芦荟素减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤：抑制氧化应激和铁死亡

doi:10.12307/2025.525

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5335-5344.doi: 10.12307/2025.525

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芦荟素减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤：抑制氧化应激和铁死亡

谭铭月1，金奕丰2，张俊1，李红霞1

苏州大学附属第一医院，1心血管内科，2全科医学科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2024-03-26 接受日期:2024-06-11 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-21
通讯作者: 李红霞，主任技师，苏州大学附属第一医院心血管内科，江苏省苏州市 215006
作者简介:谭铭月，女，1994年生，四川省广安市人，汉族，硕士，医师，主要从事心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤及相关基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81100173)，项目负责人：李红霞

Aloin mitigates hypoxic injury in rat cardiomyocytes: inhibiting oxidative stress and ferroptosis

Tan Mingyue1, Jin Yifeng2, Zhang Jun1, Li Hongxia1

1Department of Cardiology, 2Department of General Medicine, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2024-03-26 Accepted:2024-06-11 Online:2025-09-08 Published:2024-12-21
Contact: Li Hongxia, Chief technician, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Tan Mingyue, Master, Physician, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81100173 (to LHX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

芦荟素：一种从芦荟中提取的蒽醌化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，在肺损伤、心肌缺血再灌注损伤、肝脏纤维化、非酒精性肝炎等疾病的动物模型中均发挥保护作用。
心肌细胞缺氧损伤：由于各种原因导致冠状动脉血流量降低，使得心肌细胞的氧供应不足和代谢产物清除减少，这种状态会触发一系列复杂的生物学反应，包括炎症反应、氧化应激以及细胞死亡等，这些过程相互作用，加剧心肌细胞的损伤，进而影响心脏的正常
功能。

摘要
背景：心肌细胞缺氧损伤与氧化应激和铁死亡密切有关。既往研究表明芦荟素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种作用。
目的：探讨芦荟素对缺氧诱导的H9C2细胞氧化应激及铁死亡的影响。
方法：利用H9C2细胞构建缺氧模型，首先通过检测细胞活性，确定芦荟素无细胞毒性及最佳干预浓度。随后，利用试剂盒、超氧化物阴离子荧光探针及MitoSOXTM Red荧光探针，分别评估芦荟素对缺氧诱导的H9C2细胞乳酸脱氢酶释放、活性氧产生以及线粒体氧化应激的影响。为了验证芦荟素对铁死亡的影响，采用荧光染色和流式细胞术，分别检测细胞内Fe2+的含量和脂质过氧化程度。接着，利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR技术，检测铁死亡调节因子(谷胱甘肽过氧化物酶4、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4和核因子E2相关因子2)的表达。最后，通过运用铁死亡诱导剂Erastin，进一步确认铁死亡在芦荟素介导心肌保护过程中的重要作用。

结果与结论：①与对照组相比，缺氧组H9C2细胞活力显著降低，乳酸脱氢酶释放、活性氧水平、线粒体氧化应激程度、Fe2+含量及脂质过氧化程度显著上升，谷胱甘肽过氧化物酶4、核因子E2相关因子2的mRNA和蛋白表达明显降低，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4的mRNA和蛋白表达显著升高(均P < 0.05)；②与缺氧组比较，芦荟素低、高剂量组逆转了上述指标变化(均P < 0.05)；③与缺氧+芦荟素组相比，缺氧+芦荟素+Erastin组H9C2细胞活力明显下降，乳酸脱氢酶释放显著升高(均P < 0.01)。结果表明，芦荟素对缺氧处理的H9C2细胞具有保护作用，且呈剂量依赖性，主要通过抑制氧化应激和铁死亡实现的。

https://orcid.org/0009-0002-4473-0120 (谭铭月)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 芦荟素, 心肌细胞缺氧损伤, 氧化应激, 铁死亡, 线粒体

Abstract: BACKGROUND: Myocardial cell hypoxic injury is closely associated with oxidative stress and ferroptosis. Previous studies have shown that aloin has various effects such as antioxidant, anti-inflammatory, and anti-tumor activities.
OBJECTIVE: To investigate the effects of aloin on oxidative stress and ferroptosis in hypoxia-induced H9C2 cells.
METHODS: A hypoxia model was established using H9C2 myocardial cells. Firstly, cell viability was determined to confirm the lack of cytotoxicity of aloin and to determine its optimal therapeutic concentration. Subsequently, the effects of aloin on hypoxia-induced lactate dehydrogenase release, reactive oxygen species production, and mitochondrial oxidative stress in H9C2 cells were evaluated using assay kits, dihydroethidium fluorescent probes, and MitoSOX™ Red fluorescent probes, respectively. To verify the effect of aloin on ferroptosis, intracellular Fe2+ content and lipid peroxidation level were detected using fluorescence staining and flow cytometry, respectively. Then, the expression levels of ferroptosis regulatory factors glutathione peroxidase 4, acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, and nuclear factor E2-related factor 2 were detected using western blot assay and real-time fluorescence quantitative PCR techniques. Finally, the role of ferroptosis in aloin-mediated myocardial protection was further confirmed by using the ferroptosis inducer Erastin.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the viability of H9C2 cells in the hypoxia group was significantly decreased, lactate dehydrogenase release, reactive oxygen species level, mitochondrial oxidative stress degree, Fe2+ content, and lipid peroxidation degree were significantly increased, while glutathione peroxidase 4 and nuclear factor E2-related factor 2 mRNA and protein expression levels were significantly decreased, and acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 mRNA and protein expression were significantly increased (all P < 0.05). (2) Compared with the hypoxia group, both low and high doses of aloin reversed the changes in above indicators (all P < 0.05). (3) Compared with the hypoxia+aloin group, the hypoxia+aloin+Erastin group showed a significant decrease in H9C2 cell viability and a significant increase in lactate dehydrogenase release (both P < 0.01). The results indicate that aloin has a protective effect on hypoxia-treated H9C2 cells in a dose-dependent manner, mainly achieved by inhibiting oxidative stress and ferroptosis.

Key words: aloin, myocardial cell hypoxic injury, oxidative stress, ferroptosis, mitochondria

中图分类号:

谭铭月, 金奕丰, 张俊, 李红霞. 芦荟素减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤：抑制氧化应激和铁死亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5335-5344.

Tan Mingyue, Jin Yifeng, Zhang Jun, Li Hongxia. Aloin mitigates hypoxic injury in rat cardiomyocytes: inhibiting oxidative stress and ferroptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5335-5344.

图/表（结果） 2

2.1 芦荟素对H9C2细胞活力的影响 芦荟素是从芦荟植物中分离出的蒽醌化合物(分子结构式见图1A)，它是食品中常见的“天然香料”[24]。
为明确芦荟素的安全性，使用不同浓度(0，5，10，20，50，100，150，200，250，300 μmol/L)芦荟素对H9C2细胞进行24 h干预。然后，使用CCK-8法检测细胞活力。结果显示，与未接受处理的对照组(0 μmol/L)相比，当芦荟素浓度在0-200 μmol/L 范围内时，细胞活力并未出现显著变化(P > 0.05)，见图1B。然而，芦荟素浓度达到250，300 μmol/L时，细胞活力显著下降(P < 0.05，P < 0.001)，见图1B。由此可见，在0-200 μmol/L的浓度范围内，芦荟素对H9C2细胞的毒性作用极小。基于这一结果，后续的实验将集中在这一浓度范围内，以探寻芦荟素对H9C2细胞的最佳治疗浓度。
2.2 不同浓度芦荟素对缺氧条件下H9C2细胞活力及乳酸脱氢酶释放的影响
2.2.1 确定药物干预浓度 将缺氧诱导的H9C2细胞与不同浓度的芦荟素(0，5，10，20，50，100，150，200 μmol/L)
共培养24 h，使用CCK-8法检测细胞活力。缺氧导致H9C2细胞活力显著下降(P < 0.001)。与未经芦荟素处理的H9C2细胞相比，当芦荟素浓度处于5 μmol/L时，细胞活力并未出现明显变化(P > 0.05)；当芦荟素浓度升至10，20，50，100，150，200 μmol/L时，H9C2细胞活力逐渐恢复(P < 0.05，P < 0.001)，见图2A。值得注意的是，在50，100，150，200 μmol/L芦荟素处理组之间，细胞活力未观察到明显差异(P > 0.05)。50 μmol/L处理组的细胞活力优于20 μmol/L处理组(P < 0.05)。因此，选择20，50 μmol/L作为后续实验的芦荟素低、高浓度。
2.2.2 乳酸脱氢酶释放情况 与对照组相比，缺氧组H9C2细胞乳酸脱氢酶释放显著升高(P < 0.001)；与缺氧组相比，使用20，50 μmol/L芦荟素处理后乳酸脱氢酶释放明显减少(P < 0.01，P < 0.001)，并且芦荟素高剂量组对乳酸脱氢酶释放的抑制作用强于芦荟素低剂量组(P < 0.05)，见图2B。
2.3 芦荟素对缺氧条件下H9C2细胞内活性氧生成及线粒体氧化应激的影响
2.3.1 活性氧生成 超氧化物阴离子(DHE)荧光探针检测H9C2心肌细胞活性氧水平，与对照组相比，缺氧组H9C2细胞内荧光强度显著增加(P < 0.001)，这说明细胞中活性氧生成显著增加；与缺氧组相比，芦荟素组细胞内荧光强度均明显降低(P < 0.001)，且芦荟素高剂量组的荧光强度低于芦荟素低剂量组(P < 0.001)，见图3A，B。这一结果说明，20，50 μmol/L芦荟素均能抑制细胞内活性氧生成，且这种抑制作用呈剂量依赖性。
2.3.2 线粒体氧化应激 采用MitoSOX Red荧光探针检测H9C2细胞线粒体中氧化应激情况。MitoSOX染色结果显示，缺氧可诱导H9C2细胞内线粒体氧化应激程度明显升高(P < 0.001)，使用芦荟素干预后细胞内线粒体氧化应激相较于缺氧组均降低(P < 0.001)；芦荟素高剂量组对线粒体氧化应激的抑制作用强于芦荟素低剂量组(P < 0.01)，见图3C，D。
2.4 芦荟素对缺氧条件下H9C2细胞内亚铁含量的影响 细胞内铁超载是铁死亡的驱动因子，也是铁死亡的主要特征之一。利用对Fe2+敏感的荧光染料FerroOrange来检测H9C2细胞内Fe2+的水平。FerroOrange染色结果表明，与对照组相比，缺氧组的H9C2细胞内荧光强度显著增强(P < 0.001)，这说明缺氧损伤会导致H9C2细胞内Fe2+含量增加。然而，经20，50 μmol/L芦荟素处理后，H9C2细胞内的荧光强度均明显降低(P < 0.001)；芦荟素高剂量组的荧光强度低于芦荟素低剂量组(P < 0.01)，见图4。这一结果说明，芦荟素可以有效降低细胞内亚铁累积，而且50 μmol/L芦荟素降低效果更好。

2.5 芦荟素对缺氧处理的H9C2细胞脂质过氧化程度的影响 脂质过氧化累积是铁死亡的核心特征之一。通过脂质过氧化荧光探针C11 BODIPY染色并使用流式细胞术检测荧光强度。结果显示，与对照组相比，缺氧组H9C2细胞内荧光强度显著增强(P < 0.001)，这表明缺氧损伤会明显加剧H9C2细胞内的脂质过氧化程度。与缺氧组相比，芦荟素干预明显逆转了脂质过氧化的上升(P < 0.001)，其中芦荟素高剂量组的效果优于芦荟素低剂量组(P < 0.001)，见图5。
2.6 芦荟素对缺氧条件下H9C2细胞中铁死亡相关mRNA表达的影响 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结果显示，与对照组相比，缺氧组细胞中Nrf2、GPX4 mRNA表达水平均显著下调(P < 0.001)，而ACSL4 mRNA表达水平明显上调(P < 0.001)；芦荟素低剂量组的Nrf2 mRNA表达与缺氧组相比无明显变化(P > 0.05)，但芦荟素高剂量组Nrf2 mRNA表达水平显著上升(P < 0.001)，并且与低剂量组相比也显示出统计学差异(P < 0.05)；与缺氧组相比，芦荟素干预组的GPX4 mRNA表达水平均升高(P < 0.05，P < 0.001)，ACSL4 mRNA表达水平均降低(P < 0.001)，且芦荟素高剂量组对GPX4和ACSL4的调控效果强于芦荟素低剂量组(P < 0.01)，见图6。
2.7 芦荟素对缺氧H9C2细胞中铁死亡相关蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，与对照组相比，缺氧组Nrf2与GPX4的蛋白表达明显降低(P < 0.01，P < 0.001)，ACSL4的蛋白表达显著升高(P < 0.01)；与缺氧组相比，经芦荟素处理后，GPX4的蛋白表达均升高(P < 0.05，P < 0.001)，且这种促进作用呈剂量依赖性(P < 0.05)；芦荟素低剂量组的Nrf2与ACSL4蛋白表达相较于缺氧组差异无显著性意义(P > 0.05)，芦荟素高剂量组的Nrf2蛋白表达显著升高(P < 0.01)，ACSL4蛋白表达明显下降(P < 0.01)，见图7。
2.8 芦荟素通过抑制铁死亡改善H9C2细胞缺氧损伤
2.8.1 确定Erastin干预浓度 上述实验明确了芦荟素能够有效抑制由缺氧引发的H9C2细胞铁死亡。为了深入探究芦荟素是否通过抑制铁死亡来保护H9C2细胞，使用铁死亡诱导剂Erastin进行了研究。在实验中，选用了不同浓度的Erastin(0，1，2.5，5，10 μmol/L)对H9C2细胞进行24 h的干预处理。通过CCK-8法检测细胞活力。实验结果显示，与未接受Erastin处理的对照组(0 μmol/L)相比，当Erastin浓度为1 μmol/L时，对细胞活力并无显著影响(P > 0.05)；然而，当浓度提高到2.5，5，10 μmol/L时，细胞活力出现明显下降(P < 0.001)，见图8A。基于上述结果，选择2.5 μmol/L Erastin进行后续实验。
2.8.2 Erastin对芦荟素干预的H9C2细胞活力及乳酸脱氢酶释放的影响 为了验证铁死亡诱导剂Erastin是否确实能够逆转芦荟素对缺氧细胞的保护作用，在芦荟素(50 μmol/L)治疗的基础上，加入了铁死亡诱导剂Erastin(2.5 μmol/L) 进行干预。与缺氧+芦荟素组对比，缺氧+芦荟素+Erastin组的细胞活力显著下降(P < 0.001)，乳酸脱氢酶释放明显升高(P < 0.01)，见图8B，C。这一结果表明芦荟素是通过抑制铁死亡改善H9C2细胞的缺氧损伤。

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引言

缺血性心脏病及其远期并发症心力衰竭是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因[1]。心肌梗死是缺血性心脏病中最严重的一种[2]。细胞死亡与心肌梗死和心力衰竭的发病机制密切相关[1]。由于成年心肌细胞不可再生，受损的心脏组织会被纤维化瘢痕组织逐渐替代[3]，这一过程最终会导致心脏重塑及心力衰竭[3-4]。尽管目前的治疗手段(包括介入治疗和手术治疗)已有所进展，但心肌梗死后心力衰竭的长期预后依然不容乐观[5]。
在过去的几十年中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的细胞凋亡一直是心血管疾病机制研究和药物开发的焦点[6]。近年来，铁死亡这种铁依赖性的程序性细胞死亡形式逐渐引起了研究者的广泛关注，其特征是活性氧大量释放和脂质过氧化物过度积累[7]。越来越多的研究已证实，铁死亡是心血管疾病发展的重要驱动因素，包括多柔比星诱导的心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死和心力衰竭[8]。原发性和继发性铁超载都可以通过氧化损伤引起心脏病[8]。另外，临床研究也表明，在ST段抬高型心肌梗死患者的心肌中存在铁超载现象，与不良心脏重构相关[9]。值得注意的是，相较于其他器官内的细胞，心肌细胞中含有较高比例的多不饱和脂肪酸，这些脂肪酸容易被氧化成脂质过氧化物，这可能会进一步促进铁死亡现象的发生[10]。在大鼠心肌梗死模型中，铁死亡抑制剂Fer-1或铁螯合剂均能显著减轻心肌损伤和减小心肌梗死面积[4]。因此，寻找有效的方式来抑制心肌细胞铁死亡，可能是一个重要的心脏保护策略。
铁死亡可以被视为氧化应激和抗氧化系统失调的结果。一方面，由于铁代谢失衡(铁的吸收增加、铁的储存和排出减少)，细胞内游离铁池中的亚铁蓄积，进一步通过芬顿反应产生过多的羟自由基(OH-)，羟自由基可以攻击脂质膜上多不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，对细胞造成损害[11-12]。另一方面，失活或不足的抗氧化系统无法清除脂质过氧化物，从而导致脂质过氧化的无限扩张，最终导致铁死亡[11，13]。转铁蛋白受体蛋白1是一种细胞膜上的跨膜糖蛋白，负责并介导细胞从外部环境中摄取铁离子[14]。在心肌缺血再灌注大鼠模型中，泛素特异性蛋白酶7的活性增加会导致转铁蛋白受体蛋白1表达上升，进而促进铁死亡的发生。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3参与激活脂质膜的生物合成和重塑，激活多不饱和脂肪酸并影响多不饱和脂肪酸的跨膜特性[15]，它们也是铁死亡的重要驱动因素[16]。ACSL4催化花生四烯酸和其他多不饱和脂肪酸乙酰化，而溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3催化这些乙酰化的多不饱和脂肪酸进入膜磷脂[17]。ACSL4表达/活性的增加可能会在各种病理生理背景下促进铁死亡[16]；相反，抑制ACSL4的表达会减少脂质过氧化和铁死亡[17-18]；谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)作为抗氧化系统的核心酶，在铁死亡过程中其表达水平显著下降[19]。GPX4负责还原膜相关脂质氧化物，从而有效去除脂质活性氧[20]，这一过程需要谷胱甘肽参与。谷胱甘肽的合成依赖于半胱氨酸，当胱氨酸/谷氨酸转运蛋白被抑制或半胱氨酸不足时，会导致谷胱甘肽消耗增加和GPX4的活性下降，进而可能引发铁死亡[3]。
芦荟素是从传统药用植物芦荟中提取的蒽醌化合物，具备抗氧化、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等多种生物活性，在肝脏、肺、心脏等器官中均发挥着重要的保护作用[21-25]。据报道，芦荟素可以通过激活核因子E2相关因子2 (nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)通路减轻心肌细胞缺血再灌注损伤和饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎[23-24]。值得注意的是，Nrf2蛋白在调控脂质过氧化和铁死亡过程中起着关键作用[26]。另外有研究指出，芦荟素在多种损伤模型中具有抑制脂质过氧化物累积的能力，包括缺血再灌注诱导的心肌损伤、葡萄糖剥夺诱导的PC12细胞损伤、缺血再灌注诱导的肝脏损伤及脂多糖诱导的急性肺损伤[21-23，27]，这些研究结果均表明，芦荟素具有抗铁死亡的潜力。
基于此，该研究通过构建H9C2心肌细胞缺氧模型，模拟心肌缺血的病理环境，旨在深入探究芦荟素通过抑制铁死亡减轻心肌细胞缺氧所造成的损伤，这为临床治疗缺血性心脏病提供实验理论基础，为未来的药物研发和治疗策略提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验，多组间均数比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2023年2月至2024年2月在苏州大学附属第一医院心内科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 H9C2细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
1.3.2 实验药物 芦荟素、铁死亡诱导剂Erastin从MCE公司购买，货号HY-N0123、HY-15763。
1.3.3 实验试剂 DMEM高糖/无糖培养基、PBS购自语纯生物(中国)；胎牛血清购自依科赛生物(中国)；CCK-8检测试剂盒、乳酸脱氢酶检测试剂盒和超氧化物阴离子(DHE)荧光探针购自碧云天(中国)；MitoSOXTM Red荧光探针、C11 BODIPYTM 581/591荧光探针购自Thermo(美国)；FerroOrange购自同仁化学(日本)；Abclonal反转录试剂盒(包括gDNA Remover和ABScript III RT Master Mix)、2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒、兔源抗β-actin抗体、兔源抗GPX4抗体、兔源抗Nrf2抗体、HRP结合的山羊抗兔IgG抗体购自爱博泰克(中国)；兔源抗ACSL4抗体购自Abcam(美国)；RNA提取试剂盒购自诺维赞(中国)；FDbio-Femto ECL发光液购自弗德生物(中国)。
1.3.4 实验仪器 PCR仪、实时荧光定量 PCR仪、酶标仪、NanoDrop One分光光度计购自Thermo (美国)；垂直电泳仪、化学发光凝胶成像系统购自Bio-Rad公司(美国)；倒置光学显微镜(IX71)购自Olympus(日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养及分组 H9C2细胞在含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基(完全培养基)中，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养。当H9C2细胞传至第3代并确保细胞状态良好，生长密度达到70%-80%后进行铺板，贴壁生长24 h后，随机分为以下各组进行实验：对照组、缺氧组、芦荟素低剂量组(20 μmol/L)、芦荟素高剂量组(50 μmol/L)，通过检测细胞活力、乳酸脱氢酶释放水平、铁死亡相关指标、活性氧水平、线粒体氧化应激程度等，评估芦荟素在缺氧条件下的细胞保护作用。为了进一步探究铁死亡在芦荟素心肌保护效应中的作用，还设计了另一组实验，包括对照组、缺氧组、缺氧+芦荟素组(芦荟素治疗组，浓度为50 μmol/L)以及缺氧+芦荟素+Erastin组(Erastin干预组，浓度为2.5 μmol/L)，在这部分实验中，在给予芦荟素治疗的基础上，引入了铁死亡诱导剂Erastin，通过检测细胞活力和乳酸脱氢酶的释放量，明确Erastin对芦荟素心肌保护作用的潜在影响。
1.4.2 缺氧模型构建及药物干预 ①H9C2细胞生长融合至70%-80%时，使用PBS浸洗细胞2次，以除去多余血清及高糖培养基；②用无糖、无血清的DMEM培养基替换完全培养基，以消除培养基中的营养物质和生长因子，在体外模拟心肌缺血时的代谢状态；③将细胞置于含有特定气体比例(体积分数1% O2、4% CO2、95% N2)的 CO2 细胞培养箱中培养24 h，在体外模拟心肌缺血时的缺氧环境。
对照组：仅加含有50 μmol/L二甲基亚砜的完全培养基，不进行缺氧操作；缺氧组：在进行细胞缺氧操作时，使用含50 μmol/L二甲基亚砜的无糖、无血清的DMEM培养基；芦荟素低剂量组和高剂量组：在进行细胞缺氧操作时，分别使用含20，50 μmol/L芦荟素的无糖、无血清的DMEM培养基；Erastin干预组：在进行细胞缺氧操作时，使用含有50 μmol/L芦荟素和2.5 μmol/L Erastin的无糖、无血清的DMEM培养基。芦荟素溶解于二甲基亚砜中，配成10 mmol/L的母液，使用无糖、无血清DMEM培养基稀释，使最终处理浓度为 25，50 μmol/L。
1.4.3 药物毒性检测 将H9C2细胞以8×103个/孔密度铺板于96孔板，贴壁生长24 h后，每孔加入100 μL含不同浓度(0，5，10，20，50，100，150，200，250，300 μmol/L)芦荟素的完全培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养24 h。然后，向每孔加入90 μL DMEM完全培养基与10 μL CCK-8试剂的混合液，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中避光孵育2 h。孵育结束后，在全波长酶标仪450 nm波长下测量各孔的吸光度值。最后，根据测得的吸光度值，计算细胞的存活率。
计算公式为：细胞存活率(%)=[实验孔吸光度值/对照孔吸光度值]×100%。
1.4.4 细胞活力检测 将第3-15代状态良好的H9C2细胞以8×103个/孔密度铺板于96孔板，贴壁生长24 h后，每孔加入100 μL含不同浓度(0，5，10，20，50，100，150，200 μmol/L)芦荟素的无糖、无血清的DMEM培养基，在缺氧环境下(体积分数1% O2、4% CO2、95% N2)培养24 h；对照组仅加完全培养基，不进行缺氧操作，其余步骤同1.4.3。
1.4.5 乳酸脱氢酶释放测定 将H9C2细胞以8×103个/孔密度铺板于96孔板，贴壁生长24 h后，根据实验分组处理细胞后，使用乳酸脱氢酶检测试剂盒，按照说明书添加试剂并进行相应操作后，用酶标仪测定各孔吸光度值，检测波长490 nm，参考波长600 nm。最后，根据吸光度值计算乳酸脱氢酶释放水平。
1.4.6 超氧化物阴离子荧光染色 将H9C2细胞以5×104个/孔密度铺板于24孔板，贴壁生长24 h。按照实验分组处理细胞后，用5 μmol/L超氧化物阴离子荧光探针与处理后的细胞在37 ℃孵育30 min。孵育结束后，用无血清DMEM浸洗细胞3次，使用荧光显微镜实时观察并拍照记录，通过Image J软件量化平均荧光强度。
1.4.7 MitoSOX™ Red荧光染色将H9C2细胞以5×104个/孔密度铺板于24孔板，贴壁生长24 h。按照实验分组处理细胞后，将细胞与5 μmol/L的MitoSOX探针在37 ℃下避光孵育10 min，在560 nm波长处使用荧光显微镜实时观察并拍照，通过Image J软件对MitoSOX的平均荧光强度进行量化。
1.4.8 FerroOrange荧光染色 将H9C2细胞以5×104个/孔密度铺板于24孔板，贴壁生长24 h。按照实验分组处理细胞后，将H9C2细胞与10 μmol/L FerroOrange探针在37 ℃孵育20 min，利用荧光显微镜实时观察并拍照，使用 Image J软件对细胞内FerroOrange的荧光强度进行量化。
1.4.9 C11 BODIPYTM 581/591荧光染色 将H9C2细胞以3×105个/孔密度铺板于6 cm细胞培养皿中，贴壁生长24 h，按照实验分组处理细胞后，在细胞培养皿中加入3 mL浓度为5 μmol/L的C11 BODIPYTM，37 ℃下避光孵育1 h，PBS浸洗细胞2次，然后用0.125%胰酶消化1 min，待细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止消化，吹打使细胞脱落，收集至EP管，1 200×g离心3 min沉淀细胞，弃上清液，用含体积分数2%胎牛血清的PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测荧光强度，利用Flowjo软件进行量化分析。

1.4.10 实时荧光定量PCR检测mRNA表达水平 将H9C2细胞以1×105/孔的密度铺板于6孔板中，贴壁生长24 h，按照实验分组处理细胞后，使用RNA提取试剂盒提取细胞总mRNA，用NanoDrop One分光光度计测定其浓度。根据上述所测得的mRNA浓度计算反转录所需RNA体积(A=1 000/浓度，A为所需RNA体积)，然后加入1 μL gDNA Remover、4 μL 20×gDNA Remover Mix、15-A μL Nuclease-free H2O，在PCR仪上将mRNA反转录为cDNA，反应条件为首先在37 ℃持续2 min，然后升温至55 ℃维持15 min，接着升温至85 ℃保持5 min，最后降至4 ℃并保持。随后，将2.5 μL引物、5 μL 2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix和2.5 μL cDNA混合，使用实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应条件为95 ℃预变性3 min；随后进入扩增循环，每个循环包括95 ℃变性5 s和60 ℃退火/延伸34 s，共40个循环。使用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量(ΔCt=目的基因Ct值均值-内参基因Ct值均值；ΔΔCt=ΔCt-对照组ΔCt值均值)。引物由课题组自行设计，委托上海生工生物有限公司合成，见表1。

1.4.11 Western blot检测蛋白表达水平 将H9C2细胞以3×105个/孔密度铺板于6 cm细胞培养皿中，贴壁生长24 h，按照实验分组处理细胞后，以每1×106细胞加入0.1 mL裂解液的比例进行裂解；在4 ℃条件下以12 000×g离心裂解液10 min，收集上清液以备后续实验使用；将上清液与5×loading buffer按一定比例混合后，置于95 ℃水浴中加热变性15 min；使用12.5% SDS-PAGE凝胶进行电泳，分离蛋白质，随后将分离的蛋白质转移至0.22 mm的PVDF膜上；用5% BSA在室温封闭PVDF膜1 h，TBST洗涤1次；将PVDF膜与一抗(兔源抗GPX4/ACLS4/Nrf2/β-actin抗体，稀释比例为1∶1 000)在4 ℃孵育过夜；第2天，用TBST洗涤3次，将膜与二抗(HRP 结合的山羊抗兔 IgG，稀释比例为1∶10 000)在室温下孵育1.0-1.5 h；再次用TBST洗涤膜3次，最后在膜上均匀滴加FDbio-Femto ECL发光液，使用凝胶成像仪查看目标蛋白。所得结果利用Image J软件进行分析，并使用β-actin计算蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①H9C2细胞活力和乳酸脱氢酶释放水平；②H9C2细胞的活性氧水平、线粒体氧化应激程度；③H9C2细胞中铁死亡相关指标：Fe2+水平、脂质过氧化程度、Nrf2、GPX4及ACSL4的转录和蛋白水平。

1.6 统计学分析 该研究中的数据代表至少3个独立的实验。采用GraphPad Prism 8.0软件(San Diego，CA，美国)进行统计分析。首先检验正态分布，然后采用Levene’s法进行方差齐性检验。两组以上数据的比较采用one-way ANOVA和Tukey’s事后多重比较校正。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经由苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

长期心肌缺血严重损伤心脏，导致心肌细胞大量丧失和不良重塑，对心脏结构和功能造成不可逆损害，最终会导致心肌收缩力减弱和心肌梗死后心力衰竭发生[5]。缺血性心脏病是全球范围内导致死亡的主要原因，而且还在持续推高医疗保健成本[28]。因此，迫切需要确定新的功能靶点或研发新的药物，以有效挽救心肌缺血造成的损伤。传统中药中蕴含着许多具有医疗效用或生理活性的单体化合物，这些化合物在心血管疾病相关药物开发中是一个不可或缺的宝库。芦荟素是源自“芦荟”的蒽醌化合物，具有广泛的药理作用。例如：芦荟素通过抑制氧化应激和纤维化改善病理性心肌肥大[25]；芦荟素通过减少炎症和氧化应激减轻脂多糖诱导的急性肺损
伤[22]。在该研究中，首先通过测定细胞活力和乳酸脱氢酶释放评估芦荟素对H9C2心肌细胞的保护作用，结果表明芦荟素减轻了缺氧导致的H9C2细胞损伤。
氧化应激是心肌缺血损伤的重要发病机制[29]。缺氧诱导的持续性病理刺激会使活性氧产生过多，伴有抗氧化剂水平降低，导致氧化应激[30]。在病理条件下，活性氧大量的产生主要是由线粒体电子传递链紊乱导致的。研究显示，线粒体活性氧的过度生成会直接导致心肌细胞受损，并在急性心肌梗死后进一步加剧心肌损伤[31-32]。
过量的活性氧对心脏细胞具有极强的破坏作用，能够破坏DNA、蛋白质和脂质等关键细胞成分，进而诱发心肌细胞死亡、肥厚、纤维化及收缩功能障碍等严重后果[33-34]。值得注意的是，氧化应激也能诱导细胞中铁死亡发生[35]。此次研究发现芦荟素能够有效抑制缺氧诱导心肌细胞中活性氧的生成及线粒体氧化应激。
铁死亡是一种非凋亡的程序性细胞死亡形式，其在心血管疾病的发展过程中发挥着重要作用，包括心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死、阿霉素相关的心肌损伤以及心力衰竭[8]。据报道，许多药物通过铁死亡途径发挥心肌保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯通过miR-450b-5p/ACSL4途径减少铁死亡减轻急性心肌梗死[7]。芦荟大黄素通过抑制铁死亡减轻阿霉素诱导的心脏毒性[36]。黄芪甲苷Ⅳ通过下调CD36介导的铁死亡减轻糖尿病心肌病大鼠的心脏功能障碍[37]。铁过载和脂质过氧化是铁死亡的2个典型特征。急性心肌梗死发生时，铁转运蛋白功能受损，使得心肌细胞内Fe2+过度积聚。这些Fe2+通过芬顿反应产生大量羟自由基，进而攻击多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，最终导致心肌细胞铁死亡[8，38]。在这项研究中，发现缺氧诱导了H9C2细胞中Fe2+水平和脂质过氧化程度显著升高，这表明缺氧可以导致H9C2细胞铁死亡发生。而芦荟素能够逆转这一趋势，有效抑制H9C2细胞铁死亡。
在心肌梗死的早期阶段，铁死亡调节因子如GPX4和ACSL4可能起着重要的作用，并有潜力成为疾病诊断的生物标志物[3，39-40]。GPX4是一种硒蛋白，含有抗铁死亡所需的硒代半胱氨酸残基[41]。在谷胱甘肽存在下，GPX4可以消除有害脂质过氧化物积累，从而防止铁死亡[20]。当使用特异性siRNA或化学抑制剂RSL3分别消耗或抑制GPX4时，会导致脂质过氧化物的积累，从而在H9C2心肌细胞中诱发铁死亡[3]。ACSL4促进了细胞内多不饱和脂肪酸的合成，这有助于脂质过氧化的形成，从而推动铁死亡的发生[8]。ACSL4的过表达会加剧心肌细胞中脂质过氧化的程度，进而削弱黄芩苷对缺血再灌注心肌的保护作用[42]。在大鼠心肌缺血中，敲低ACSL4能够减少铁积聚、氧化应激和铁死亡，从而保护心脏[43]。该研究结果表明，在缺氧诱导的H9C2细胞中，GPX4的表达下降，而ACSL4的表达升高，这也进一步印证了缺氧可以诱导H9C2细胞铁死亡的发生。H9C2细胞经芦荟素干预后，观察到GPX4和ACSL4的表达水平在一定程度上恢复到了基线水平。
转录因子Nrf2是细胞抗氧化反应的核心调节者。它通过与抗氧化反应元件的结合，促进下游基因转录，进而参与到预防或纠正细胞内氧化还原失衡的活动中[26]。许多研究证实，Nrf2信号通路的激活能有效预防氧化应激引发的心脏损伤，包括阿霉素诱导的心肌损伤[44]、由压力超负荷导致的心力衰竭以及缺血再灌注损伤等[45-47]。多项研究表明，Nrf2在铁死亡的调控中占据举足轻重的地位，这主要得益于其在铁、脂质、谷胱甘肽以及氨基酸代谢等多个方面的广泛功能[26]。Nrf2在多种再灌注损伤模型中调节谷胱甘肽的生物合成和GPX4的表达，从而抑制铁死亡[48-49]。在心力衰竭模型中，LuQi方剂通过激活Nrf2/GPX4信号轴，减轻心肌细胞的铁死亡并改善心功能[50]。该实验将芦荟素应用于缺氧的H9C2细胞后，Nrf2、GPX4的mRNA和蛋白表达均增加，表明Nrf2/GPX4轴被激活，芦荟素可能通过该通路发挥作用。
为明确铁死亡在芦荟素保护缺氧心肌细胞的作用，使用铁死亡诱导剂Erastin进行实验。与缺氧+芦荟素组相比，缺氧+芦荟素+Erastin组细胞活力明显降低，乳酸脱氢酶释放量增加，这表明Erastin逆转了芦荟素对心肌细胞的保护作用，进一步证实了抑制铁死亡在芦荟素心肌保护机制中的重要作用。
然而，研究存在以下局限性：①首先，尽管在缺氧诱导的心肌损伤中芦荟素表现出一定的治疗效果，但是，细胞培养条件通常简化了体内环境，因此细胞实验的结果可能无法完全模拟或预测实际生物体内的情况。②其次，此次研究虽然探讨了芦荟素发挥保护作用可能是通过Nrf2/GPX4轴，但遗憾的是，并未进一步通过敲低Nrf2的实验来验证这一发现。这一局限性无法直接确认Nrf2/GPX4轴在芦荟素保护机制中的确切作用，限制了对芦荟素作用机制的深入理解。③最后，在细胞实验中使用H9C2细胞系(尽管H9C2细胞是研究心肌梗死或心肌缺血再灌注的常用细胞系)，但细胞系可能经过长期的传代和选择，已经与原始组织或器官存在差异。针对以上不足，再要在新生大鼠心肌细胞和体内验证芦荟素的效用。此外，还将进一步在细胞及动物模型上敲低或过表达Nrf2，以探究芦荟素在心肌保护中的具体作用机制。
综上所述，此次研究发现，在0-200 μmol/L的浓度区间内，天然植物萃取物芦荟素对H9C2心肌细胞并未显示明显的细胞毒性。首次阐明芦荟素通过抑制氧化应激和铁死亡减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤。芦荟素抑制铁死亡的作用具体体现在能有效抑制缺氧导致的Fe2+及脂质过氧化物的累积，调节铁死亡关键调节因子GPX4和ACSL4的表达，其潜在的作用机制可能与激活Nrf2/GPX4轴有关。这一发现为芦荟素在心血管疾病的临床应用提供了新的细胞分子学证据，为心血管疾病的治疗提供了新的潜在策略，值得进一步深入研究与探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

芦荟素减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤：抑制氧化应激和铁死亡

Aloin mitigates hypoxic injury in rat cardiomyocytes: inhibiting oxidative stress and ferroptosis

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