节复合物、DNA结合转录因子结合、抗氧化活性、FoxO信号通路及肿瘤坏死因子信号通路等方面。
此研究使用LASSO和SVM-RFE两种机器学习算法进一步明确激素性股骨头坏死的衰老枢纽基因。结合两种算法的结果，共得到了5个激素性股骨头坏死衰老枢纽基因，它们分别是过氧化氢酶，结缔组织生长因子，叉头框蛋白O3，胰岛素受体底物2和丝裂原活化蛋白激酶激酶11。根据激素性股骨头坏死衰老枢纽基因的表达建立了一个激素性股骨头坏死诊断Nomogram图，预测了其对临床诊断意义。除此之外，此研究还对激素性股骨头坏死衰老中枢基因进行了不同分子亚型之间的差异分析和免疫浸润分析，结果发现激素性股骨头坏死衰老中枢基因的表达在3个亚类之间存在显著性差异。最后通过免疫印迹和qPCR对激素性股骨头坏死衰老枢纽基因进行验证，发现过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3和丝裂原活化蛋白激酶激酶11在激素性股骨头坏死组织中呈低表达，而胰岛素受体底物2呈高表达。
过氧化氢酶是机体防御氧化应激的关键抗氧化酶，与机体的免疫调控相关，广泛分布于免疫细胞中[25-27]。免疫系统作为病原信号的传感器和防御者，是监测衰老过程中出现衰退的开关。免疫系统随着年龄的增长出现免疫器官结构的破坏和免疫反应的功能障碍，出现免疫衰老，并导致许多与年龄相关的慢性疾病，免疫失调已成为衰老的一个特征[28]。当激素大量使用诱发股骨头坏死，机体免疫系统被激活，随着病情发展，以巨噬细胞极化失衡为主的骨免疫失调将进一步促进影响骨代谢的炎症因子释放[29]，从而加重局部炎症反应[30-31]，这或许是激素性股骨头坏死中过氧化氢酶异常表达的原因之一。此研究的分析结果与上述研究的结果大致相似，表明过氧化氢酶可能在激素性股骨头坏死病变中起主要作用。
叉头框蛋白O3是FOX家族中的“O”亚族成员，作为一类在进化中高度保守的转录因子[32]，它能够通过外界环境因素的改变，通过调节磷酸化位进而调控多种生理病理过程[33-34]。在正常骨骼新陈代谢中，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化时常伴随着从依赖糖酵解转向更高效的氧化磷酸化的能量代谢的转换[35-36]，该过程通常伴随着内源性活性氧水平的上升[37]，而内源性活性氧的堆积是导致细胞衰老的重要原因[38]。过量的内源性活性氧还会抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[39]，为了对抗这种影响，骨髓间充质干细胞激活了一系列抗氧化、抗衰老通路，其中关键便是通过上调FOXO转录因子，调控抗氧化酶的表达，从而保护细胞免受伤害[40]。最近的一项研究表明，miRNA-29a可减缓叉头框蛋白O3的甲基化流失，从而延缓成骨细胞衰老[41]，而此研究结果显示叉头框蛋白O3在激素性股骨头坏死组织中表达量相比与对照组确有降低，说明叉头框蛋白O3对维持骨稳态有着重要意义。
胰岛素受体底物1是是胰岛素信号转导通路中的一个重要接头蛋白，磷酸化的胰岛素受体底物2与含有Src同源性结构域的蛋白结合，调节细胞代谢、生长和分化[42-43]。在骨组织中，胰岛素受体底物1能够影响骨髓间充质干细胞的增值及成骨分化[44]；卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠的肝、骨骼肌、肾、骨的胰岛素生长因子1、胰岛素受体底物1和胰岛素受体底物2减少[45]。在软骨细胞中，胰岛素受体底物2可以促进软骨细胞合成代谢的同时抑制其分解。胰岛素能够促进Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的生成[46-47]，并抑制成熟软骨细胞和跨物种关节软骨外植体中由白细胞介素1引发的分解代谢作用[48]。有研究发现，小檗碱可通过上调活性氧介导的胰岛素受体底物1通路，对抗高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化抑制作用，提升骨强度，从而促进义齿种植后的骨整合过程[49]。此外，MIAO等[50]的研究揭示了高糖上调miRNA-144-5p的表达，从而介导下游的胰岛素受体底物1/AKT 信号通路抑制成骨细胞的迁移及分化可能是糖尿病骨质疏松的病理机制。胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导是调节衰老的重要通路，通过抑制此通路信号传导能改善与衰老密切相关的阿尔茨海默病的情况[51]，胰岛素受体底物1和胰岛素受体底物2均是其中的关键因子，且有研究表明胰岛素受体底物2在此通路的调控中占据主导地位[52]。然而，目前缺乏衰老介导激素性股骨头坏死的发生发展与胰岛素受体底物2之间调控关系的研究。
结缔组织生长因子又名CCN2，是一种多功能蛋白，它可以和细胞表面的整合素相互作用，且能发挥血管生成因子的功能与基质金属蛋白酶协同工作，共同参与生物过程[53]。结缔组织生长因子是目前备受关注的癌症治疗靶点之一，其有与癌细胞增殖、转移、侵袭等过程关系密切[54]。而YU等[55]使用富含胚胎干细胞来源外泌体的miR-15b-5p和miR-290a-5p靶向调控CCN2介导的AKT/mTOR 通路改善了衰老小鼠的活力。成骨与破骨平衡与激素性股骨头坏死关系密切，目前结缔组织生长因子可促进软骨细胞和成骨细胞的增殖和分化虽已得到验证[56]，但在衰老介导激素性股骨头坏死发生发展过程中发挥的作用还有待进一步研究。
丝裂原活化蛋白激酶激酶11也被称为LKB1，编码一种广泛表达和进化上保守的丝氨酸-苏氨酸激酶[57]。LKB1与AMPK形成多级酶链反应调节许多生物过程，包括细胞能量稳态、细胞周期进程和细胞极性[58]。在软骨细胞中，LKB1/AMPK通路被激活可减缓软骨退化，从而减轻骨性关节炎的疼痛[59]。另外，激活 LKB1/AMPK通路可抑制缺血再灌注大鼠中炎症、氧化应激和细胞凋亡，促进成骨细胞分化，增强牙周和骨组织再生[60-61]，敲除LKB1将显著减弱氧化应激下骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的转化。此研究结果显示，丝裂原活化蛋白激酶激酶11在激素性股骨头坏死样本中呈现低表达，这与以往的研究成果相一致。
最后，此研究利用ssGSEA探索了激素性股骨头坏死中基于5个衰老枢纽基因进行分型后的亚型之间的免疫细胞浸润情况，结果表明，活化CD4+ T细胞、活化CD8+ T细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、未成熟树突状细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞、滤泡辅助T细胞、Th17细胞、Th2细胞与衰老枢纽基因的表达情况之间存在潜在关联，并可能影响着激素性股骨头坏死的发生和发展，这些结果也与既往的一些相关研究大致相似。CHEN等[62]研究表明，T细胞亚群的失衡可能参与激素性股骨头坏死的病理生理过程，且发现激素性股骨头坏死患者活化CD4+ T细胞/活化CD8+ T细胞比值要较创伤性、酒精性以及特发性股骨头坏死低；此外，激素性股骨头坏死组的活化CD4+ T细胞、活化CD8+ T细胞计数以及活化CD4+ T细胞/活化CD8+ T细胞比值要高于健康人。有关树突状细胞在股骨头坏死发生发展过程中的机制研究报道罕见，但从有关抗骨质吸收药物相关性颌骨骨坏死的相关研究来看不难发现，树突状细胞分化及功能被抑制后容易导致局部免疫微环境发生紊乱，免疫功能被破坏后促使颌骨骨坏死发生和发展[63]。免疫微环境的改变促使破骨细胞衍生直接参与该过程，且相关研究也表明，树突状细胞来源的破骨细胞显示出较强的骨吸收活性[64]。激素冲击疗法是系统性红斑狼疮患者的重要选择，但存在与微循环障碍相关的不良事件风险，包括激素性股骨头坏死。最近的研究表明，过多的中性粒细胞胞外陷阱与微循环障碍有关，其通过动物研究发现，系统性红斑狼疮模型小鼠在进行激素冲击疗法后，股骨头出现坏死，并伴有形成中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞组织浸润[65]。由此可见，尽管目前尚未有研究表明这些衰老枢纽基因在激素性股骨头坏死免疫途径方面扮演着重要角色，但通过结合上述研究和此研究结果可以推测，这些衰老枢纽基因可能在免疫细胞自身以及免疫微环境改变所导致的破骨细胞衍生中发挥着调控作用。
综上所述，此研究通过生物信息学联合机器学习分析，确定了过氧化氢酶、结缔组织生长因子、叉头框蛋白O3、丝裂原活化蛋白激酶激酶11和胰岛素受体底物25为调控细胞衰老介导激素性股骨头坏死发生发展的关键基因，并通过实验验证了以上5个基因可作为激素性股骨头坏死细胞衰老的生物标志物。这项研究结果丰富了研究者们对激素性股骨头坏死发病机制的理解，揭示了细胞衰老在激素性股骨头坏死病理过程中的核心作用，提示针对衰老相关基因干预可能是未来治疗激素性股骨头坏死的新策略之一。另外，这些关键基因作为生物标志物将有助于临床提高激素性股骨头坏死的诊断准确率，使得医生能够更早地识别出高风险患者并及时采取干预措施以延缓病情进展。最后，随着对这些基因研究的深入，未来开发出针对性更强、不良反应更小的新型药物将成为可能，这将能有效提高激素性股骨头坏死的预后情况。然而此研究仍存在一些不足之处，如从国际公共数据集下载的测序和临床数据常来自于不同国家和地区的人群，这些人群的遗传背景及生活环境等与中国人群的差异可能会不同程度的影响分析结果的准确性，还需要更多多中心、多地区及不同民族背景的数据进一步验证；此外，缺乏动物体内实验验证及细胞层面上对机制的深入探讨。但目前激素性股骨头坏死伴细胞衰老、氧化应激及抗氧化活性等相关性研究仍缺乏，这5个基因为后续进一步探索提供了关键的介入点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

激素性股骨头坏死衰老关键基因的生物信息学鉴定和验证

Bioinformatics identification and validation of aging key genes in hormonal osteonecrosis of the femoral head

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