电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

doi:10.12307/2025.080

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (19): 4038-4043.doi: 10.12307/2025.080

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

刘庆1，2，高博1，杨霄1，姜宇2，王培1

1承德医学院附属医院，河北省承德市 067000；2承德医学院，河北省承德市 067000

收稿日期:2024-02-08 接受日期:2024-05-10 出版日期:2025-07-08 发布日期:2024-09-13
通讯作者: 王培，博士，主任医师，承德医学院附属医院，河北省承德市 067000
作者简介:刘庆，男，1995年生，四川省遂宁市人，汉族，承德医学院在读硕士，主要从事手足显微外科、周围神经损伤修复的研究。
基金资助:
河北省科技厅指令性课题(142777105D)，项目负责人：王培；河北省神经损伤与修复重点实验室(SZX2020020)，项目参与人：刘庆，高博

Electrical stimulation induces miR-741-3p to regulate Radil and promote Schwann cell migration

Liu Qing1, 2, Gao Bo1, Yang Xiao1, Jiang Yu2, Wang Pei1

1Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; 2Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China

Received:2024-02-08 Accepted:2024-05-10 Online:2025-07-08 Published:2024-09-13
Contact: Wang Pei, MD, Chief physician, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Liu Qing, Master candidate, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
Directive Project of Hebei Provincial Department of Science and Technology, No. 142777105D (to WP); Key Laboratory of Neurological Injury and Repair in Hebei Province, No. SZX2020020 (to LQ, GB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

MicroRNA：是一类小的内源性非编码单链RNA，长度为19-25个核苷酸，通过识别靶基因mRNA的3’非翻译区中的互补靶点来抑制基因表达，一个miRNA可靶向多个mRNA。miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、器官形成、造血过程、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。
施万细胞：由神经嵴前体细胞演化而来，是周围神经系统中的神经胶质细胞，为轴突提供支持，并且形成髓鞘。施万细胞功能极其活跃，可分泌多种活性物质(如神经营养因子、细胞外基质及黏附因子等)，对神经纤维的存活、生长及再生具有重要意义。

摘要
背景：越来越多的动物实验和临床研究证实电刺激可以促进周围神经损伤修复，具体的机制尚未完全明确。
目的：探讨电刺激诱导miR-741-3p调控Radil对施万细胞迁移的影响。
方法：①12只雄性SD大鼠，随机分为电刺激组和对照组，电刺激组在坐骨神经挤压伤后连续电刺激7 d，对照组在坐骨神经挤压后不做任何处理。术后第7天取损伤处神经，利用荧光原位杂交技术检测两组miR-741-3p 的表达差异。②通过miRDB、TargetScan和miRWalk数据库预测miR-741-3p靶基因。③将miR-741-3p模拟物及其对照、miR-741-3p抑制物及其对照、Radil siRNA及其对照、miR-741-3p抑制物+Radil siRNA及miR-741-3p抑制物+siRNA对照对施万细胞进行转染，采用RT-PCR检测转染效率，Transwell小室检测施万细胞的迁移能力。

结果与结论：①电刺激组神经残端miR-741-3p荧光强度低于对照组；②数据库预测结果显示有69个基因可能是miR-741-3p靶基因，Radil是预测靶基因之一，主要参与细胞黏附和迁移；③与miR-741-3p抑制物对照组相比，miR-741-3p抑制物组施万细胞迁移数增多(P < 0.05)；与miR-741-3p模拟物对照组相比，miR-741-3p模拟物组施万细胞迁移数减少(P < 0.05)；与siRNA对照组相比，Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P < 0.05)；④与miR-741-3p抑制物对照组相比，miR-741-3p抑制物组Radil的表达水平升高；与miR-741-3p模拟物对照组相比，miR-741-3p模拟物组Radil的表达水平降低；⑤与miR-741-3p抑制物+siRNA对照组相比，miR-741-3p抑制物+Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P < 0.05)。结果表明，电刺激通过下调miR-741-3p调控Radi的表达来促进施万细胞迁移。

https://orcid.org/0009-0003-6159-9774 (刘庆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 施万细胞, 电刺激, miR-741-3p, Radil, 细胞迁移, 神经再生

Abstract: BACKGROUND: More and more animal experiments and clinical studies have confirmed that electrical stimulation can promote the repair of peripheral nerve injury, but the specific mechanism is not yet fully understood.
OBJECTIVE: To investigate the effect of electrical stimulation-induced miR-741-3p regulating Radil on Schwann cell migration.
METHODS: (1) Twelve male SD rats were randomly divided into electrical stimulation group and control group. The electrical stimulation group received continuous electrical stimulation for 7 days after sciatic nerve compression injury, while the control group was not treated after sciatic nerve compression. The injured nerves were taken on day 7 after operation. The expression difference of miR-741-3p between the two groups was verified by fluorescence in situ hybridization. (2) The target genes of miR-741-3p were predicted by miRDB, TargetScan, and miRWalk databases. (3) Schwann cells were transfected with miR-741-3p mimetic and its control, miR-741-3p inhibitor and its control, Radil siRNA and its control, miR-741-3p inhibitor+Radil siRNA and miR-741-3p inhibitor+siRNA control. The transfection efficiency was detected by RT-PCR. The migration ability of Schwann cells was detected by Transwell chamber.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The fluorescence intensity of miR-741-3p in the electrical stimulation group was lower than that in the control group. (2) The results of database prediction showed that 69 genes might be the target genes of miR-741-3p. Radil was one of the predicted target genes, which was mainly involved in cell adhesion and migration. (3) Compared with the miR-741-3p inhibitor control group, the number of Schwann cell migration increased in the miR-741-3p inhibitor group (P < 0.05). Compared with the miR-741-3p mimic control group, the number of Schwann cell migration in the miR-741-3p mimic group decreased (P < 0.05). Compared with the siRNA control group, the number of Schwann cell migration was decreased in the Radil siRNA group (P < 0.05). (4) Compared with miR-741-3p inhibitor control group, the expression level of Radil was increased in miR-741-3p inhibitor group. Compared with miR-741-3p mimic control group, the expression level of Radil was decreased in miR-741-3p mimic group. (5) Compared with miR-741-3p inhibitor+siRNA control group, the number of Schwann cell migration was reduced in miR-741-3p inhibitor+Radil siRNA group (P < 0.05). The results showed that electrical stimulation promoted the migration of Schwann cells by down-regulating miR-741-3p and targeting Radil gene.

Key words: Schwann cell, electrical stimulation, miR-741-3p, Radil, cell migration, nerve regeneration

中图分类号:

刘庆, 高博, 杨霄, 姜宇, 王培. 电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4038-4043.

Liu Qing, Gao Bo, Yang Xiao, Jiang Yu, Wang Pei. Electrical stimulation induces miR-741-3p to regulate Radil and promote Schwann cell migration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(19): 4038-4043.

图/表（结果） 1

2.1 电刺激可抑制神经残端 miR-741-3p的表达 图1中蓝色代表细胞核，绿色代表miR-741-3p，荧光强度越高代表表达水平越高，用Image J软件定量分析荧光强度得出电刺激组绿色的平均荧光强度为13±5，对照组绿色的平均荧光强度为34±11，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示电刺激可抑制神经残端 miR-741-3p的表达。
2.2 miR-741-3p靶基因预测结果 运用TargetScan、miRWalk、miRDB 3个数据库进行miR-741-3p的靶基因预测，最后取3个数据库的交集作为靶基因的最终预测结果，共69个基因可能为miR-741-3p的靶基因，Radil是预测的靶基因之一。另外，还查询了miR-741-3p和Radil的基因序列，发现miR-741-3p和Radil的3’端具有互补碱基序列，提示miR-741-3p与Radil可能存在靶向关系，见图2。
2.3 miR-741-3p在体外抑制施万细胞的迁移并可负向调节Radil的表达 RT-PCR检测结果显示miR-741-3p模拟物组miR-741-3p的表达明显上调，miR-741-3p抑制物组miR-741-3p的表达显著下调，与相应对照组相比差异有显著性意义(P < 0.001)。RT-PCR及Transwell实验结果显示与miR-741-3p抑制物对照组相比，miR-741-3p抑制物组施万细胞的迁移能力增加，同时Radil的表达水平升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；与miR-741-3p模拟物对照组相比，miR-741-3p模拟物组施万细胞的迁移能力降低，同时Radil的表达降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图3。
2.4 Radil在施万细胞迁移中起到重要的作用 RT-PCR检测结果显示Radil siRNA能够下调施万细胞Radil的表达(P < 0.001)。Transwell实验显示，与siRNA对照组相比，Radil siRNA组施万细胞的迁移能力明显减弱，siRNA对照组与Radil siRNA组施万细胞的迁移数分别为137±33，95±12，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。
2.5 miR-741-3p抑制物促进施万细胞迁移的作用被Radil siRNA逆转 如图5所示，miR-741-3p抑制物+Radil siRNA组和miR-741-3p抑制物+siRNA对照组施万细胞迁移数分别为87±19，133±25，差异有显著性意义(P < 0.01)。结果表明，miR-741-3p抑制物促进施万细胞迁移的作用可被Radil siRNA逆转，进一步确定miR-741-3p抑制物促进施万细胞的迁移依赖于其促进Radil的表达。

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引言

周围神经损伤是慢性疼痛和终身残疾的常见原因[1]，根据损伤的严重程度，患者可能需要延长住院时间、多次手术及广泛的康复治疗，这给患者和医疗系统带来了沉重的经济负担[2]。周围神经损伤后具有一定的再生能力，但功能完全恢复的情况很少见，许多患者患有慢性疼痛以及感觉和运动功能障碍[3]。因此，探讨促进周围神经损伤修复的机制，有助于更好地治疗周围神经损伤。
施万细胞是周围神经系统中的主要神经胶质细胞类型，在神经周围形成绝缘鞘，这种绝缘护套允许动作电位沿轴突快速有效地传递[4]。施万细胞在周围神经的发育、功能维持和再生中起着至关重要的作用[5-7]。神经损伤后，施万细胞被损伤诱导的信号迅速激活，通过进入修复程序做出反应，转化为修复表型。施万细胞将巨噬细胞募集到受损神经中[8]，降解并清除沃勒变性过程中受损的轴突和髓鞘碎片，创造再生的有利环境[9]。大量文献证实施万细胞在周围神经修复过程中有着至关重要的作用[8-9]。
MicroRNA(miRNA)是短的非编码RNA分子，通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区结合，在转录后调节基因表达[10-11]。研究发现，大量miRNA在周围神经损伤后表现出差异表达[12]，这些差异表达的miRNA影响施万细胞的行为，对周围神经修复和再生有潜在的影响[13]。
研究发现，电刺激可有效促进周围神经损伤患者的轴突再生和功能恢复[14]，具体的机制尚未完全明确。课题组前期实验证实电刺激组与对照组坐骨神经残端中出现了大量差异表达的miRNA，其中7 d电刺激组干预后miR-741-3p的表达显著下调，提示miR-741-3p可能是电刺激促进神经再生的重要调控因子[15]。该实验进一步验证电刺激促进施万细胞迁移的分子机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2022年11月至2023年12月在承德医学院附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 选用SPF级健康雄性SD大鼠12只，8周龄，体质量180-220 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK (京) 20190008。实验方案经承德医学院附属医院动物实验伦理委员会批准，审批号为CYFYLL2023640。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验细胞、试剂和器材 RSC96细胞系(武汉普诺赛有限公司)；DMEM高糖培养基(北京EallBio)；胎牛血清(四季青浙江天杭生物)；Lipofectamine 2000转染试剂(赛默飞生物科技有限公司)；DAPI、山羊血清封闭液(瑞帕特生物)；microRNA相关产品、siRNA相关产品(广州市锐博生物科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛固定液、1%结晶紫染液(北京索莱宝科技有限公司)；Tranawell小室(美国Corning)；PCR相关产品(日本TaKaRa)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 将12只SD大鼠随机分为坐骨神经挤压伤+电刺激组(简称电刺激组)和坐骨神经挤压伤对照组(简称对照组)，每组6只。
1.4.2 建立大鼠坐骨神经挤压伤模型和电刺激 麻醉剂1.25%阿佛丁(2，2，2-三溴乙醇)按10 mL/kg剂量腹腔注射麻醉。大鼠麻醉成功后，在其右后肢大腿中部外侧进行皮肤切口，钝性分离股二头肌、半腱肌间隔，上至梨状肌下缘，下至腘窝中部，完全暴露坐骨神经，然后用止血钳挤压胫神经和腓总神经分叉上方10 mm处的坐骨神经3次，每次挤压持续10 s[16–18]，挤压间隔约为0.2 cm，电刺激组在距离神经损伤处0.5 cm的近端和远端分别埋入高纯银电极导丝，穿皮下隧道并放置在皮外，连续缝合肌间腱膜、皮肤。由经皮神经电刺激仪(型号：KD-2C)每天20 Hz电刺激1 h，刺激参数：电流强度5 mA，电刺激时间100 μs，刺激比例1∶2[3]，连续刺激7 d。对照组仅挤压坐骨神经，之后逐层缝合关闭切口。
1.4.3 样本取材 在术后第7天取损伤处两侧4 mm的神经用于分析，神经取材后保存在液氮中。
1.4.4 荧光原位杂交实验 将取下的4 mm近端神经组织依次放入梯度乙醇中进行逐级脱水，然后依次浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明处理，再浸泡于石蜡中，最后在石蜡包埋机上包埋。包埋好的神经组织置于石蜡切片机中切片，切片厚度约为5 μm，在62 ℃烤箱中烤片2 h，依次将石蜡切片放入二甲苯和梯度乙醇中脱蜡至水，放入1×柠檬酸修复液中修复，滴加体积分数3% H2O2室温避光孵育15 min阻断内源性过氧化物酶，滴加预杂交液，37 ℃孵育 1 h，倾去预杂交液，滴加含2 μmol/L探针的rno-miR-741-3p 杂交液，恒温箱中42 ℃杂交过夜，洗去杂交液，DAPI 染核5 min，抗荧光淬灭封片剂封固，扫描仪扫描，Image J软件计算miR-741-3p荧光强度。
1.4.5 靶基因预测 通过TargetScan、miRWalk、miRDB 3个数据库对荧光原位杂交实验筛选出的miR-741-3p进行靶基因预测，最后取三者预测结果的交集，作为最终靶基因预测结果。
1.4.6 施万细胞的培养和转染 RSC96细胞系用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中。转染前24 h，接种1×105个施万细胞于500 μL无抗培养基中，细胞融合度达到60%-80%时开始转染。严格按照转染试剂说明书制备转染复合物，使用Opti-MEM培养基分别稀释Lipofectamine 2000转染试剂及miR-741-3p模拟物、miR-741-3p抑制物、Radil siRNA、miR-741-3p抑制物+Radil siRNA及相应对照。分别将二者混合均匀，室温静置20 min后将混合液加入各孔细胞中，细胞转染24 h后收集细胞进行后续实验。
1.4.7 Transwell小室迁移实验 在Transwell小室上室中加入100 μL (2.0-2.5)×104个转染后的施万细胞(无血清)，在下室内加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基500 μL，常规培养24 h。取出小室，PBS洗涤，用棉签擦去小室上层细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色20 min，在倒置显微镜下放大20倍随机取6个视野计数，最后取平均值。
1.4.8 RT-PCR 用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，根据反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，用PCR试剂盒使用三步法进行qPCR反应。 Radil引物序列：正向引物5′-CCT CCT GCC TGC TCA CTC CTC-3′；反向引物3′-TGG TCC ATT CCT CTG CCC TTC G-5′。由北京擎科生物科技有限公司合成引物，检测各组转染后细胞miR-741-3p、Radil的表达，结果使用 2-ΔΔCt法进行计算。
1.5 主要观察指标 ①电刺激后神经残端miR-741-3p的表达；②miR-741-3p靶基因预测结果；③转染后施万细胞miR-741-3p、Radil的表达；④转染后施万细胞迁移情况。

1.6 统计学分析 使用SPSS 26.0统计学软件进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

电刺激是一种加速周围神经再生的方法。周围神经损伤后，电刺激已被证明可促进早期阶段神经再生，包括神经元存活和轴突芽形成[19]，其机制是通过脑源性神经营养因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、酪氨酸激酶受体B和单磷酸腺苷表达上调来实现的[20]，这在多项动物实验中已经得到证实。在大鼠坐骨神经挤压损伤模型中，有学者在神经损伤近端进行20 Hz连续电刺激，结果显示神经轴突生长期从10周缩短到了3周[21]。近年来随着分子生物学技术的发展，越来越多的学者意识到众多RNA可能在周围神经恢复中发挥着重要作用，其中miRNA是一种在真核生物中发现的内源性RNA，其长度约为22个核苷酸[22]，miRNA通过调节特定的mRNA和蛋白质，对细胞外基质重塑、轴突生长、细胞内信号传导、增殖、迁移、黏附和神经发生等关键过程产生影响[23]，在炎症、细胞凋亡和髓鞘再生等分子途径中miRNA也发挥协同作用[24]。LIU等[25]证实电刺激诱导miR-1b通过提高脑源性神经营养因子的表达来促进周围神经损伤后的修复。因此，作者推断miRNA可能是电刺激促进周围神经再生的重要调控因子。miR-741-3p是前期筛选出的目标RNA，目前的研究主要集中于辐射损伤的调节，但在周围神经损伤与电刺激中尚未见报道。OU等[26]研究证实miR-741-3p拮抗剂可防止小鼠辐射诱导的脑损伤；WEN等[27]研究证实circ-011235通过作用于miR-741-3p/CDK6信号通路上调细胞周期蛋白D1的表达，从而减少辐照对骨髓间充质干细胞的有害影响。作者前期的测序结果证实电刺激沉默了miR-741-3p的表达，提示电刺激通过miR-741-3p影响不同的信号通路在神经损伤修复中发挥重要作用。
运用TargetScan、miRWalk与miRDB 3个数据库进行miR-741-3p的靶基因预测，结果显示Radil是miR-741-3p的靶基因之一。Radil是一种小的GTPase Rap效应器，主要介导细胞的迁移和黏附。SMOLEN等[28]在斑马鱼模型中敲除Radil基因可导致神经嵴的衍生谱系改变，如软骨、色素细胞、肠神经元等发生缺陷，其缺陷产生的原因是由于Radil敲除使神经嵴细胞迁移能力降低所致。此外，Radil可介导小鼠乳腺癌细胞的迁移，敲除小鼠Radil基因可阻断乳腺癌的进展[29]。由于Radil基因可以介导细胞的迁移和黏附，并与神经嵴的衍生谱系改变有关系，作者把它作为miR-741-3p的靶标基因进行验证。
施万细胞是构成周围神经重要的部分，是可以产生髓磷脂以促进电脉冲快速传导的神经胶质细胞[30]。神经损伤后施万细胞去分化成为修复型细胞，迅速启动迁移机制，聚集至神经断端处，联合巨噬细胞对髓鞘、轴突碎片进行吞噬，同时分泌神经生长因子、免疫调节因子，上调转录调节因子c-Jun氨基末端激酶、细胞外信号调节激酶通路水平，促进周围神经轴突的生长[31-35]。周围神经恢复早期是通过施万细胞的迁移来发挥修复作用，如果受损部位施万细胞的迁移分化与细胞数量无法支持受损神经完成再生，就会导致神经损伤部位纤维细胞增生形成瘢痕，使得神经恢复受到阻滞。该实验首先将miR-741-3p抑制物、miR-741-3p模拟物及相应的阴性对照转染到施万细胞中，miR-741-3p模拟物组miR-741-3p的表达上调，Radil的表达下调，施万细胞的迁移能力降低，miR-741-3p抑制物组miR-741-3p的表达显著下调，Radil的表达水平升高，施万细胞的迁移能力增加。将Radil siRNA及其对照分别转染到施万细胞中，Radil siRNA组施万细胞迁移数量明显减少，而对照组施万细胞迁移数量变化不明显，表明沉默Radil可以抑制施万细胞的迁移。同时实验证实miR-741-3p可以负向调控Radil的表达。在拯救实验中，沉默Radil可以逆转miR-741-3p抑制物促进施万细胞迁移的作用，进一步确定了miR-741-3p是通过调控Radil的表达来影响施万细胞的迁移。
综上所述，电刺激促使神经断端miR-741-3p呈现低表达状态，其高表达可抑制施万细胞的迁移。Radil基因是预测的miR-741-3p的靶基因之一，在体外可促进施万细胞的迁移。RT-PCR及挽救实验确定了 miR-741-3p调节施万细胞的迁移依赖于其对Radil的调控。由此可见，电刺激通过下调 miR-741-3p 靶向调控 Radil 基因促进施万细胞迁移，但其作用机制尚需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

Electrical stimulation induces miR-741-3p to regulate Radil and promote Schwann cell migration

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