芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应

doi:10.12307/2025.527

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (25): 5328-5334.doi: 10.12307/2025.527

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应

于庆贺1，蔡子鸣2，田禾3，李翩4，阮烨4，梁金柱2，林淑惠1，林文平1

广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院，1脊柱外科，3妇科，广东省深圳市 518118；2广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院，广东省深圳市 518118；4广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510006

收稿日期:2024-05-13 接受日期:2024-06-26 出版日期:2025-09-08 发布日期:2024-12-21
通讯作者: 林文平，博士，主任医师，博士生导师，广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院脊柱外科，广东省深圳市 518118
作者简介:于庆贺，男，1992年生，河北省邢台市人，汉族，2020年南方医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱脊髓损伤修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81771323)，项目负责人：林文平；广东省自然科学基金面上项目(2021A1515010722)，项目负责人：林文平；深圳市自然科学基金面上项目(JCYJ20190813112401660)，项目负责人：林文平

Formononetin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in nucleus pulposus mesenchymal stem cells

Yu Qinghe1, Cai Ziming2, Tian He3, Li Pian4, Ruan Ye4, Liang Jinzhu2, Lin Shuhui1, Lin Wenping1

1Department of Spine Surgery, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China; 3Department of Gynecology, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China; 4Third School of Clinical Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine. Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2024-05-13 Accepted:2024-06-26 Online:2025-09-08 Published:2024-12-21
Contact: Lin Wenping, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China
About author:Yu Qinghe, Master, Physician, Department of Spine Surgery, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81771323 (to LWP); Natural Science Foundation of Guangdong Province of China, No. 2021A1515010722 (to LWP); Natural Science Foundation of Shenzhen Municipality, No. JCYJ20190813112401660 (to LWP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

芒柄花素：是一种从传统中草药黄芪、葛根等提取的异黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等功能。
髓核间充质干细胞：指存在于髓核中的间充质干细胞，具有自我更新、增殖和定向分化的能力，是椎间盘内源性修复的关键细胞。

摘要
背景：芒柄花素具有抗炎、抗氧化能力，但其对髓核间充质干细胞是否有保护作用尚不清楚。
目的：探讨芒柄花素对炎症微环境下髓核间充质干细胞的作用及机制。
方法：①从SD大鼠尾椎椎间盘中提取髓核间充质干细胞，流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志；②CCK-8法检测脂多糖、芒柄花素对髓核间充质干细胞增殖活力的影响，以确定后续处理细胞应用的芒柄花素浓度；③在DMEM/F-12完全培养基中添加5 μg/mL脂多糖模拟炎症微环境，然后用不同浓度芒柄花素处理髓核间充质干细胞24 h，通过Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光检测炎症标志物表达，Western blot检测核因子κB信号通路蛋白水平。

结果与结论：①贴壁培养的髓核间充质干细胞呈梭形，生长状态良好，流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD90呈阳性，造血干细胞表面标志物CD34、CD45呈阴性。②12.5，25，50，100，200 μmol/L芒柄花素处理24 h对髓核间充质干细胞无明显增殖抑制效果。与脂多糖组相比，12.5，25，50 μmol/L芒柄花素处理24 h后髓核间充质干细胞活力显著提高，因此后续选用12.5，25，50 μmol/L为芒柄花素低、中、高浓度处理髓核间充质干细胞。③与脂多糖组相比，芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α蛋白和mRNA表达均明显降低(P < 0.05)，且具有剂量依赖性。④与脂多糖组相比，芒柄花素低、中、高浓度组髓核间充质干细胞中磷酸化核因子κB和磷酸化核因子κB 抑制蛋白的表达显著降低(P < 0.05)，且具有剂量依赖性。上述结果说明芒柄花素可能通过抑制核因子κB信号通路减轻脂多糖诱导的大鼠髓核间充质干细胞炎症。

https://orcid.org/0000-0001-5029-5466 (林文平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 芒柄花素, 髓核间充质干细胞, 炎症, 椎间盘退变, 核因子κB

Abstract: BACKGROUND: Formononetin demonstrates potent anti-inflammatory and antioxidant abilities. However, its protective effect on nucleus pulposus mesenchymal stem cells is not yet clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of formononetin on nucleus pulposus mesenchymal stem cells under an inflammatory microenvironment.
METHODS: (1) Primary nucleus pulposus mesenchymal stem cells were isolated from the intervertebral discs of SD rats, and flow cytometry was performed to identify the surface markers of mesenchymal stem cells. (2) The CCK-8 assay was employed to evaluate the impact of lipopolysaccharide and formononetin on the proliferation viability of nucleus pulposus mesenchymal stem cells, aiming to determine the appropriate concentration of formononetin for subsequent cell treatments. (3) An inflammatory microenvironment was simulated by adding 5 μg/mL lipopolysaccharide to the DMEM/F-12 culture medium, and nucleus pulposus mesenchymal stem cells were treated with different concentrations of formononetin for 24 hours. Levels of inflammation markers were detected using western blot assay, real-time quantitative PCR, and immunofluorescence. Western blot assay was conducted to measure the protein levels of the nuclear factor kappa B signaling pathway.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The nucleus pulposus mesenchymal stem cells cultured in adherent wall were shuttle-shaped with good growth status. The results of flow cytometry showed that the surface markers of mesenchymal stem cells were positive for CD29, CD44, and CD90, and the surface markers of hematopoietic stem cells were negative for CD34 and CD45. (2) The treatment with formononetin at 12.5, 25, 50, 100, and 200 μmol/L concentrations for 24 hours had no significant proliferation inhibitory effect on nucleus pulposus mesenchymal stem cells. Compared with the lipopolysaccharide group, the cell viability of nucleus pulposus mesenchymal stem cells treated with 12.5, 25, and 50 μmol/L formononetin for 24 hours was significantly increased, so formononetin at 12.5, 25, and 50 μmol/L concentrations was subsequently selected as the low, medium, and high concentrations for treating nucleus pulposus mesenchymal stem cells. (3) Compared with the lipopolysaccharide group, the protein and mRNA expressions of matrix metalloproteinase-3, matrix metalloproteinase-13, and tumor necrosis factor-α in nucleus pulposus mesenchymal stem cells in the low, medium, and high concentrations of formononetin groups were significantly decreased (P < 0.05) in a dose-dependent manner. (4) Compared with the lipopolysaccharide group, the expressions of phosphorylated nuclear factor kappa B and phosphorylated nuclear factor kappa B inhibitor protein in nucleus pulposus mesenchymal stem cells in the low, medium, and high concentrations of formononetin groups were significantly decreased (P < 0.05) in a dose-dependent manner. The above results suggest that formononetin may attenuate lipopolysaccharide-induced inflammation in rat nucleus pulposus mesenchymal stem cells by inhibiting the activation of the nuclear factor kappa B signaling pathway.

Key words: formononetin, nucleus pulposus mesenchymal stem cell, inflammation, intervertebral disc degeneration, nuclear factor kappa B

中图分类号:

于庆贺, 蔡子鸣, 田禾, 李翩, 阮烨, 梁金柱, 林淑惠, 林文平. 芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(25): 5328-5334.

Yu Qinghe, Cai Ziming, Tian He, Li Pian, Ruan Ye, Liang Jinzhu, Lin Shuhui, Lin Wenping. Formononetin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in nucleus pulposus mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(25): 5328-5334.

图/表（结果） 2

2.1 髓核间充质干细胞的培养及鉴定结果 生长状态良好的第3代髓核间充质干细胞呈梭形，形态均一，排列紧密，增殖能力旺盛，见图1A。流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD29(98.98%)、CD44(99.94%)、CD90(99.96)呈阳性(大于95%)，造血干细胞表面标志物CD34(0.18%)、CD45(0.11%)呈阴性(小于5%)，见图1B。上述结果说明髓核间充质干细胞提取成功且状态良好，纯度较高，可用于后续实验。
2.2 脂多糖和芒柄花素对髓核间充质干细胞增殖活力的影响 CCK-8结果显示，与对照组比较，12.5，25，50，100，200 μmol/L芒柄花素处理24 h的髓核间充质干细胞活力无显著差异(P > 0.05)，见图2A。与脂多糖组比较，用脂多糖和12.5，25，50 μmol/L芒柄花素共同处理24 h的髓核间充质干细胞活力显著提高(P < 0.05)，见图2B，因此后续选用12.5，25，50 μmol/L为低、中、高浓度芒柄花素处理髓核间充质干细胞。
2.3 芒柄花素对髓核间充质干细胞炎症相关蛋白的影响 应用脂多糖和芒柄花素干预24 h后，与脂多糖组相比，芒柄花素低、中、高浓度组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α蛋白表达均明显降低(P < 0.05)，且随芒柄花素浓度的升高而更明显，见图3。该结果说明芒柄花素减轻了脂多糖诱导的髓核间充质干细胞炎症。
2.4 芒柄花素对髓核间充质干细胞炎症相关mRNA表达的影响 应用脂多糖和芒柄花素干预24 h后，与脂多糖组相比，芒柄花素低、中、高浓度组基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α mRNA表达均明显降低(P < 0.05)，见图4，该结果进一步在mRNA水平说明芒柄花素减轻了脂多糖诱导的髓核间充质干细胞炎症。

2.5 免疫荧光检测芒柄花素对髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3蛋白表达的影响 应用脂多糖和芒柄花素干预24 h后，与脂多糖组相比，芒柄花素低、中、高浓度组基质金属蛋白酶3蛋白表达显著降低(P < 0.05)，该结果亦说明芒柄花素减轻了脂多糖诱导的髓核间充质干细胞炎症，见图5。
2.6 芒柄花素对髓核间充质干细胞中核因子κB信号通路相关蛋白表达的影响 应用脂多糖和芒柄花素干预24 h后，与脂多糖组相比，随着芒柄花素浓度的升高，髓核间充质干细胞中磷酸化核因子κB、磷酸化核因子κB 抑制蛋白的蛋白表达逐渐降低(P < 0.05)，而核因子κB、核因子κB 抑制蛋白的表达无明显差异(P > 0.05)，这说明芒柄花素抑制了因脂多糖处理激活的核因子κB信号通路，见图6。

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引言

椎间盘退变是骨科的常见病、多发病，也是引起腰痛的主要原因之一[1]。临床上椎间盘退变早期主要依靠物理干预和药物来达到缓解疼痛的效果，但这些治疗方法无法修复损伤的椎间盘[2]。椎间盘退变进展到后期以纤维环撕脱、软骨终板塌陷和髓核突出为特征，此时严重的患者需要手术干预才能缓解疼痛[3]。目前的手术和非手术治疗措施不能有效恢复椎间盘的功能，并且存在侵袭性、潜在复发和邻近节段椎间盘退变等缺点[4]。此外，椎间盘退变的发病机制十分复杂且未完全阐明，包含炎症、氧化应激等[5]。研究椎间盘退变的病理生理学分子机制能为椎间盘退变提供新的治疗策略[6-7]。
近年来，随着组织工程技术的发展，椎间盘退变的治疗已进入再生和功能重建阶段[8]。髓核间充质干细胞具有增殖、多向分化能力，已经成为椎间盘退变治疗领域的热点[9]。研究表明，减轻由炎症、氧化应激微环境等引起的髓核间充质干细胞损伤能有效延缓椎间盘退变的进展[10]。因此，发现或合成对髓核间充质干细胞有保护作用的药物、生物材料等有重要意义。
芒柄花素是一种具有生物活性的异黄酮类化合物，是黄芪、葛根等中药的主要活性成分之一[11]。近年来，学者们对芒柄花素进行了广泛的研究，揭示了其具有多种生物活性，包括成骨、神经保护、抗炎、抗氧化等作用[12-13]。研究表明，芒柄花素能通过抑制核因子κB信号通路减轻机体的气道炎症、乳腺炎等[14-15]。然而，芒柄花素能否对髓核间充质干细胞的炎症有改善作用尚不明确。
该研究从大鼠尾椎椎间盘中提取原代髓核间充质干细胞进行体外细胞实验，采用脂多糖模拟细胞炎症微环境，加入低、中、高浓度芒柄花素进行干预，通过Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光等方法检测髓核间充质干细胞炎症标志物和核因子κB信号通路相关蛋白的表达，以探究芒柄花素能否通过核因子κB信号通路减轻脂多糖引起的髓核间充质干细胞炎症。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年10月至2024年4月在深圳平乐骨伤科医院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄雄性SD大鼠5只，体质量250-300 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号为SYXK(粤)2022-0292，用于提取髓核间充质干细胞，实验方案经深圳市荣湾生物医学实验动物中心批准，批准号为RW-IACUC-23-0048。
实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规，最大限度地减少实验动物的疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器 芒柄花素(美国MCE，HY-N0183)；DMEM/F-12培养基(美国Gibco，11320033)；间充质干细胞(大鼠)表面标记检测试剂盒(广州赛业，RAXMX-09011)；CCK-8试剂盒(日本DOJINDO，CK04)；第一链cDNA合成试剂盒(美国Thermo，K1622)；SYBR Green 预混液(美国Thermo，A25743)；抗体：抗GAPDH抗体(武汉三鹰，60004-1-Ig)；抗基质金属蛋白酶3抗体(武汉三鹰，66338-1-Ig)；抗基质金属蛋白酶13抗体(武汉三鹰，18165-1-AP)；抗肿瘤坏死因子α抗体(武汉三鹰，60291-1-Ig)；抗核因子κB抗体(美国ABCAM，ab19870)；抗磷酸化核因子κB抗体(美国ABCAM，ab76302)；抗核因子κB 抑制蛋白抗体(美国ABCAM，ab76429)；抗磷酸化核因子κB 抑制蛋白抗体(美国ABCAM，ab92700)；FITC标记山羊抗兔IgG(上海碧云天，A0562)；超净工作台(苏州净化)；CO2恒温培养箱(美国Thermo)；Western blot电泳转印系统(美国Bio-Rad)；倒置光学显微镜(日本Olympus)；流式细胞分析仪(美国Thermo)；酶联免疫分析仪(杭州奥盛)；qRT-PCR系统(美国Thermo)。
1.4 方法
1.4.1 大鼠髓核间充质干细胞提取和培养 2月龄SD大鼠吸入过量二氧化碳处死后浸泡于体积分数75%乙醇中消毒5 min，无菌条件下收集大鼠尾椎椎间盘中的髓核组织，置于含有1%双抗的PBS中，使用眼科剪剪至1 mm3大小，用0.2%Ⅱ型胶原酶在37 ℃，含体积分数5% CO2 的培养箱中消化4 h，加入等体积的完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F-12)终止消化，将细胞悬液通过75 µm细胞筛过滤，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清后用完全培养基重悬，接种于培养皿中，48 h后更换培养基，当细胞达到80%融合度时进行传代。
1.4.2 流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志 按试剂盒说明将第3代髓核间充质干细胞消化重悬并调整细胞浓度为3×109 L-1，取100 μL加入EP管，再分别加入2 μL CD29、CD44、CD90、CD34、CD45一抗，4 ℃孵育30 min，PBS清洗2次，加入2 μL荧光二抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，PBS重悬细胞后上机检测。
1.4.3 CCK-8检测细胞活力 按照试剂盒说明将第3代髓核间充质干细胞以3×103/孔接种至96孔板，每组设5个复孔。待细胞贴壁后，更换为含0，12.5，25，50，100，200 μmol/L芒柄花素的完全培养基[16-17]，或含5 μg/mL脂多糖以及0，12.5，25，50，100，200 μmol/L芒柄花素的完全培养基[18]，24 h后每孔加入CCK-8试剂10 μL，在37 ℃下孵育1 h，酶联免疫分析仪检测450 nm波长的吸光度值。
1.4.4 Western blot 第3代髓核间充质干细胞分为对照组(完全培养基)、脂多糖组(含5 μg/mL脂多糖的完全培养基)、芒柄花素低浓度组(含5 μg/mL脂多糖和12.5 μmol/L芒柄花素的完全培养基)、芒柄花素中浓度组(含5 μg/mL脂多糖和25 μmol/L芒柄花素的完全培养基)、芒柄花素高浓度组(含5 μg/mL脂多糖和50 μmol/L芒柄花素的完全培养基)，按2.5×105/孔接种于6孔板，待细胞融合度达80%进行分组干预，干预24 h后，弃去培养基，预冷PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞，12 000 r/min离心10 min后收集蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，配平后加入蛋白上样缓冲液，100 ℃加热10 min制备成蛋白上样样品。SDS-PAGE凝胶上样孔中每孔加入20 µg蛋白，依次电泳、转膜，2%牛血清白蛋白封闭，加入一抗(抗GAPDH抗体，1∶10 000；抗基质金属蛋白酶3抗体，1∶5 000；抗基质金属蛋白酶13抗体，1∶1 000；抗肿瘤坏死因子α抗体，1∶1 000；抗核因子κB抗体，1∶1 000；抗磷酸化核因子κB抗体，1∶1 000；抗核因子κB 抑制蛋白抗体，1∶1 000；抗磷酸化核因子κB 抑制蛋白抗体，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，弃去一抗，用TBST将PVDF膜洗净后加入稀释好的二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST再次洗净后使用发光试剂盒进行显影，化学发光成像系统分析信号强度。

1.4.5 qRT-PCR 第3代髓核间充质干细胞按上述分组干预24 h，Trizol法提取各组细胞的总RNA，酶标仪检测纯度和浓度，使用第一链cDNA合成试剂盒进行反转录。以获得的cDNA为模板，GAPDH为内参，SYBR Green为荧光染料进行扩增，分别检测基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α的mRNA表达量，引物序列见表1。

1.4.6 免疫荧光染色 将第3代髓核间充质干细胞以2×104个/孔的密度接种至放有细胞爬片的24孔板中，待细胞完全贴壁后按上述细胞分组加入含脂多糖和不同浓度芒柄花素的完全培养基。干预24 h后弃去培养基，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗后加入0.3%Triton X-100在4 ℃打孔10 min，PBS清洗后加入2%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗(抗基质金属蛋白酶3抗体，1∶200) 4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，避光条件下加入荧光二抗(FITC标记山羊抗兔IgG，1∶200)室温孵育1 h，PBS清洗3次，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封固，倒置荧光显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①髓核间充质干细胞的形态和流式鉴定结果；②脂多糖和不同浓度芒柄花素对髓核间充质干细胞活力的影响；③Western blot检测各组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α的蛋白表达；④qRT-PCR检测各组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、肿瘤坏死因子α的mRNA表达；⑤免疫荧光检测各组髓核间充质干细胞中基质金属蛋白酶3的蛋白表达；⑥Western blot检测各组髓核间充质干细胞中核因子κB、磷酸化核因子κB、核因子κB 抑制蛋白、磷酸化核因子κB 抑制蛋白的蛋白表达。

1.6 统计学分析 所有的实验至少重复5次，使用SPSS 26.0软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 9.0软件进行绘图。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过福建省疾病预防控制中心生物统计学专家肖方震主任医师审核。

讨论

椎间盘退变是脊柱骨科常见的一种慢性疾病，是各种退行性脊柱疾病发生、发展的主要原因，也是导致腰痛产生的重要原因之一[19-20]。椎间盘是脊柱椎骨间的软骨连接，由外层的纤维环、内层的髓核和上下两层的软骨终板组成，具有复杂的解剖结构，使脊柱能活动，并具有吸收和分散脊柱负荷的作用[4]。椎间盘所处的环境具有低氧、低血供、高渗透压和较高压力的特点，当椎间盘内的损伤和修复之间出现失衡，就发生了椎间盘退变。对于有症状的椎间盘退变患者，镇痛药、物理治疗等保守治疗方法旨在缓解疼痛，通常无法阻止椎间盘退变的进展[21]。对于慢性疼痛保守治疗无效或出现急性神经功能障碍的患者建议行椎间盘切除手术，但手术的并发症如神经损伤、邻近节段退变等也是不容忽视的问题[22]。因此，临床上迫切需要有效的治疗手段来延缓椎间盘退变的进展或修复退变的椎间盘。虽然椎间盘退变的病因复杂，目前尚未完全阐明，但细胞炎症、凋亡、衰老、代谢紊乱等被认为是其发病的关键因素[23]。针对这些病理过程发现或开发新的药物、生物材料等能为椎间盘退变治疗开辟新的途径。
间充质干细胞是具有多向分化能力的干细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等，是组织工程领域的关键种子细胞[24-25]。髓核间充质干细胞是存在于髓核中的间充质干细胞，其内源性修复功能可促进椎间盘的再生[26]。然而，椎间盘退变的微环境，包括机械应力、炎症、氧化应激等严重限制了髓核间充质干细胞的存活和功能[27-28]。芒柄花素是一种从中草药和食用植物中提取的异黄酮类化合物，被认为具有多种药理特性，如抗癌、抗炎、抗氧化等[29]。核因子κB信号通路是免疫和炎症反应的关键调节因子，对多种病理过程有重要的调控作用[30-31]。在椎间盘退变过程中，炎症、氧化应激等多种因素可通过激活核因子κB信号通路诱导基质降解酶，如基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13的表达升高，从而加速髓核细胞的细胞外基质分解代谢。此外，核因子κB信号通路的激活可增加多种炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子α的表达水平，形成恶性循环，进一步加速椎间盘退变的进展。核因子κB信号通路是椎间盘退变中重要的治疗靶点[32-33]。研究表明，芒柄花素能通过抑制核因子κB信号通路的激活从而对多种组织和细胞产生抗炎作用[34]。然而，尚没有研究证明芒柄花素对髓核间充质干细胞是否具有抗炎保护作用。
在此研究中，通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等方法发现芒柄花素减轻了脂多糖诱导的髓核间充质干细胞炎症反应，降低了炎症相关标志基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13和肿瘤坏死因子α的蛋白和mRNA表达。在CCK-8实验中发现芒柄花素浓度在12.5-
50 μmol/L范围时可以减轻脂多糖产生的细胞增殖抑制效果。后续的实验表明，芒柄花素抑制了由脂多糖导致的核因子κB信号通路的激活，随着芒柄花素浓度的升高，髓核间充质干细胞中磷酸化核因子κB、磷酸化核因子κB 抑制蛋白的蛋白表达逐渐降低，说明在一定浓度范围内芒柄花素可以抑制髓核间充质干细胞中核因子κB信号通路的激活并减轻脂多糖诱导的细胞炎症。
此研究存在一些局限性：首先，由脂多糖模拟细胞炎症微环境，无法完整体现机体内部复杂的病理、生理条件；其次，与人髓核间充质干细胞相比，大鼠髓核间充质干细胞的表型和功能必然有一定差异性。因此研究结论仍需进一步验证。
综上所述，该研究证实芒柄花素可能通过抑制核因子κB信号通路的激活减轻脂多糖诱导的大鼠髓核间充质干细胞炎症，为椎间盘退变的治疗药物提供了新的选择，但仍需要进一步的实验验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

芒柄花素抑制脂多糖诱导髓核间充质干细胞的炎症反应

Formononetin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in nucleus pulposus mesenchymal stem cells

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