线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：基于多机器学习算法的互作分析

doi:10.12307/2025.745

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (26): 5595-5607.doi: 10.12307/2025.745

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线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：基于多机器学习算法的互作分析

李加根，陈跃平，黄柯琪，陈尚桐，黄川洪

广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2024-08-01 接受日期:2024-09-15 出版日期:2025-09-18 发布日期:2025-02-25
通讯作者: 陈跃平，博士，主任医师，博士生导师，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:李加根，男，1998年生，内蒙古自治区鄂尔多斯市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事脊柱、骨关节创伤性疾病的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82360937)，项目负责人：陈跃平；广西自然科学基金项目(2023JJA140318)，项目负责人：陈跃平；广西中西医结合骨与关节退行性疾病多学科交叉创新团队(GZKJ2310)，项目参与人：陈跃平；广西中医药大学研究生教育创新计划项目(YCSY2023040)，项目负责人：李加根

Rheumatoid arthritis from the perspective of mitophagy: interaction analysis based on multiple machine learning algorithms

Li Jiagen, Chen Yueping, Huang Keqi, Chen Shangtong, Huang Chuanhong

Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-08-01 Accepted:2024-09-15 Online:2025-09-18 Published:2025-02-25
Contact: Chen Yueping, PhD, Chief physician, Doctoral supervisor, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Li Jiagen, Master candidate, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82360937 (to CYP); Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2023JJA140318 (to CYP); Guangxi Integrated Bone and Joint Degenerative Disease Multidisciplinary Innovation Team Project, No. GZKJ2310 (to CYP [project participant]); Innovation Project of Guangxi Graduate Education of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCSY2023040 (to LJG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
类风湿关节炎：是一种慢性、系统性的自身免疫性疾病，主要特征为多发对称性小关节炎症、疼痛和肿胀，疾病后期往往导致严重的关节畸形甚至功能丧失。
线粒体自噬：是一种选择性自噬，主要过程为异常的线粒体被包裹在自噬体内随之运输到溶酶体，从而被靶向降解和清除，以控制线粒体质量和功能的稳定，这一过程对维持细胞内能量平衡、减少氧化应激和维护细胞内稳态具有重要意义。

背景：类风湿关节炎发病机制至今尚未完全清晰，近来有研究表明线粒体自噬与类风湿关节炎存在关联性，但关键机制有待深入探究。
目的：利用多机器学习算法鉴定和验证类风湿关节炎中线粒体自噬过程的核心互作基因并解析其免疫调控过程。
方法：从GEO数据库整理类风湿关节炎转录组表达数据集GSE15573作为独立训练集，GSE97779和GSE55235合集作为独立验证集。利用训练集筛选类风湿关节炎差异表达基因，同时进行“WGCNA”分析。然后从“MitoCarta3.0”数据库下载线粒体自噬相关基因，将其与类风湿关节炎差异基因和“WGCNA”分析模块基因取交集获得类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因，将相关基因进行功能富集分析以明确细胞通路。随后利用“Random Forest”和“LASSO”2种机器学习算法分别筛选特征基因，利用“GMM”机器学习算法对前2种机器学习算法筛选的交集基因拟合验证，以获得类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因。进一步建立预测模型，并利用外部验证集验证。最后，采用“CIBERSORT”进行免疫浸润分析此过程中免疫细胞亚群占比及亚群之间关联性，采用“ssGSEA”分析类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因与免疫细胞亚群间关联性，同时分析核心互作基因的相关“GO”“KEGG”生物学通路。
结果与结论：①差异分析获得807个类风湿关节炎差异表达基因，“WGCNA”分析筛选出2个特征模块含1 208个基因，线粒体基因数据库整理出1 136个基因，三部分基因取交集获得53个基因为类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因；②相关基因的功能富集分析结果显示细胞过程主要与线粒体自噬、过氧化物酶体代谢、细胞衰老、坏死性凋亡相关；③3种机器学习算法鉴定出4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因(DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、PDHB)；④预测模型的风险评分受试者工作特征曲线下面积为0.989，外部患者样本的工作特征曲线验证类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因的曲线下面积均大于0.7；⑤免疫调控分析显示类风湿关节炎中线粒体自噬过程与记忆B细胞、M0型巨噬细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、静息态记忆性CD4 T细胞密切相关；⑥生物学通路分析结果显示核心互作基因与821条“GO”通路强相关(|cor| > 0.8，P < 0.001)，与48条“KEGG”通路强相关(|cor| > 0.8，P < 0.001)，其中关键生物学过程与线粒体DNA代谢、线粒体DNA修复、线粒体DNA复制、线粒体基因组维护、线粒体去极化的正向调控和参与凋亡信号通路的线粒体外膜通透性的正向调控有关；⑦上述结果证实，DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、PDHB是类风湿关节炎中线粒体自噬过程的核心互作基因，通过参与特定免疫过程在疾病进展中发挥关键作用，对类风湿关节炎的诊断具有精准预测效果。
https://orcid.org/0009-0006-1240-5170 (李加根)；https://orcid.org/0000-0003-3860-1568 (陈跃平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 线粒体自噬, 类风湿关节炎, 机器学习算法, 加权基因共表达网络分析, 预测模型, 外部验证, 免疫细胞, 生物学功能

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of rheumatoid arthritis has not yet been fully clarified, and recent studies have shown that mitophagy is associated with rheumatoid arthritis, but the key mechanisms need to be explored in depth.
OBJECTIVE: To identify and validate the core interaction genes of mitophagy in rheumatoid arthritis using multiple machine learning algorithms and to analyze its immunoregulatory process.
METHODS: The rheumatoid arthritis transcriptome expression dataset GSE15573 was retrieved from the GEO database as an independent training set, with the GSE97779 and GSE55235 collections used as independent validation sets. The differentially expressed genes of rheumatoid arthritis were screened using the training set, and “WGCNA” analysis was also performed. Then we downloaded the mitophagy-related genes from the “MitoCarta3.0” database, and intersected them with the differentially expressed genes of rheumatoid arthritis and the genes in the “WGCNA” analysis module to obtain the rheumatoid arthritis-mitophagy-related genes, and then analyzed the related genes for functional enrichment to clarify the cellular pathways. Feature genes were initially identified using the “Random Forest” and “Lasso” algorithms. The overlapping genes from these two methods were further refined using the “GMM” algorithm to identify the core interaction genes between rheumatoid arthritis and mitophagy. A predictive model was then developed and validated using an external dataset. Finally, “CIBERSORT” was employed to analyze the proportions and interactions of immune cell subsets during immune infiltration, while “ssGSEA” was used to examine the associations between the rheumatoid arthritis-mitophagy core interaction genes and immune cell subsets. “ssGSEA” was also utilized to analyze the “GO” and “KEGG” biological pathways of the core interaction genes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Totally 807 differentially expressed genes in rheumatoid arthritis were obtained by differential analysis, 1 208 genes were selected from two feature modules by “WGCNA” analysis, 1 136 genes were sorted out from the MitoCarta 3.0 database, and 53 HUB genes were obtained from the intersection of the three genes as rheumatoid arthritis-mitophagy related genes. (2) The results of functional enrichment analysis of related genes showed that the cellular processes were mainly related to mitophagy, peroxisome metabolism, cellular senescence, and necroptosis. (3) The three machine learning algorithms identified four rheumatoid arthritis-mitophagy core interaction genes (DNAJA3, C12orf65, AKR7A2, and PDHB). The area under the curve of nomoscore was 0.989, and the area under the curve values of rheumatoid arthritis-mitophagy core interaction genes verified by the receiver operating characteristic curve of external patient samples were all greater than 0.7. (5) Immunoregulatory analysis showed that the mitophagy process in rheumatoid arthritis was closely associated with memory B cells, M0 macrophages, activated memory CD4 T cells, and resting memory CD4 T cells. (6) The biological pathway analysis revealed that the core interaction genes were strongly associated with 821 “GO” pathways (|cor| > 0.8, P < 0.001) and 48 “KEGG” pathways (|cor| > 0.8, P < 0.001). The key biological processes identified were related to mitochondrial DNA metabolic process, mitochondrial DNA repair, mitochondrial DNA replication, mitochondrial genome maintenance, positive regulation of mitochondrial depolarization, and positive regulation of mitochondrial outer membrane permeabilization involved in apoptotic signaling pathway. To conclude, DNAJA3, C12orf65, AKR7A2, and PDHB are the core interaction genes of the mitophagy process in rheumatoid arthritis, which play key roles in disease progression by participating in specific immune processes and have precise and predictive effects on the diagnosis of rheumatoid arthritis.

Key words: mitophagy, rheumatoid arthritis, machine learning algorithm, weighted gene co-expression network analysis, predictive model, external validation, immune cells, biological function

中图分类号:

李加根, 陈跃平, 黄柯琪, 陈尚桐, 黄川洪. 线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：基于多机器学习算法的互作分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5595-5607.

Li Jiagen, Chen Yueping, Huang Keqi, Chen Shangtong, Huang Chuanhong. Rheumatoid arthritis from the perspective of mitophagy: interaction analysis based on multiple machine learning algorithms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(26): 5595-5607.

图/表（结果） 15

2.1 类风湿关节炎差异表达基因筛选结果通过R函数包“limma”和“affy”分析类风湿关节炎组和正常组的基因转录组数据，并根据平均绝对折叠变化法获得的log FC Cut Off及-log10 (P.Value) < 0.05，筛选差异基因总计807个，其中上调基因数量为439个，下调基因数量为368个。将差异基因进行火山图可视化(图1A)，并对上调及下调基因中表达量最高的各30位基因进行热图可视化(图1B)。
2.2 “WGCNA”分析结果 “WGCNA”可作为一种初步筛选重要性基因的强大方法，通过对标准化后的矩阵数据进一步处理，发现数据集中无不良样本及基因被删除，然后对所有样本聚类，发现GSM389724与GSM389732两例样本离群，当“cutHeight”=45时，切除离群样本。通过计算不同软阈值的“scale free topology model fit”，继而构建无标度网络(图2A)。随后，集合不同表达水平基因的基因模块被分离出来，通过聚类分析和动态剪切树法识别模块，并合并相似的模块(图2B)。计算模块特征基因与临床表型(正常对照和类风湿关节炎)之间的相关性，生成相关性矩阵和P值矩阵，继而绘制模块与临床表型的相关性热图(图2C) ，结果显示绿松石色模块(r=±0.66，P=6×10-5)、粉色模块(r=±0.54，P=0.002)意义最显著。提取上述模块基因，其中绿松石色模块含基因970个，粉色模块含基因238个，共有1 208个模块特征基因与临床表型最相关。
2.3 类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因筛选及“GO”和“KEGG”分析结果从“MitoCarta 3.0”数据库中下载人类线粒体特征表达基因，数据集包含1 136个基因，以807个类风湿关节炎差异表达基因、1 208个“WGCNA”特征基因和人类线粒体1 136个特征表达基因取交集，获得类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因总计53个(图3A)。对上述交集基因进行“GO”和“KEGG”功能富集分析，“GO”富集分析排行前5位的可视化结果显示生物过程主要与有氧呼吸、细胞呼吸、电子传递链、有氧电子传递链、ATP合成偶联电子传递有关，细胞组分主要与含蛋白线粒体复合物、线粒体内膜、线粒体基质、呼吸链复合物、线粒体呼吸体相关，分子功能主要与电子传递活性、NADH脱氢酶(泛醌)活性、NADH脱氢酶(醌)活性、NADH脱氢酶活性、NAD(P)H脱氢酶(醌)活性有关(图3B)。“KEGG”功能富集分析结果包含4条细胞过程通路，富集程度由高到低依次为线粒体自噬、过氧化物酶体代谢、细胞衰老、坏死性凋亡(图3C)。
2.4 “RF”机器学习算法筛选核心诊断基因采用R函数包“randomForest”的“RF”算法对53个类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因进行进一步筛选并对随机森林模型误差率曲线图(图4A)和基因重要性排名图(图4B)可视化，获得30个相关性较高的基因，当重要性评分> 0.6时，获得“RF”算法相关性最佳的11个基因，分别为SLIRP、NDUFB3、PUS1、DNAJA3、PDHA1、PDHB、PTRH2、C12orf65、AKR7A2、UQCRQ、ECHS1。
2.5 “LASSO”机器学习算法筛选核心诊断基因通过R函数包“tidyverse”“broom”和“glmnet”对53个类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因进行“LASSO”回归分析，绘制出“LASSO”回归模型交叉验证误差曲线图(图5A)和“LASSO”回归系数路径图(图5B)。根据交叉验证误差曲线图可知，“LASSO”筛选的特征基因数量在6-9之间，输出基因筛选结果，获得9个相关性最高的基因，包括DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、HADH、PDHB、BLOC1S1、COX7C、SLC25A5、NDUFS5。
2.6 “GMM”机器学习算法同级验证核心互作基因将“RF”算法与“LASSO”算法筛选结果取交集，进行Venn图可视化(图6A)，取得4个交集基因分别为DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、PDHB。通过R函数包“mclust”和“SimDesign”对“RF”和“LASSO”回归分析筛选出的特征基因分别进行“GMM”独立聚类验证，“RF”和“LASSO”的基因筛选结果分别被归聚为9个类别，验证“RF”结果下创建了2 047个训练模型(图6B)；验证“LASSO”结果下创建了511个训练模型(图6C)。输出两侧最佳模型结果，包括DNAJA3、PUS1、AKR7A2、PTRH2、ECHS1、PDHB、C12orf65、SLC25A5、COX7C共9个基因，其中DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、PDHB均位于“GMM”算法下最优训练模型基因结果内，因此被筛选作为4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因。
2.7 预测模型构建及验证结果在二分类逻辑回归分析模式下，对4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因进行诊断列线图模型构建，列出各个基因的分数区间，以用来评估基因表达水平在不同分数下的风险贡献，并通过相加每个基因的分数计算出总分，通过总分评估相对应的风险概率。总分越高，患类风湿关节炎的风险越大(图7A)。同时基于Bootstrap方法，重复1 000次，进行模型校正曲线绘制(图7B)，以进行内部验证，结果发现校正曲线与理想曲线贴合度高(均方误差=0.005 15)，证明模型的构建精度良好。进一步构建临床决策曲线(图7C)，发现预测模型曲线与所有样本患病曲线之间离散度较高，表明模型的临床效用较高。
2.8 外部患者样本的工作特征曲线验证将GSE97779与GSE55235数据集去批次合并获得外部患者样本的独立验证集，通过对比去批次前后的主成分分析(图8A，B)，发现去批次效果良好。在独立外部验证集基因表达数据中进行核心互作基因的受试者工作特征曲线分析(表2)并进行可视化(图8C)，结果发现所有核心互作基因的曲线下面积均大于0.7 (P < 0.01)，表明诊断效能良好，证明4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因在实际应用中对类风湿关节炎的预测具有良好的稳定性与准确性。

2.9 “CIBERSORT”免疫浸润分析结果通过“CIBERSORT”算法，利用“MsigDB”数据库的22种免疫细胞“gmt”数据和类风湿关节炎差异基因表达矩阵数据进行免疫浸润分析，进行免疫细胞堆积比例图可视化(图9A)及免疫细胞相关性热图可视化(图9B)，可以看出呈高正相关性的免疫细胞对有活化的记忆性CD4 T细胞与γδT细胞、活化的记忆性CD4 T细胞与静息态肥大细胞、M1型巨噬细胞与嗜酸性粒细胞、γδT细胞与静息态肥大细胞。其中，γδT细胞与静息态肥大细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、静息态树突细胞、M0型巨噬细胞、中性粒细胞均具有较高正相关性。呈高负相关性的免疫细胞对有γδT细胞与静息态 NK 细胞、活化的记忆性CD4 T细胞与静息态 NK 细胞、活化的肥大细胞与静息态树突细胞。其中静息态 NK细胞与静息态肥大细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、γδT细胞、静息态树突细胞、M0型巨噬细胞、中性粒细胞均有高负相关性。结果表明，在类风湿关节炎线粒体自噬过程中，γδT细胞与活化的记忆性CD4 T细胞的免疫状态较为活跃。
2.10 “ssGSEA”单样本-免疫细胞亚群间关联性分析结果通过R包“GSVA”相关函数初步分析各样本和免疫细胞亚群间的相关性，鉴定不同样本中相关免疫细胞的浸润丰度，继而进行免疫浸润热图可视化(图10A)及表达差异分组箱式图可视化(图10B)。免疫浸润热图显示类风湿关节炎组γδT细胞、巨噬细胞的表达显著高于正常组，正常组调节性T细胞的表达显著高于类风湿关节炎组。表达差异分组箱式图显示类风湿关节炎组与正常组间活化的CD8 T细胞、CD56亮型自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、γδT细胞、1型辅助性T细胞、2型辅助性T细胞的表达均具有显著性差异(P < 0.001)。
2.11 类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因-免疫细胞亚群间关联性分析结果首先，通过R包“ggcorrplot”分析核心互作基因与免疫细胞亚群间的相关性，根据4个核心互作基因的表达矩阵数据与“CIBERSORT”免疫浸润结果数据，利用Shapiro-Wilk检验与封装好的Spearman相关性分析函数进行相关计算，获得基因与免疫细胞亚群间的关联性数据，继而进行核心互作基因-免疫细胞关联性“棒棒糖”图可视化(图11A-D)。图中所示，DNAJA3、C12orf65、PDHB与记忆B细胞均具有强正相关性，DNAJA3、AKR7A2、PDHB与M0型巨噬细胞均呈强负相关性，此外，C12orf65还与活化的记忆性CD4 T细胞呈强负相关性，AKR7A2与静息态记忆性CD4 T细胞呈强正相关性。
其次，通过R包“linkET”进行汇总性可视化，绘制核心互作基因-免疫细胞亚群间关联性网络矩阵图(图11E)，多核心互作基因共同作用时，其中以记忆B细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、调节性T细胞、M0型巨噬细胞、中性粒细胞的参与最为重要。同时，在类风湿关节炎线粒体自噬过程中，活化的记忆性CD4 T细胞与γδT细胞、静息态肥大细胞之间的正相关表达作用最强，单核细胞和中性粒细胞之间的负相关表达作用最强。
2.12 基于“ssGSEA”的核心互作基因相关生物学功能分析结果 “ssGSEA”算法下共获得821种与类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因相关的“GO”生物学功能(|cor| > 0.8，P < 0.001)，其中生物过程数量为600种，细胞组分数量为72种，分子功能数量为149种，并筛选出与每个核心互作基因正相关性和负相关性最强的前3位生物学功能进行展示(表3)。同时获得48条与类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因相关的“KEGG”信号通路(|cor| > 0.8，P < 0.001)，同样筛选出与每个核心互作基因正相关性和负相关性最强的前3位信号通路进行展示(表4)。最后，逐条筛选上述全部获得的821种“GO”生物学功能和48条“KEGG”信号通路，发现有6种生物学功能与线粒体自噬密切相关(表5)。

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引言

类风湿关节炎是一种系统性自身免疫性疾病，患者临床表现为对称性的多发小关节炎症、疼痛和肿胀[1]，病理特征包括滑膜增生、软骨退化、成纤维样滑膜细胞浸润软骨、骨面及软骨下骨侵蚀，疾病后期往往导致严重的功能障碍，甚至关节功能丧失或残疾[2]。类风湿关节炎全球患病率据报道约为0.46%，范围从0.39%-0.54%不等[3]。虽然类风湿关节炎可以在任何年龄段发病，但40岁以上患病风险显著增加，女性受影响的概率是男性的两三倍[4]，而且患病率呈逐渐上升趋势。目前有研究表明类风湿关节炎的发病机制与包括HLA-DRB1在内多个等位基因的异常表达、表观遗传因素如DNA甲基化和组蛋白乙酰化等生物过程有关[5-6]。由于类风湿关节炎具有多因素病因和十分复杂的发病机制，至今仍是一项医学难题[7-8]，因此探讨类风湿关节炎发病过程的重要机制，确定关键基因及相关分子作用过程具有重要意义。
线粒体是一种分布非常广泛的双层膜细胞器，几乎存在于机体所有细胞中[9]，主要功能是产生三磷酸腺苷为细胞提供能量，同时还具有调节钙稳态、细胞增殖和代谢等重要功能[10]。通过自噬选择性地清除线粒体称为线粒体自噬，是线粒体质量控制的重要机制[11]，其过程主要体现为：在泛素化依赖或非泛素化依赖的受体介导途径下，受损的线粒体被包裹在自噬体内，转运到溶酶体进行降解和再循环，这对于线粒体的基础周转和生理条件的维持至关重要[12]。但目前关于线粒体自噬在疾病中的作用仍存在争议，一些研究表明，线粒体自噬通过发挥细胞保护作用可以延缓疾病进展，如在骨关节炎中，线粒体自噬可以调节活性氧水平，进一步增加机体软骨细胞的存活率[13]。还有研究表明，线粒体损伤可能与类风湿关节炎的发病有关[9]。
机器学习方法是一类新兴的涵盖多种算法在内的数据驱动研究方法，已广泛应用于生物医学领域[14]。尽管已有研究利用机器学习算法探索类风湿关节炎的关键基因，但尚无从线粒体自噬角度研究其发病机制的方法学研究。此研究首次应用多种机器学习算法包括随机森林(random forest，RF)、LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)和高斯混合模型(gaussian mixture model，GMM)算法，深入分析类风湿关节炎中的线粒体自噬相关机制。“RF”算法通过构建多个决策树，评估相关基因的重要性，具有处理多元共线性和缺失数据的优势；“LASSO”算法则通过引入L1正则化项，在高维数据中有效筛选出关键特征，适用于小样本研究[15]。为了确保“RF”和“LASSO”算法筛选结果的可靠性，使用“GMM”算法进行概率建模，识别潜在分布模式，从而进一步验证并筛选核心互作基因。
此研究旨在通过多种机器学习算法稳健并准确地鉴定类风湿关节炎疾病进展中线粒体自噬核心互作基因，进一步构建风险预测模型评估类风湿关节炎的患病风险，为类风湿关节炎的早期临床决策提供新的思路，同时为类风湿关节炎中线粒体自噬机制研究提供新的视角。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计 “WGCNA”分析、“GO”与“KEGG”功能富集分析、“RF”机器学习算法、“LASSO”机器学习算法、“GMM”机器学习算法、类风湿关节炎预测模型构建及验证、外部样本验证、“CIBERSORT”免疫浸润、“ssGSEA”免疫调控分析、“ssGSEA” 生物学功能分析。
1.2 时间及地点实验于2024年5-7月在广西中医药大学附属瑞康医院完成。
1.3 资料从“GEO DataSets”公共数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)筛选类风湿关节炎相关微阵列数据集，搜索关键词为“rheumatoid arthritis”，具体检索语句如下：(“arthritis，rheumatoid”[MeSH Terms] OR rheumatoid arthritis[All Fields]) AND “Homo sapiens”[porgn] AND (“gse”[Filter] AND “Expression profiling by array”[Filter])，共获得198个相关数据集，按样本量从高到底排序，过滤掉与类风湿关节炎诊断二分类变量不相关的数据集，筛选获得训练集GSE15573芯片，获得验证集GSE97779芯片与GSE55235芯片(表1)。
1.4 方法

1.4.1 类风湿关节炎差异表达基因筛选使用R软件中“limma”包与“affy”包，对GSE15573、GSE97779和GSE55235基因数据集进行数据清洗与矩阵整理，对基因表达矩阵数据去除重复值、去除缺失值、表达分布归一化和log2标准化处理，制作分组矩阵、比较矩阵并进一步利

用“贝叶斯”函数处理校正。对于独立训练集GSE15573进行差异基因筛选。采用平均绝对折叠变化法，计算所有差异基因 log FC绝对值的平均值与二倍绝对值的标准差之和，从而确定符合数据分布情况的log FC Cut Off阈值，当log FC绝对值大于此阈值且当-log10 (P.Value) < 0.05时，所筛选的基因作为类风湿关节炎差异表达基因，继而使用“ggplot2”函数包和“pheatmap”函数包绘制类风湿关节炎差异表达基因的火山图和差异化热图。

1.4.2 “WGCNA”分析加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)是一种用于分析基因相关性的系统生物学模式方法，主要应用于不同样品间的基因表达数据。该方法能够识别在表达水平上表现出高度一致变化的基因组，并通过分析这些基因组之间的关系及其与特定表型的关联，来识别潜在的生物标志物或治疗靶标。为了分析数据清洗后的基因表达矩阵，使用R中的“WGCNA”和“limma”包，首先去除非典型样本，然后对各样本进行聚类，继而构建拓扑重叠矩阵和无标度网络，随之进行动态基因模块的融合，并识别与临床表型最一致的模块，最后将所挑出模块中的基因进行组织汇总，获得“WGCNA”特征基因。
1.4.3 类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因筛选及“GO”和“KEGG”分析从“MitoCarta3.0”数据库(https://www.broadinstitute.org/mitocarta/)中下载人类线粒体相关表达基因[16]。使用类风湿关节炎差异表达基因、 “WGCNA”特征基因和“MitoCarta 3.0”数据库基因取交集得到类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因，继而将交集过程利用“VennDiagram”函数包绘制成Venn图。然后使用R函数包“enrichplot”和“clusterProfiler”，将整理好的类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因进行“GO”和“KEGG”功能富集分析并可视化。
1.4.4 “RF”机器学习算法筛选核心基因运用R软件的“randomForest”和“ggplot2”包，对类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因表达数据进行 “RF”算法分析，以筛选出具有显著分类能力的“RF Genes” 特征基因。
1.4.5 “LASSO”机器学习算法筛选核心基因利用R软件的“broom”和“glmnet”包，对类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因表达数据进行“LASSO”机器学习算法筛选，获得显著特征基因“LASSO Genes”。
1.4.6 “GMM”机器学习算法同级验证核心基因使用“GMM”算法相关R包“mclust”和“SimDesign”对“RF Genes”特征基因和“LASSO Genes”特征基因同时分别进行独立聚类验证，使筛选出的特征基因得到进一步确认，确保其在分类任务中具有稳定的表现和高准确性。进一步将验证后的“RF Genes”与“LASSO Genes”作交集，以获得类风湿关节炎-线粒体自噬(RA-Mitophagy)核心互作基因，并进行Venn图可视化。
1.4.7 预测模型构建及验证基于类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因，通过引用R包“rms”“nomogramFormula”“Hmisc”“rmda”构建二项逻辑回归模型，继而预测个体是否存在患类风湿关节炎的风险。通过绘制Nomogram图将预测模型可视化，并生成预测分数“nomoscore”。同时基于Bootstrap方法对模型进行校准，绘制校准曲线后观察所构建预测模型的拟合效果，从而进行内部验证。最后进行临床决策曲线分析，以评估预测模型的临床效用。
1.4.8 外部患者样本的工作特征曲线验证综合“sva” “tinyarray”“FactoMineR”“factoextra”R包对GSE97779与GSE55235数据集进行去批次合并，并在合并前后进行主成分分析以验证去批次效果，从而制作外部验证所使用的独立验证集。在独立外部验证集中，对预测模型对应的类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因进行诊断效能外部验证。通过“pROC” R函数包绘制受试者工作特征曲线，观察各核心互作基因所对应曲线下面积，当曲线下面积 > 0.6时，代表其诊断效能良好，以确保筛选出的特征基因在实际应用中的稳定性和准确性，以进一步支持核心互作基因在分类任务中的有效性，从而为后续研究提供可靠的依据。
1.4.9 “CIBERSORT”免疫浸润分析结合“MsigDB”数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)22种免疫细胞“gmt”文件数据[17]，并基于“CIBERSORT”“ggpubr” “reshape2”“tidyverse”“preprocessCore”“doParallel”R包函数，深入分析类风湿关节炎样本中的免疫细胞浸润情况，识别出与类风湿关节炎关联性较高的关键免疫细胞类型并分析免疫细胞亚群之间的相关性，继而通过两种可视化手段展示分析结果。
1.4.10 “ssGSEA”单样本-免疫细胞亚群间关联性分析采用“ssGSEA”(Single-sample Gene Set Enrichment Analysis)方法对类风湿关节炎样本进行免疫浸润分析。“ssGSEA”是一种扩展的基因集合富集分析方法，用于评估每个样本中预定义基因集的富集程度，与传统“GSEA”不同，“ssGSEA”可以在单个样本上进行分析，而不是对样本组进行比较。通过“ssGSEA”分析，深入了解每个样本中免疫相关基因集的活性，为类风湿关节炎的免疫机制研究提供重要的参考依据。此研究主要通过R软件“GSVA”及“GSEABase”函数包对样本及相关免疫细胞数据集进行处理分析，获取各样本与免疫细胞亚群间相关性数据，进行样本-免疫细胞相关性热图可视化及分组箱式表达差异可视化。
1.4.11 类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因-免疫细胞亚群间关联性分析采用“ggcorrplot”函数包进行分析，获取核心互作基因与免疫细胞亚群间关联性数据集，然后绘制各个核心互作基因与免疫细胞亚群间相关性“棒棒糖”图，最后利用“linkET”函数包，构建核心互作基因-免疫细胞亚群间关联性网络矩阵图。
1.4.12 基于“ssGSEA”的核心互作基因相关生物学功能分析采用“ssGSEA”方法，结合“MsigDB”数据库中“GO”与“KEGG”通路相关“gmt”文件数据，分析核心互作基因与相关生物学功能之间的关联程度，并筛选出其中与线粒体自噬过程密切相关的基因-功能映射，以从线粒体自噬角度阐明核心互作基因的相关生物学功能，为探索类风湿关节炎的发病机制提供新的视角和理论依据。
1.5 主要观察指标 ①类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因的筛选及关键细胞通路可视化结果；②多机器学习算法下类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因的筛选及验证；③预测模型的构建与外部验证；④核心互作基因与免疫细胞亚群间的关联性及免疫调控过程；⑤核心互作基因与线粒体相关的生物学功能分析结果。
1.6 统计学分析采用R (版本：4.4.1)软件进行数据分析。采用GraphPad Prism (版本：10.3.0)和R (版本：4.4.1)软件进行绘图。实验均重复3次，以非配对t检验进行组间差异比较，以Spearman相关性分析研究基因、免疫细胞、生物学功能或通路间关联程度，P < 0.05为差异有显著性意义。此研究统计学方法由广西中医药大学生物医学专家指导与审核。

讨论

类风湿关节炎是最常见的风湿性疾病之一，其病程隐匿且渐进，常导致关节肿胀和疼痛，最终引发残疾，并带来高昂的社会经济成本[18-21]。尽管传统和靶向抗风湿药物(csDMARD和b/tsDMARD)能够缓解病情，但约40%的患者对这些疗法反应不佳，导致类风湿关节炎被认为是“难治性”疾病[22]。因此，早期诊断和治疗尤为重要，但目前尚无明确的诊断标准[1]，深入研究类风湿关节炎的发病机制并构建预测模型对临床决策具有重大意义。
自噬是指细胞通过自我吞噬降解其成分的过程，分为非选择性和选择性自噬。1967年，DETER等[23]首次提出自噬的概念。线粒体自噬是一种选择性自噬，由LEMASTERS于2005年首次提出，主要通过受体介导的机制靶向降解受损的线粒体，是维持细胞健康的重要过程[24-26]。
在类风湿关节炎的进展中，自噬与成纤维细胞样滑膜细胞的存活密切相关，且抑制自噬可以减少破骨细胞的数量，从而减轻骨侵蚀[27]。此外，与成骨细胞和破骨细胞增殖、分化相关的多种信号通路，包括PINK1/Parkin，均与线粒体自噬的调控过程有关[28]。以上均表明线粒体自噬在骨稳态中发挥重要作用。
然而，线粒体自噬对类风湿关节炎疾病进展的具体影响方式及其中关键机制目前尚未清晰，此研究综合“GEO DataSets”数据库、“MitoCarta3.0”数据库、“MsigDB”数据库数据，利用多种机器学习算法成功筛选出4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因，同时考虑核心互作基因可能与类风湿关节炎疾病进展中的关键发病机制密切相关，建立诊断风险模型，并利用外部类风湿关节炎患者及正常人的巨噬细胞转录组数据进行代入验证，进一步通过免疫浸润分析类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因与免疫细胞亚群间的互作关系，以解析探讨线粒体自噬在类风湿关节炎疾病中的作用机制。
类风湿关节炎-线粒体自噬相关基因的“GO”“KEGG”富集分析结果十分明确，其中以线粒体自噬、电子传递链、含蛋白线粒体复合物、线粒体内膜、线粒体基质、线粒体呼吸体、坏死性凋亡相关细胞组分与过程最为重要。电子传递链包括复合物Ⅰ-Ⅳ，这些复合物在线粒体内膜上排列，负责电子的传递和ATP的生成，线粒体自噬通过清除受损的线粒体复合物，防止活性氧的过度积累[29]。
受损的线粒体通常会产生过量的活性氧，这些活性氧可以通过氧化线粒体DNA、蛋白质和脂质，进一步加剧细胞损伤和炎症反应[30]。此外，线粒体自噬与坏死性凋亡的关系也已被证实，线粒体自噬通过清除产生过量活性氧的线粒体，可以抑制坏死性凋亡的发生[31]，这在类风湿关节炎中尤为重要，因为滑膜细胞中的线粒体功能障碍和活性氧积累可以触发坏死性凋亡，导致滑膜组织的进一步破坏和炎症加剧。
目前有关类风湿关节炎的研究十分庞杂，包括铁死亡、铜死亡等热点[32-33]。但对于线粒体自噬在类风湿关节炎发病过程中相关基因层面的研究较少，此研究通过“WGCNA”分析及“RF”“LASSO”“GMM”多机器学习算法构建可靠的诊断模型，模型特征基因包括DNAJA3、C12orf65、AKR7A2、PDHB，该模型在训练集以及外部样本验证数据中均表现出良好的预测性能，同时也为类风湿关节炎中线粒体自噬的发生、发展机制过程提供新的见解。
关于核心互作基因DNAJA3，在免疫调控方面发现其与记忆B细胞、调节性T细胞正相关性较强，与M0型巨噬细胞、活化的记忆性CD4 T细胞负相关性最强。已有研究证实，DNAJA3在增强免疫记忆和维持免疫耐受中具有重要作用，其缺失可能导致免疫功能紊乱，尤其影响B细胞的发育和功能，同时会导致线粒体质量和膜电位的改变[34]。研究发现，线粒体功能障碍可能导致DNAJA3的异常积累，同时伴有多种干扰素刺激基因(如Ifi44和Gbp3)以及模式识别受体和胞质核酸传感器(如Ddx58和Ifih1)的显著表达，继而激活先天免疫反应，这表明DNAJA3在调节线粒体应激和免疫反应中扮演着重要角色[35]。此外，还有研究表明DNAJA3能够影响线粒体蛋白质折叠过程，从而影响线粒体的正常功能[36]。但目前尚无有关DNAJA3通过影响线粒体自噬而影响类风湿关节炎发病过程的研究，此研究的筛选结果可作为类风湿关节炎临床研究的一个新的切入方向。
对于核心互作基因PDHB，在免疫调控过程中发现其同样与记忆B细胞、调节性T细胞正相关性最强，但相较DNAJA3新增了与中性粒细胞的高负相关性。有研究发现，PDHB基因在丙酮酸脱氢酶复合体中起关键作用，该复合体对于丙酮酸转化为乙酰辅酶A的过程至关重要，而类风湿关节炎患者PDHB基因的表达下调，表明它可能在类风湿关节炎的病理机制中起相关作用[37]。另有研究表明，在类风湿关节炎疾病进展中，PDHB可能通过影响细胞能量代谢和氧化应激反应参与细胞死亡过程，尤其与铜离子的应激反应密切相关[38]。然而，对于PDHB、线粒体自噬和类风湿关节炎的共同作用方式目前仍无相关研究，此研究结果可为其提供新的参考。
此研究发现C12orf65是另外一个重要的类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因，目前相关研究仅发现其通过影响线粒体核糖体相关的质量控制机制而影响线粒体的正常功能[39]。此外，目前尚无AKR7A2基因、线粒体自噬与类风湿关节炎共同作用的研究。C12orf65与AKR7A2对于类风湿关节炎诊断预测的临床价值有待进一步更深入的研究证实。
此研究通过免疫浸润研究及构建核心互作基因-免疫细胞亚群关联性网络矩阵图发现，在类风湿关节炎线粒体自噬过程中，以记忆B细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、调节性T细胞、M0型巨噬细胞、中性粒细胞的参与最为频繁，可能考虑作为免疫调控过程中的核心免疫细胞。恰有相关研究表明，线粒体代谢与T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞有重要相关作用[40]。另有学者表明，先天免疫激活是线粒体功能障碍直接或间接影响类风湿关节炎发病的一大重要方式，在这个过程中T细胞受到异常氧化磷酸化途径的影响而加剧炎症反应，巨噬细胞代谢表型发生改变而降低骨稳态[41]。通过系列现有研究，可以发现免疫细胞的调控与类风湿关节炎的发病及线粒体自噬息息相关。
此外，还基于“ssGSEA”算法进行了核心互作基因的相关生物学功能分析，发现机器学习算法所筛选出的4个类风湿关节炎-线粒体自噬核心互作基因与广泛的生物学功能和信号通路之间存在着错综复杂的关联。有关线粒体功能方面，DNAJA3表达上调与线粒体DNA的复制、代谢、基因组维护的正向调控密切相关，PDHB表达上调则与线粒体DNA的修复和去极化的正向调控显著相关，但就参与凋亡信号通路的线粒体外膜通透性的正向调控这一过程而言，C12orf65和DNAJA3均表现出强负相关性。作者考虑这可能与疾病状态下机体宏观生理稳态的自我调节有关，具体反映在线粒体自噬加速以维持细胞微观稳态的需求。然而，目前尚无明确的研究能够证实这一推论，这一领域仍需进一步深入探索。
与既往研究相比，此研究的优势体现在首次将高斯混合模型应用于疾病靶点基因的筛选领域。此前尚无文献报道“GMM”机器学习算法用于此类基因研究，而该研究将其与“RF”机器学习算法和“LASSO”机器学习算法相结合，确保了基因筛选的可靠性和诊断模型的稳健性，进一步拓展了机器学习在疾病靶点基因筛选中的应用，这也为探索线粒体自噬在类风湿关节炎中的作用机制提供了重要的技术基础。
综上所述，此研究综合多种机器学习算法，筛选出类风湿关节炎中与线粒体自噬相关的核心互作基因DNAJA3、C12orf65、AKR7A2和PDHB，并作为疾病诊断标志物而构建了稳健的疾病预测模型。通过进一步分析免疫调控过程，发现类风湿关节炎中线粒体自噬与记忆B细胞、M0型巨噬细胞、活化的记忆性CD4 T细胞、静息态记忆性CD4 T细胞显著相关。生物学功能分析表明，核心互作基因与线粒体DNA代谢、DNA修复、DNA复制、基因组维护以及线粒体去极化的正向调控密切相关，同时还参与了凋亡信号通路中线粒体外膜通透性的正向调控。这些发现不仅为类风湿关节炎的诊断提供了新的分子标志物，也为未来的治疗策略提供了潜在的靶点，对提升类风湿关节炎的精准诊断和个性化治疗具有重要意义，为类风湿关节炎的早期临床诊断和干预及机制探索提供了崭新切入点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

线粒体自噬视域下的类风湿关节炎：基于多机器学习算法的互作分析

Rheumatoid arthritis from the perspective of mitophagy: interaction analysis based on multiple machine learning algorithms

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