羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用

doi:10.12307/2025.057

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4044-4051.doi: 10.12307/2025.057

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用

王泽乾1，段彦哲1，吴艺舸1，马东2，黄建军2，闫玉清1，3，宋丽娟1，4

1山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西省晋中市 030619；2国药同煤总医院神经外科/山西省神经疾病防治研究委级重点实验室，山西省大同市 037003；3山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009；4山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室，山西省太原市 030001

收稿日期:2024-02-01 接受日期:2024-04-03 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 宋丽娟，博士，副教授，山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西省晋中市 030619；山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室，山西省太原市 030001；共同通讯作者：闫玉清，博士，教授，山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西省晋中市 030619；山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009
作者简介:王泽乾，男，1997年生，蒙古族，山西中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合防治缺血性脑卒中方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82004028)，项目负责人：宋丽娟；中国博士后科学基金面上资助项目(2020M680912)，项目负责人：宋丽娟；国家中医药管理局“张仲景传承与创新专项”(GZY-KJS-2022-048-1)，项目负责人：宋丽娟；山西省科技创新人才青年团队项目(202204051001028)，项目负责人：宋丽娟；山西中医药大学2022年度科技创新团队项目(2022TD2010)，项目负责人：宋丽娟；山西省卫健委医学科技领军团队项目(2020TD05)，项目负责人：马存根(执行：宋丽娟)；山西中医药大学附属医院国家区域中医医疗中心心血管专项基金项目(XGZX202115)，项目负责人：宋丽娟；山西中医药大学青年科学家培育项目(2021PY-QN-09)，项目负责人：宋丽娟；山西中医药大学学科建设经费(2023XKJS-02)，项目负责人：马存根(执行：宋丽娟)

Inhibitory effect of hydroxy safflower yellow A on neuronal pyroptosis after glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation treatment

Wang Zeqian1, Duan Yanzhe1, Wu Yige1, Ma Dong2, Huang Jianjun2, Yan Yuqing1, 3, Song Lijuan1, 4

1The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine/Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2Department of Neurosurgery/The Key Laboratory of Prevention and Treatment of Neurological Disease of Shanxi Provincial Health Commission, Sinopharm Tongmei General Hospital, Datong 037003, Shanxi Province, China; 3Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; 4The Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2024-02-01 Accepted:2024-04-03 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Song Lijuan, MD, Associate professor, The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine/Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; The Key Laboratory of Cellular Physiology, Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China. Co-corresponding author: Yan Yuqing, MD, Professor, The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine/Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
About author:Wang Zeqian, Master candidate, The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine/Research Center of Neurobiology, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, 82004028 (to SLJ); China Postdoctoral Science Foundation (General Program), No. 2020M680912 (to SLJ); “Zhang Zhongjing Inheritance and Innovation Special Project” of National Administration of Traditional Chinese Medicine, No. GDY-KJS-2022-048-1 (to SLJ); Shanxi Science and Technology Innovation Talent Youth Team Project, No. 202204051001028 (to SLJ); 2022 Annual Science and Technology Innovation Team Project of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2022TD2010 (to SLJ); Medical Science and Technology Leading Team Project of Shanxi Provincial Health Commission, No. 2020TD05 (to MCG [executer: SLJ]); Cardiovascular Special Fund Project of National Regional TCM Medical Center, Affiliated Hospital of Shanxi University of Chinese Medicine, No. XGZX202115 (to SLJ); Young Scientist Training Project of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2021PY-QN-09 (to SLJ); Discipline Construction Fund of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2023XKJS-02 (to MCG [executer: SLJ])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞焦亡：指促炎性程序性细胞死亡。细胞焦亡是机体重要的天然免疫反应，主要通过炎性小体介导包含Caspase-1在内的多种Caspase的激活，使得gasdermin家族成员gasdermin D(GSDMD)发生剪切和多聚化，造成细胞穿孔，引起细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物及白细胞介素18、白细胞介素1β炎性因子的释放进而激活强烈的炎性反应。
脑缺血：是指由于脑血管狭窄、闭塞或栓塞等引起相应的动脉供血区域的脑组织发生功能障碍。

摘要
背景：羟基红花黄色素A具有抗缺血、抗氧化、抗血栓及抗炎等作用，其是否影响糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡，目前尚不清楚。
目的：探讨羟基红花黄色素A对神经元焦亡的干预作用及机制。
方法：取对数生长期的HT22细胞，随机分为5组：正常组、模型组、羟基红花黄色素A组、Colivelin组、Colivelin+羟基红花黄色素A组。利用糖氧剥夺/复糖复氧处理HT22细胞建立神经元焦亡模型，然后给予STAT3激动剂Colivelin、羟基红花黄色素A干预。干预后JC-1探针检测线粒体膜电位变化，活性氧试剂盒检测细胞内活性氧含量，GSDMD/TUNEL染色观察细胞焦亡情况，免疫荧光检测STAT3、GSDMD蛋白表达，RT-PCR检测STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达，Western blot检测p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达。

结果与结论：①与正常组相比，模型组焦亡细胞数量增多，p-STAT3、NLRP3、Cleaved-caspase-1、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达显著升高；与模型组相比，羟基红花黄色素A组焦亡细胞数量减少，焦亡相关蛋白的表达显著降低；②与模型组相比，Colivelin组细胞焦亡加剧，线粒体膜电位降低，活性氧含量增加，STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达升高，p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达升高；与Colivelin组相比，Colivelin+羟基红花黄色素A组上述指标均有好转。结果表明：羟基红花黄色素A通过STAT3信号通路抑制糖氧剥夺/复糖复氧后HT22细胞焦亡发挥神经保护作用。

https://orcid.org/0009-0007-6005-0981 (王泽乾)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: HT22细胞, 细胞焦亡, 羟基红花黄色素A, 神经元, 糖氧剥夺, 复糖复氧

Abstract: BACKGROUND: Hydroxy safflower yellow A has anti-ischemia, anti-oxidation, anti-thrombotic and anti-inflammatory effects. Whether it affects neuronal pyroptosis after glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of hydroxy safflower yellow A on neuronal pyroptosis and its mechanism.
METHODS: HT22 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into five groups: normal group, model group, hydroxy safflower yellow A group, colivelin group, and colivelin+hydroxy safflower yellow A group. HT22 cells were treated with glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation to establish neuronal pyroptosis model, and then treated with STAT3 agonist Colivelin and hydroxy safflower yellow A. JC-1 probe was employed to assess changes in mitochondrial membrane potential. Reactive oxygen species kit was used to determine the content of reactive oxygen species in cells. GSDMD/TUNEL staining was conducted to observe cell pyroptosis. Immunofluorescence analysis was performed to detect STAT3 and GSDMD protein expression. RT-PCR was utilized for assessing mRNA expression levels of STAT3, NLRP3, and Caspase-1. Western blot assay was utilized to measure the protein expression levels of p-STAT3, NLRP3, GSDMD, Cleaved-caspase-1, and interleukin-1β.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal group, the number of pyroptotic cells increased in HT22 cells in the model group along with a significant increase in protein expression levels of p-STAT3, NLRP3, Cleaved-caspase-1, GSDMD, and interleukin-1β. Compared with the model group, the number of pyroptotic cells reduced, and the expression of pyroptosis-related proteins significantly decreased in the hydroxy safflower yellow A group. (2) In comparison with the model group, pyroptosis worsened in the colivelin group where mitochondrial membrane potential decreased along with elevated reactive oxygen species content and increased mRNA expression levels of STAT3, NLRP3, and Caspase-1, as well as increased protein expression levels of p-STAT3, NLRP3, GSDMD, Cleaved-caspase-1, and interleukin-1β. Compared with the Colivelin group, above indexes were improved in the colivelin+hydroxy safflower yellow A group. These results suggest that hydroxy safflower yellow A plays a neuroprotective role through STAT3 signaling pathway to inhibit HT22 pyroptosis after glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation treatment.

Key words: HT22 cell, pyroptosis, hydroxy safflower yellow A, neuron, glucose-oxygen deprivation, reglucose-reoxygenation

中图分类号:

王泽乾, 段彦哲, 吴艺舸, 马东, 黄建军, 闫玉清, 宋丽娟. 羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4044-4051.

Wang Zeqian, Duan Yanzhe, Wu Yige, Ma Dong, Huang Jianjun, Yan Yuqing, Song Lijuan. Inhibitory effect of hydroxy safflower yellow A on neuronal pyroptosis after glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation treatment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4044-4051.

图/表（结果） 2

2.1 HSYA减轻OGD/R诱导的HT22细胞焦亡 GSDMD/TUNEL染色结果显示(图1)，与正常组相比，模型组GSDMD和TUNEL标记蛋白显著增多；与模型组相比，HSYA组GSDMD蛋白和TUNEL标记的DNA损伤明显减少。
Western blot 结果显示(图2)，正常组NLRP3、Cleaved-caspase-1、GSDMD及白细胞介素1β蛋白表达较少，OGD/R后上述蛋白表达明显升高(P ? 0.01)；与模型组相比，HSYA组NLRP3、Cleaved-caspase-1、GSDMD及白细胞介素1β蛋白表达明显降低(P ? 0.01)。结果表明，HT22细胞经OGD/R后发生焦亡，HSYA干预后可减少神经元焦亡发生。
2.2 HSYA减少OGD/R诱导的HT22细胞乳酸脱氢酶漏出 乳酸脱氢酶检测结果显示(图3)，与正常组相比，模型组HT22细胞乳酸脱氢酶漏出显著增多；与模型组相比，HSYA组乳酸脱氢酶漏出显著减少。Colivelin组乳酸脱氢酶漏出最多，与Colivelin组相比，Colivelin+HSYA组HT22细胞乳酸脱氢酶漏出明显减少。结果提示持续激活STAT3通路，将加重OGD/R后HT22细胞的损伤，HSYA能有益于细胞存活。
2.3 HSYA降低OGD/R诱导的HT22细胞活性氧和线粒体膜电位 流式分析结果显示(图4A)，与正常组相比，模型组细胞内活性氧含量显著升高；与模型组相比，Colivelin组细胞内活性氧含量进一步升高，HSYA组细胞内活性氧含量显著降低；与Colivelin组相比，Colivelin+HSYA组细胞内活性氧含量显著降低。
JC-1分析结果显示(图4B)，与正常组相比，模型组细胞线粒体膜电位显著下降；与模型组相比，HSYA组线粒体膜电位显著升高，Colivelin组线粒体膜电位进一步下降；与Colivelin组相比，Colivelin+HSYA组线粒体膜电位部分恢复。结果提示，HSYA可减轻OGD/R后HT22细胞内活性氧含量、线粒体膜电位下降。

2.4 HSYA抑制OGD/R诱导的HT22细胞STAT3和GSDMD表达 免疫荧光染色结果显示(图5)，STAT3、GSDMD蛋白在正常组表达较少，主要分布在细胞质内；经OGD/R处理后，STAT3、GSDMD蛋白表达较正常组显著增加，STAT3主要表达在细胞核内；与模型组相比，HSYA组细胞核内STAT3和GSDMD蛋白表达减少。Colivelin组较模型组染色表达更显著，细胞存活数目少，Colivelin+HSYA组STAT3、GSDMD蛋白表达明显减少，细胞存活数目增加。
2.5 HSYA抑制OGD/R诱导的HT22细胞STAT3和NLRP3等相关指标的表达 RT-PCR 检测结果显示(图6)，与正常组相比，模型组细胞中STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达显著升高；与模型组相比，HSYA组细胞中STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达明显降低，Colivelin组细胞中STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达进一步升高；与Colivelin组相比，Colivelin+HSYA组细胞中STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达明显降低。
Western blot 检测结果显示(图7)，与正常组相比，模型组细胞中p-STAT3、NLRP3、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达升高；与模型组相比，HSYA组细胞中p-STAT3、NLRP3、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达明显降低，Colivelin组细胞中p-STAT3、NLRP3、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达进一步升高；与Colivelin组相比，Colivelin+HSYA组细胞中p-STAT3、NLRP3、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达明显降低。

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引言

脑卒中具有发病率高、复发率高、经济负担高等特点[1]，缺血性脑卒中占比达80%。研究证实，免疫反应参与脑缺血再灌注损伤对神经元有保护作用[2]。但是，氧化应激、神经炎症、兴奋性中毒和细胞凋亡、焦亡等反应是加重脑损伤的主要病理过程[3-5]。目前，可应用临床治疗的策略还很有限，必须进行更多的研究来探索可能的治疗和康复途径。以炎性小体介导的细胞焦亡是兼具细胞凋亡与细胞坏死的促炎性程序性细胞死亡[6]，主要表现为细胞肿胀溶解、DNA链断裂、核固缩及形成质膜孔和炎性物质释放等特征。当局部脑组织血液供应中断时产生的缺血缺氧及再灌注可激活免疫反应，募集大量炎性细胞释放炎性因子，受损细胞内胞质内容物流出，加重炎性环境从而诱导神经元焦亡，为缺血性脑卒中预后带来不可逆的损伤。
既往研究发现，信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcript，STAT3)是位于细胞质的信号传导分子[7]，与炎症、氧化应激等多种生理病理学过程相关，由脑缺血再灌注病理条件下激活的休眠STAT3信号分子参与NOD样受体家族pyrin域3(Nod like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小体启动子结合是经典细胞焦亡途径的关键步骤，因此，阻断缺血再灌注损伤后神经元内STAT3与NLRP3炎性小体的组装激活，减少神经元焦亡，减轻缺血性脑卒中后炎性水平，将是改善及治疗缺血性脑卒中的新途径。
羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)来源于具有活血通经、散瘀止痛之功效的经典中药红花，是红花黄色素含量最高且药效最强的水溶性单体成分，可以透过血脑屏障发挥神经保护作用并具有抗缺血[8-9]、抗氧化[10]、抗血栓及抗炎等作用[11]。通过建立体内大脑中动脉梗死经典动物模型及体外糖氧剥夺/复糖复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)细胞模型，发现HSYA对缺血性脑卒中确有疗效[12-14]。但是，HSYA是否通过STAT3信号通路影响神经元焦亡途径发挥保护作用，仍未可知。因此，该研究围绕STAT3信号通路，利用体外实验验证HSYA对OGD/R处理后神经元焦亡的影响，试图从分子水平揭示HSYA抗脑梗死作用的潜在新机制，为防治神经免疫反应过度引起的继发性损伤提供了新的作用靶点，为中药现代化提供良好的应用
前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。多组数据比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2022年5月至2023年11月在山西中医药大学国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 HT22小鼠海马神经元细胞系购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3.2 药物与试剂 HSYA(批号：ST02370120)购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；STAT3激活剂Colivelin(货号3945)购自美国R&D system公司；线粒体膜电位检测试剂盒(E-CK-A301)购自Elabscience公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；无糖培养基、青链霉素混合液、乳酸脱氢酶试剂盒、活性氧检测试剂盒(CA1410)购自北京索莱宝科技有限公司；胰酶、发光液购自大连美仑生物技术有限公司；NLRP3单克隆抗体(ab263899)、p-STAT3抗体(ab270449)购自Abcam公司；白细胞介素1β抗体(AF5103)购自Affinity公司；Cleaved-caspase-1(Cl.caspase-1)单克隆抗体(89332S)购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；GSDMD抗体购自美国SANTA CRUZ公司；HRP-羊抗兔二抗(BST16K26C16K55)、HRP-羊抗小鼠二抗(BST15K18B15K51)、ALexa FluorTM555标记的IgG、ALexa FluorTM488标记的IgG二抗购自Thermo Fisher公司。
1.3.3 实验仪器 多用途低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；MCO175型CO2培养箱购自日本SANYO公司；酶标仪购自美国Thermo公司；Bugbox M厌氧工作站购自英国Baker Ruskinn公司；荧光显微镜购自德国Leica公司；CFX96 Optics Module荧光定量PCR仪、电泳仪购自美国Bio-Rad公司。
1.4 实验方法
1.4.1 HT22细胞培养、分组与模型构建 将HT22细胞接种于含5 mL完全培养基(体积分数10%胎牛血清+1%青链霉素混合液+89% DMEM高糖培养基)的10 cm细胞培养皿中，置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，长满后进行传代。细胞分为：正常组、模型组、HSYA组、Colivelin组、Colivelin+HSYA组。将待铺满培养皿的细胞弃去培养基，无菌PBS冲洗，正常组继续常规培养，其余组更换为DMEM无糖培养基并置于37 ℃、体积分数5% CO2和体积分数95% N2的厌氧工作站内培养2 h，氧糖剥夺结束后，吸掉无糖培养基，加入相同体积的高糖完全培养基进行复糖复氧，并放回37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中继续培养24 h。HSYA组于氧糖剥夺期间更换为含终浓度为25 μmol/L HSYA的无糖培养基，氧糖剥夺结束后更换为含终浓度为25 μmol/L HSYA的完全培养基；Colivelin组于氧糖剥夺期间更换为含终质量浓度为25 µg/mL Colivelin的无糖培养基，待氧糖剥夺结束后更换为含终质量浓度为25 µg/mL Colivelin的完全培养基；Colivelin+HSYA组于氧糖剥夺期间更换为含 25 µg/mL Colivelin+25 μmol/L HSYA的无糖培养基，待氧糖剥夺结束后更换为含25 µg/mL Colivelin+25 μmol/L HSYA的完全培养基。HSYA的浓度选择是根据前期预实验得出，发现25 μmol/L时细胞生存率最高；Colivelin的质量浓度是根据参考文献选择为25 μg/mL[15-16]。
1.4.2 乳酸脱氢酶活性检测 参照乳酸脱氢酶试剂盒说明书，收集细胞上清液检测乳酸脱氢酶活性。根据标准曲线和试剂盒测得乳酸脱氢酶活性。
1.4.3 线粒体膜电位变化检测 各组HT22细胞干预结束后，使用不含EDTA胰酶消化细胞，PBS洗涤，加入JC-1染料，于37 ℃恒温孵箱孵育30 min，预冷的缓冲液清洗1次，离心后继续用缓冲液重悬细胞，涡旋后通过流式细胞仪上机检测分析。
1.4.4 细胞活性氧评估 各组HT22细胞干预结束后，除去培养液，避光加入DMEM高糖培养基稀释的DCFH-DA(10 μmol/L)混匀，于37 ℃恒温孵箱孵育30 min，使探针与细胞充分反应，用无血清培养基清洗细胞后，使用不含EDTA胰酶消化细胞，用无血清培养基清洗2次，重悬细胞，涡旋后通过流式细胞仪上机检测分析。

1.4.5 RT-PCR检测 参照RNA提取试剂盒说明书，收集各组HT22细胞进行裂解提取总RNA，使用紫外分光光度计检测总RNA浓度。将统一浓度后的总RNA反转录合成cDNA，条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。根据2×M5 Hi Per SYBR Premix Es Taq试剂盒说明书进行RT-PCR扩增反应，采用20 μL反应体系，使用2-ΔΔCt计算各目的基因mRNA相对表达量。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列参见表1。

1.4.6 GSDMD/TUNEL染色 将各组HT22细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBST洗涤，加入配好的GSDMD抗体(1∶200)缓冲液，4 ℃孵育过夜，PBST洗涤，加入荧光二抗室温孵育2 h，PBST洗涤；加入50 µL配好的TUNEL工作溶液，置于37 ℃恒温孵育箱孵育60 min，PBST洗涤；加入含DAPI染液的抗荧光淬灭封片液封固，避光孵育10 min，荧光显微镜下观察摄取图像。
1.4.7 免疫荧光检测 操作步骤同GSDMD/TUNEL染色，加入GSDMD、STAT3抗体(1∶200)缓冲液，4 ℃孵育过夜，PBST洗涤，加入荧光二抗室温孵育2 h，PBST洗涤，加入含DAPI染液的抗荧光淬灭封片液封固，荧光显微镜下观察摄取图像。
1.4.8 Western blot检测 收集各组HT22细胞，低温条件下对细胞进行裂解，4 ℃、12 000 r/min离心取上清，用BCA法检测蛋白浓度。采用7.5%，10%，12.5%凝胶SDS-PAGE电泳，湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入p-STAT3抗体(1∶1 000)、NLRP3抗体(1∶1 000)、Cleaved-caspase-1抗体(1∶800)、GSDMD抗体(1∶1 000)、白细胞介素1β抗体(1∶1 000)及β-actin抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜；TBST清洗后加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗去二抗，化学发光法对条带进行显影。目的条带采用Image J软件进行图像分析。
1.5 主要观察指标 ①JC-1探针检测线粒体膜电位变化；②活性氧试剂盒检测细胞内活性氧含量；③GSDMD/TUNEL染色观察细胞焦亡情况；④免疫荧光检测STAT3、GSDMD蛋白表达；⑤RT-PCR检测STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达；⑥Western blot检测p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0统计学软件进行分析，实验数据以x±s表示，两两比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西中医药大学专家审核。

讨论

缺血性脑卒中病理过程中，局部脑组织的缺血缺氧及再灌注损伤激活炎性反应、氧化应激、兴奋性氨基酸中毒等机制是一个动态变化的过程[17]。受损神经元的程序性细胞死亡被激活，如自噬、凋亡、焦亡、铁死亡等，以维持脑内微环境稳态[18]。各分子链级之间相互交叉串扰，为此病的治疗及研究增加了难度。该实验通过HT22小鼠海马神经元细胞系构建体外OGD/R模型，模拟神经元缺血再灌注病理生理过程，使用STAT3的有效激活剂Colivelin将神经元焦亡与STAT3信号通路联结，探讨HSYA通过影响STAT3信号对OGD/R处理的HT22细胞焦亡的调节作用。通过体外神经元培养及造模研究发现，HSYA能明显减少OGD/R后神经元细胞焦亡；对细胞内活性氧和线粒体膜电位变化及焦亡相关蛋白表达分析发现，HSYA能抑制STAT3信号分子，减少细胞内活性氧含量，改善线粒体膜电位损伤，继而减少HT22细胞焦亡；对细胞乳酸脱氢酶活性检测发现，HSYA通过减轻神经元的膜损伤，减少炎性因子及细胞内容物漏出，减弱了炎性反应，发挥神经保护作用。
既往研究发现，HSYA对脑缺血再灌注损伤有很好的疗效，具有抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等作用[19]。在大鼠构建的大脑中动脉梗死模型中，HSYA可通过抗凋亡途径减少脑梗死面积，改善神经功能缺陷，抑制白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达[20]。体外研究表明，HSYA可通过激活自噬来减少神经元凋亡[21]，阻断原代神经元过氧亚硝酸盐诱导的酪氨酸硝化，减少诱导型一氧化氮合酶产生，发挥神经保护作用。另外，HSYA还能通过调节大鼠体内JAK2/STAT3和SOCS3信号通路之间的串扰，提供神经保护作用，防止局灶性脑缺血[22]；HSYA还可能通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制OGD/R后星形胶质细胞中脂质运载蛋白2的表达，减少肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等致炎因子的释放，从而减轻炎性损伤[23]。
研究显示，细胞焦亡主要有两种形式，一是Caspase-1活化的依赖炎性小体经典途径；二是Caspase-4/5/11的非依赖炎性小体途径，两种途径可发生串扰[24]。已有研究证实，细胞焦亡是缺血缺氧损伤多种细胞类型死亡的主要形式之一，如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞等[25-27]。通过抑制大脑中动脉梗死模型大鼠脑内神经元NLRP3、Caspase-1和白细胞介素1β等焦亡相关蛋白可明显减少脑梗死面积，减轻脑组织损伤[28]；体外OGD/R神经元模型发现，NLRP3/Caspase-1表达增多，白细胞介素1β、白细胞介素18等炎性因子释放增多[29]。该研究证实，体外培养的HT22神经元经OGD/R处理后发生焦亡，HSYA抑制神经元焦亡的主要机制与减低STAT3信号分子活化、减少胞内活性氧、增加神经元存活有关。
STAT3是胞质中重要的转录转导信息因子，在细胞焦亡过程中发挥信号传递作用[30]。未激活的STAT3存在胞质中，发挥作用的磷酸化因子则主要位于细胞核内，调节糖酵解基因。STAT3与线粒体功能密切相关[31]，细胞内活性氧主要来源于线粒体膜电位的破坏。缺血缺氧造成线粒体内活性氧大量生成影响线粒体通透性，与受损线粒体的Ca2+一起流入细胞质内，激活NLRP3炎性小体[32]。既往的研究发现，在癫痫小鼠模型，STAT3与NLRP3的启动子结合是海马神经元焦亡的关键环节；在体内和体外帕金森模型，通过负调控STAT3信号可明显减少NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡[33]。脑组织的缺血缺氧损伤通过STAT3信号通路启动不同的免疫效应，包括炎性小体的激活与炎性因子的释放、线粒体功能障碍与活性氧增多、自噬、凋亡、铁死亡、焦亡等，这些分子链级间的相互交叉串扰，使得同一细胞表达多重机制的蛋白，所以在治疗和调控时要注重各链级的起始环节，尽早干预清除多余的活性氧，保护线粒体膜与细胞膜的完整性，阻止离子紊乱，降低转导传递信号的分子功能，将会发挥更有益的作用。
综上所述，通过体外HT22细胞实验证实，经OGD/R处理的HT22细胞会发生焦亡，HSYA则能抑制NLRP3炎性小体介导的神经元焦亡发挥保护作用，其机制可能是通过调控STAT3信号分子实现的。这也在一定意义上说明HSYA通过多靶点、多通路作用于脑缺血损伤，为临床治疗神经系统疾病提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用

Inhibitory effect of hydroxy safflower yellow A on neuronal pyroptosis after glucose-oxygen deprivation/reglucose-reoxygenation treatment

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