血浆蛋白与骨质疏松症的关系及潜在治疗靶点：基于国际UK Biobank数据库信息

doi:10.12307/2025.690

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (18): 3948-3960.doi: 10.12307/2025.690

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血浆蛋白与骨质疏松症的关系及潜在治疗靶点：基于国际UK Biobank数据库信息

朱凯，刘宛欣，罗昊冰，冯圣一，王秋根

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海市 200437

收稿日期:2024-07-23 接受日期:2024-09-03 出版日期:2025-06-28 发布日期:2024-11-29
通讯作者: 王秋根，博士生导师，主任医师，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海市 200437
作者简介:朱凯，男，1996年生，山东省日照市人，汉族，上海中医药大学在读博士，医师，主要从事骨与关节创伤方面的研究。
基金资助:
上海中医药大学预算内项目(KY110.01.423)，项目负责人：冯圣一；岳阳医院优教人才培养项目(JY611.20.04.05)，项目负责人：冯圣一

Association between plasma proteins and osteoporosis and identification of potential therapeutic targets: information analysis based on the UK Biobank database

Zhu Kai, Liu Wanxin, Luo Haobing, Feng Shengyi, Wang Qiugen

Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China

Received:2024-07-23 Accepted:2024-09-03 Online:2025-06-28 Published:2024-11-29
Contact: Wang Qiugen, Chief physician, Doctoral supervisor, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China
About author:Zhu Kai, MD candidate, Physician, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437, China
Supported by:
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Budgeted Project, No. KY110.01.423 (to FSY); Excellent Teaching Talent Cultivation Project of Yueyang Hospital, No. JY611.20.04.05 (to FSY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
孟德尔随机化：是一种以暴露全基因组关联研究的单核苷酸多态性作为工具变量，来评估暴露与结局之间因果关系的方法，可以有效避免观察性研究中存在的混淆因素，同时也是一种很有前景的药物靶点鉴定方法。
骨质疏松症：是一种系统性骨骼疾病，以骨量减少、骨组织微观结构退化为主要特征，导致骨骼脆性增加和骨折风险上升。

背景：骨质疏松症是全球范围内增加疾病负担和致残率的重要因素。血浆蛋白参与体内复杂的生物过程，在揭示疾病机制和发现潜在治疗靶点方面起着关键作用。尽管已有研究显示血浆蛋白与骨质疏松症之间存在关联，但这些关联的因果性质尚未得到充分阐明。因此，利用大规模的血浆蛋白数据探究与骨质疏松症相关的因果蛋白并识别潜在的药物靶点，对于骨质疏松症的防治至关重要。
目的：运用两样本孟德尔随机化分析，以国际UK Biobank数据库为来源信息，评估血浆蛋白与骨质疏松症之间的因果关联。
方法：从UK Biobank数据库获取1 001种血浆蛋白相关的全基因组显著性水平(P < 5×10-8)的蛋白质数量性状位点作为工具变量，并排除连锁不平衡。骨质疏松症的汇总数据来自FinnGen数据库，共涉及438 872名欧洲血统个体。研究采用逆方差加权、MR-Egger回归、加权中位数等方法进行分析，并进行多项敏感性分析以确保结果的稳健性。进一步构建蛋白-蛋白互作网络，结合基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析，探索血浆蛋白的功能相关性及潜在作用机制。
结果与结论：①孟德尔随机化逆方差加权法结果显示有50种血浆蛋白与骨质疏松症存在因果关系(P < 0.05)，包括染色体19开放阅读框12(chromosome 19 open reading frame 12，C19orf12；OR=0.610，95%CI：0.483-0.769，P=2.967×10-5)、表皮生长因子(OR=0.877，95%CI：0.770-0.999，P=0.049)等20种血浆蛋白可能与骨质疏松症的风险降低相关，有CCL18(OR=1.091，95%CI：1.037-1.147，P=0.001)、CD209(OR=1.036，95%CI：1.003-1.070，P=0.034)等30种血浆蛋白可能增加骨质疏松症的风险，经Bonferroni校正后，只有C19orf12与骨质疏松症存在显著的因果关联。②多项敏感性分析显示研究不存在多效性和异质性，说明结果具有稳健性。③通过构建蛋白-蛋白互作网络明确了表皮生长因子、CCL5、CXCL13、CXCL5、血管内皮生长因子C、CCL18、CCL17、TEK受体酪氨酸激酶、含免疫球蛋白样和表皮生长因子样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)和CCL23为核心蛋白。④基因本体富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析表明这些血浆蛋白在免疫系统中具有重要作用，通过参与信号传导、细胞迁移和趋化等过程影响骨质疏松症。⑤文章结果揭示了1 001种血浆蛋白与骨质疏松症的潜在因果关联，这种基于大规模数据驱动的分析方法有助于在中国人群中识别新的生物标志物和药物靶点；其次，文章结果表明，免疫系统信号传导、细胞迁移和趋化等过程在骨质疏松症发病机制中发挥重要作用，这为特定遗传背景和环境因素下的骨质疏松症研究提供了新的方向；最后，研究中识别的核心蛋白(如表皮生长因子、CCL5及CXCL13等)有望成为新的生物标志物或药物靶点，为骨质疏松症的精准防治提供新的依据。
https://orcid.org/0009-0002-1686-1991(朱凯)；https://orcid.org/0000-0001-9315-6888(王秋根)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 血浆蛋白, 蛋白质数量性状位点, 骨质疏松症, 孟德尔随机化, 因果关系, 富集分析, 免疫, 趋化, 生物标记物, 药物靶点

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis is a significant contributor to the global burden of disease and disability. Plasma proteins are involved in complex biological processes and play a crucial role in uncovering disease mechanisms and identifying potential therapeutic targets. Although existing studies have suggested an association between plasma proteins and osteoporosis, the causal nature of these associations is not fully clarified. Therefore, it is imperative to identify the causal proteins associated with osteoporosis and potential therapeutic targets for the amelioration and management of this condition using large-scale plasma protein data.
OBJECTIVE: To evaluate the causal relationship between plasma proteins and osteoporosis based on the UK Biobank database as source information using the two-sample Mendelian randomization.
METHODS: A total of 1 001 plasma protein-related genome-wide significant quantitative trait loci (P < 5×10-8) were obtained from the UK Biobank database and used as instrumental variables, with linkage disequilibrium excluded. Summary data on osteoporosis were collected from the FinnGen database, which included 438 872 individuals of European descent. The study was analyzed using inverse variance weighting, MR-Egger regression, weighted median, and several sensitivity analyses to ensure the robustness of the results. Further, a protein-protein interaction network was constructed, and Gene Ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analysis were conducted to explore the functional relevance and potential mechanisms of plasma proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Mendelian randomization analysis using the inverse variance weighted method identified 50 plasma proteins that have causal associations with osteoporosis (P < 0.05). Among them, 20 plasma proteins, including chromosome 19 open reading frame 12 (odds ratio [OR]=0.610; 95% confidence interval [CI]: 0.483-0.769, P=2.967×10-5) and epidermal growth factor (EGF; OR=0.877; 95% CI: 0.770-0.999, P=0.049), might be associated with a reduced risk of osteoporosis. In contrast, 30 plasma proteins, such as C-C motif chemokine ligand (CCL) 18 (OR=1.091; 95% CI: 1.037-1.147, P=0.001) and CD209 (OR=1.036; 95% CI: 1.003-1.070, P=0.034), might be associated with an increased risk of osteoporosis. After Bonferroni correction, only chromosome 19 open reading frame 12 showed a significant causal association with osteoporosis. (2) Multiple sensitivity analyses revealed no evidence of pleiotropy or heterogeneity, indicating the robustness of the results. (3) The construction of the PPI network identified core proteins such as EGF, CCL5, C-X-C motif chemokine ligand (CXCL) 13, CXCL5, vascular endothelial growth factor C, CCL17, CCL18, TEK receptor tyrosine kinase, tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domains 1, and CCL23. (4) Gene Ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analysis suggested that these plasma proteins play essential roles in the immune system, influencing osteoporosis through processes such as signal transduction, cell migration, and chemotaxis. (5) This study reveals the potential causal associations between 1 001 plasma proteins and osteoporosis, highlighting the utility of a large-scale, data-driven approach to identify new biomarkers and drug targets in diverse populations. Additionally, our findings suggest that processes such as immune signaling, cell migration, and chemotaxis play significant roles in the pathogenesis of osteoporosis, offering new directions for research under specific genetic backgrounds and environmental factors. Finally, the core proteins identified in this study (e.g., EGF, CCL5, and CXCL13) may serve as novel biomarkers or therapeutic targets, providing a new basis for the precise prevention and treatment of osteoporosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: plasma protein, protein quantitative trait loci, osteoporosis, Mendelian randomization, causal relationship, enrichment analysis, immune, chemotaxis, biomarker, drug target

中图分类号:

朱凯, 刘宛欣, 罗昊冰, 冯圣一, 王秋根. 血浆蛋白与骨质疏松症的关系及潜在治疗靶点：基于国际UK Biobank数据库信息[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(18): 3948-3960.

Zhu Kai, Liu Wanxin, Luo Haobing, Feng Shengyi, Wang Qiugen. Association between plasma proteins and osteoporosis and identification of potential therapeutic targets: information analysis based on the UK Biobank database[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(18): 3948-3960.

图/表（结果） 7

2.1 孟德尔随机化分析结果在此文章中，基于工具变量的筛选标准，血浆蛋白共获得了2 279个pQTLs，所纳入单个单核苷酸多态性对应的F统计量均大于10，故研究避免了弱工具偏倚的影响。文章采用孟德尔随机化分析方法，探讨了1 001种血浆蛋白与骨质疏松症之间的关系。结果表明，有50种血浆蛋白与骨质疏松症存在因果关系(P < 0.05)。其中，OR < 1的血浆蛋白共有20种，包括淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)、染色体19开放阅读框12(chromosome 19 open reading frame 12，C19orf12)、CC基序趋化因子配体14(C-C motif chemokine ligand 14，CCL14)、CCL17、CCL5、细胞通讯网络因子3(cellular communication network factor 3，CCN3)、组织蛋白酶F(cathepsin F，CTSF)、CXC基序趋化因子配体13(C-X-C Motif chemokine ligand 13，CXCL13)、CXC基序趋化因子配体5(C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5)、表皮生长因子(epidermal growth factOR，EGF)、上皮抑素(epiregulin，EREG)、脂肪酸结合蛋白9 (fatty acid bindingprotein 9，FABP9)、叶抑素(follistatin，FST)、脂多糖结合蛋白
(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、巢蛋白1(nidogen 1，NID1)、转化生长因子β受体3(transforming growth factor beta receptor 3，TGFBR3)、Thimet寡肽酶1(thimet oligopeptidase 1，THOP1)、肿瘤坏死因子超家族成员11(tumor necrosis factor superfamily member 11，TNFSF11)、髓系细胞样触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells like 2，TREML2)及血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)，可能与骨质疏松症的风险降低相关；OR > 1的血浆蛋白共30种，包括BTB结构域和CNC同源物1(BTB domain and CNC homolog 1，BACH1)、基底细胞黏附分子(basal cell adhesion molecule，BCAM)、短链蛋白聚糖(brevican，BCAN)、钙激活核苷酸酶1(calcium activated nucleotidase 1，CANT1)、CCL18、CCL23、CD209、CD300分子样家族成员F(CD300 molecule like family member F，CD300LF)、羧肽酶A2(carboxypeptidase A2，CPA2)、钙释放激活通道调节蛋白2A(calcium release activated channel regulator 2A，CRACR2A)、组织蛋白酶V(cathepsin V，CTSV)、动力蛋白复合物6亚基(dynactin subunit 6，DCTN6)、FK506结合蛋白5(FK506 binding protein 5，FKBP5)、多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶10(polypeptide N-Acetylgalactosaminy ltransferase 10，GALNT10)、HtrA丝氨酸肽酶2(htrA serine peptidase 2，HTRA2)、透明质酸酶1(hyaluronidase 1，HYAL1)、肌醇单磷酸酶1(inositol monophosphatase 1，IMPA1)、IRRE类似家族2(kin of irre like 2，KIRREL2)、半乳糖凝集素7(galectin 7，LGALS7)、富含亮氨酸的重复序列25(leucine rich repeat containing 25，LRRC25)、微纤维相关蛋白5(microfibril associated protein 5，MFAP5)、NAD激酶(NAD kinase，NADK)、烟酰胺核苷酸腺苷酸转移酶1(nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 1，NMNAT1)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型1(protein tyrosine phosphatase nonreceptor Type 1，PTPN1)、抵抗素(resistin，RETN)、突触融合蛋白8(syntaxin 8，STX8)、TEK受体酪氨酸激酶(tek receptor tyrosine kinase，TEK)、含免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1 (tyrosine kinase with immunoglobulin like and EGF like domains 1，TIE1)、泛素特异性肽酶8(ubiquitin specific
peptidase 8，USP8)及含von Willebrand因子C结构域2(Von willebrand factor C domain containing 2，VWC2)，这可能与骨质疏松症的风险增加有关。经Bonferroni校正后，只有C19orf12 (P=2.967×10-5)与骨质疏松症存在显著因果关系，详见表1及图2。
2.2 敏感性分析结果敏感性分析的相关结果详见表1。在多效性检验中，50种血浆蛋白的P值均大于0.05，同时MR-PRESSO也进一步表明文章结果不存在水平多效性。此外，经Cochrane’s Q检验，未发现异质性。留一法进一步提示分析结果较为稳健，见图3，4。漏斗图中呈现的因果效应分布基本具有对称性，未见明显偏倚，见图5，6。
2.3 网络分析及功能富集结果文章将孟德尔随机化分析获取的50个蛋白上传到String数据库进行分析，并将String结果导入Cytoscape 3.9.0，去除孤立节点后构建了PPI网络，该网络由34个节点和49条边组成，平均节点度为1.96，其中节点度值位于前10的核心蛋白为EGF、CCL5、CXCL13、CXCL5、VEGFC、CCL18、CCL17、TEK、TIE1和CCL23，详见图7。GO分析如图8所示，在生物过程(biological process，BP)方面，主要富集于白细胞迁移(leukocyte migration)、细胞趋化(cell chemotaxis)过程；细胞组分(cellular component，CC)方面主要定位在囊泡腔(vesicle lumen)、分泌颗粒腔(secretory granule lumen)等；分子功能(molecular function，MF)方面主要涉及信号受体激活因子活性(signaling receptor activator activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、趋化因子受体结合(chemokine receptor binding)等。KEGG分析结果显示，显著富集的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、趋化因子信号通路(chemokine signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling
pathway)、溶酶体(Lysosome)和细胞凋亡(Apoptosis)，详见图9。这些通路强调了蛋白靶标在细胞因子介导的信号传导和免疫系统调节中的核心作用。

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引言

骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，以骨量丢失和骨组织微结构退化为主要特征，从而降低骨骼的机械强度，增加脆性骨折的风险，极易引起老年患者残疾与死亡[1-5]。骨质疏松症及其导致的脆性骨折正逐渐成为人口老龄化的主要健康问题[6]。因此，寻找新的治疗靶点防治骨质疏松症至关重要。
血浆蛋白作为生物体内分子途径的关键调节因子，参与调控信号传导、物质运输、细胞生长、组织修复及免疫防御等众多复杂的生物过程[7]。它们的异常表达在多种疾病的发生发展中扮演着重要角色，因此，血浆蛋白也被视为药物开发的重要靶点。近年来，多项研究揭示了血浆蛋白与骨质疏松症之间的密切联系。例如，一项研究发现血清铁蛋白水平与髋部及腰椎骨密度呈负相关，且在骨质疏松患者中，血清铁蛋白水平显著高于骨量正常者[8]。此外，特定血浆蛋白Klotho与血液透析患者的骨密度变化相关，其水平升高可能降低慢性肾脏病透析患者矿物质和骨代谢紊乱以及低骨密度的发生[9]。还有研究指出，在≥50岁的2型糖尿病男性患者中，较高的血红蛋白水平与股骨颈骨密度的增加有关[10]。这些研究表明，血浆蛋白可能在骨密度的调节和骨质疏松症的发展中起着至关重要的作用。然而，由于这些研究大多为观察性研究，可能受到混杂因素和反向因果关系的影响，加之血浆蛋白种类复杂，因此需要更全面和系统的证据来深入理解它们与骨质疏松症之间的关系。
孟德尔随机化作为一种遗传流行病学研究方法，利用单核苷酸多态性作为工具变量，评估暴露因素与结局之间的潜在因果关系，有效避免了混淆因素和反向因果关系的干扰[11]。近年来，血浆蛋白的全基因组关联研究已鉴定出调控蛋白质表达的特定单核苷酸多态性，这些单核苷酸多态性与蛋白质丰度的数量性状呈正比关系，能够揭示与这些蛋白质相关的遗传变异，称为蛋白质数量性状位点(protein quantitative trait loci，pQTL)。目前，基于血浆蛋白数量性状位点的孟德尔随机化研究已经为2型糖尿病和脑卒中等疾病的潜在治疗靶点提供了重要参考[12-13]，然而在骨质疏松症等方面鲜有研究。因此，文章使用两样本孟德尔随机化对1 001种血浆蛋白进行分析，以识别影响骨质疏松症的因果蛋白，并进一步构建蛋白质-蛋白质相互作用网络及功能富集分析明确核心蛋白及相关的潜在作用机制，不仅为骨质疏松症药物靶点挖掘及防治提供重要的见解，也为后续骨组织工程研究开发新的靶向治疗策略奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计文章符合STROBE-孟德尔随机化研究规范，以血浆蛋白为暴露因素，选取与其显著相关的单核苷酸多态性作为工具变量，骨质疏松症作为结局变量。通过两样本孟德尔随机化分析方法，探讨其因果关系，并进行敏感性分析以验证结果的可靠性。为了确保所选工具变量的适用性，基于以下3个关键假设[14]：①工具变量与血浆蛋白之间存在显著的关联；②工具变量与血浆蛋白及骨质疏松症关联的所有混杂因素均不相关；③工具变量只能通过与血浆蛋白的关联影响结局，即工具变量与结果之间不存在水平多效性效应，详见图1。
1.2 时间及地点于2024年 5-6月在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院完成。
1.3 资料文章中血浆蛋白的数据来自2024年SUHRE等[15]发表于Cell Genomics的研究成果，该研究团队基于Olink平台中54 000个样本测量的蛋白质组学数据进行分析，发现了1 001种独特的循环血浆蛋白及其pQTLs数据，数据下载于UK Biobank数据库(https://ukbiobank.dnanexus.com/)。结局骨质疏松症的全基因组关联研究汇总数据来自FinnGen数据库(https://www.finngen.fi/en)发布的R11数据(M13_OSTEOPOROSIS)，均来自欧洲人群，包括9 046例骨质疏松症患者及429 826例对照。以上数据均来自公开发表的全基因组关联研究数据，已获取了伦理批准和知情同意，因此不再需要单独的伦理审查。
1.4 方法
1.4.1 工具变量对血浆蛋白相关的pQTLs数据的分析需要满足以下标准[11]：①pQTL根据其基因组位置分为顺式pQTL(距离基因起始位置1 MB以内的单核苷酸多态性)和反式pQTL(距离基因起始位置1 MB以上的单核苷酸多态性)两种类型，顺式pQTL被定义为位于相应蛋白质编码基因附近或内部的变异，而反式pQTL则远离相应基因[16-18]。与反式pQTL相比，顺式pQTL更容易直接影响基因，更不容易发生水平多效性。因此，文章只纳入距离基因起始位置1 MB以内的顺式pQTL；②具有显著的全基因组关联(P < 5×10-8)；③位于主要组织相容性复合体以外的区(chr 6，26-34 Mb)；④连锁不平衡参数r2 < 0.1，遗传距离为1 000 kb[19]；⑤为了避免弱工具偏倚，排除强度较弱的单核苷酸多态性(F统计量< 10)，F 值的计算公式如下：F=[(n-k-1)/k]×R2/(1-R2)。其中，R2表示单核苷酸多态性解释的暴露方差，n表示暴露数据中的样本数量，k表示单核苷酸多态性的数量。R2的计算公式如下：R2=2×β2×EAF×(1-EAF)/[2×β2×EAF×(1-EAF)+SE2×2×N×EAF×(1-EAF)]。其中，EAF 代表效应等位基因频率，β代表

等位基因效应值，SE 代表标准误差。最后，通过回文序列检测删除回文单核苷酸多态性，以防止等位基因对结果产生影响。
1.4.2 孟德尔随机化分析采用R version 4.2.1中的“TwoSampleMR”包，以血浆蛋白作为暴露，骨质疏松症作为结局进行孟德尔随机化分析。Wald比率法用于评估单个单核苷酸多态性暴露的因果效应，而逆方差加权法用于评估两个或多个单核苷酸多态性暴露。因此，如果在分析中只有一个独立的pQTL可用，则通过Wald比率估算孟德尔随机化效应[20]；如果有两个或更多可用，则通过逆方差加权法估算[21]。由于逆方差加权法检验效能较高，文章将其作为最主要的孟德尔随机化方法[22]。为避免未知和不可测量的混杂因素的干扰，同时采用MR-Egger回归、加权中位数、简单模型和加权模型分析方法对得出的孟德尔随机化结果进行检验以辅助分析。
1.4.3 敏感性分析 MR-Egger方法可以评估和调整所选遗传变异的水平多效性的影响，因此使用MR-Egger回归法检测多效性[23]。为确保结果的准确性，进一步使用MR-PRESSO检验进行多效性分析；其次，应用Cochrane’s Q统计法来评估单核苷酸多态性之间的异质性。在Cochrane’s Q统计中，若P > 0.05，则表示没有异质性。最后，进行留一法分析，以确定因果关系是否受到单个单核苷酸多态性的影响。
1.4.4 网络分析及功能富集分析将孟德尔随机化研究中获得的血浆蛋白上传至String 12.0数据库进行网络拓扑分析，蛋白质类型和最小相互作用阈值分别设置为“Homo sapiens”和0.4，并将String结果导入Cytoscape 3.9.0软件，去除孤立点后构建蛋白质-蛋白质互相网络，将度值位于前10的节点视为核心蛋白。此外，基于R 4.2.1，采用clusterProfiler包对相关靶标进行基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，探索潜在的作用机制，并使用ggplot2包对富集分析结果进行可视化。
1.5 主要观察指标 1 001种血浆蛋白与骨质疏松症的因果关联、敏感性分析验证结果的稳健性以及血浆蛋白的功能相关性及潜在作用机制。
1.6 统计学分析文章涉及的统计学分析均通过R version 4.2.1软件中的“TwoSampleMR”包来完成。结果以OR值和95%置信区间(95%CI)来解释。在分析中采用Bonferroni校正来解释多重检验，并设置阈值P=4.995×10-5(0.05/1 001)。P < 4.995×10-5时被视为具有显著性意义的关联证据，P值介于4.995×10-5-0.05时，被视为可能存在提示性的关联[24]。文章统计学方法已经通过上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院统计学专家审核。

讨论

文章采用两样本孟德尔随机化研究方法，分析了蛋白质组学中1 001种血浆蛋白对骨质疏松症的因果效应。其中，共确定了50个与骨质疏松症有因果关联的血浆蛋白，有20种可能与骨质疏松症的风险降低显著相关，30种蛋白可能显著增加骨质疏松症的风险。经Bonferroni校正后，只有C19orf12(P=2.967×10-5)与骨质疏松症存在显著因果关系。此外，敏感性分析也确定了结果的稳健性。通过PPI网络明确了蛋白间的相互作用，并识别到了EGF，CCL5，CXCL13，CXCL5，VEGFC，CCL18，CCL17，TEK，TIE1和CCL23为核心蛋白。GO分析结果显示，在生物过程方面，显著富集于细胞迁移及趋化过程；细胞组分方面主要定位于囊泡腔等；分子功能方面涉及信号受体激活因子活性、细胞因子及趋化因子受体结合；KEGG通路分析显示这些蛋白靶标参与了细胞因子相互作用、趋化因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。综合来看，免疫系统的信号传导、细胞迁移和趋化与骨质疏松症密切相关。
C19orf12是文章中唯一符合Bonferroni校正阈值的蛋白，提示其与骨质疏松症显著的因果关系。既往研究表明，C19orf12突变与一系列线粒体功能障碍相关，包括线粒体呼吸受损、线粒体长度缩短、活性氧水平升高以及脂质过氧化的增加[25-26]。此外，VENCO等[27]的研究进一步证实C19orf12基因突变会损害线粒体功能和钙离子稳态，由于线粒体功能障碍与骨质疏松症之间关系密切[28-29]，文章推测C19orf12可能通过影响线粒体功能参与骨质疏松症的发病过程。值得注意的是，文章在PPI网络中识别到了核心蛋白，如EGF，CCL5，CXCL13，CXCL5，VEGFC，CCL18，CCL17，TEK，TIE1和CCL23。EGF是一种单链多肽，它可以识别并结合表皮生长因子受体在靶细胞上表达以发挥其生物学作用。GENETOS等[30]研究发现表皮生长因子/表皮生长因子受体信号通路与骨稳态调节有关，它可以促进成骨细胞增殖和分化，从而加速骨形成，这与文章预测的EGF与骨质疏松症呈负向因果关联的结果相一致。此外，趋化因子是一类重要的同源肝素结合蛋白，它们在多种生物过程中扮演着关键角色，包括免疫细胞归巢，发育，炎症反应以及血管生成等[31]。文章中CXCL5和CXCL13属于C-X-C基序趋化因子，而CCL5，CCL17，CCL18及CCL23则属于C-C基序趋化因子。C-X-C基序趋化因子，例如CXCL5，通过其促炎特性，能够促进中性粒细胞的迁移和活化，从而增强炎症反应[32]。同样，有研究指出CXCL13通过与其受体结合，促进肿瘤坏死因子α的表达影响炎症反应[33]，这一过程可能导致骨吸收的增加，进而触发骨质疏松症的发生。另一方面，C-C基序趋化因子如CCL5，通过与其受体结合激活破骨细胞，促进其分化和活性，增加骨吸收，加速骨质的流失[34]。这一结果与文章中CCL5作为骨质疏松症的保护因素相反，然而WINTGES等[35]研究发现，在6月龄的CCL5缺乏小鼠中，骨形成受损，骨吸收增加。BRYLKA等[36]研究也指出，CCL5在成骨细胞祖细胞的募集中起着关键作用，这为CCL5在文章中成为骨质疏松症的保护因素提供了合理的解释。CCL18也被发现在破骨细胞分化过程中表达增强，与骨质疏松症表型高度相关[37]。不仅如此，亦有研究发现CCL23在骨吸收部位的破骨细胞前体募集中发挥重要作用[38]。
文章的研究结果也发现这些趋化因子在细胞因子相互作用、趋化因子及肿瘤坏死因子信号通路方面显著富集，进一步表明，C-X-C基序趋化因子和C-C基序趋化因子可能通过复杂的细胞信号传导途径，对骨代谢平衡产生重要影响。VEGFC是血管内皮生长因子家族中的重要成员，近期研究显示血管内皮生成因子甲基化能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，进而调控骨形成[39]，这表明VEGFC可能通过影响干细胞的分化过程来调控骨形成，进而影响骨质疏松症。此外，TEK和TIE1是两种不同的跨膜蛋白受体酪氨酸激酶[40]，有研究证实它们在抑制血管生成过程中发挥重要作用[41]。然而，目前关于这两种受体在骨质疏松症中的作用尚不明确，这为未来的研究提供了新的视角和潜在的研究方向。深入理解这些核心蛋白在骨质疏松症中的作用机制，可能为开发新的治疗策略提供重要的分子靶点。
GO及KEGG富集分析揭示了这些蛋白靶标在免疫反应中扮演的关键角色，进一步强调了免疫系统在骨质疏松症发生发展中的潜在重要性。在正常的机体微环境中，成骨细胞形成骨和破骨细胞吸收骨之间存在平衡，维持骨量和骨密度在正常范围内。然而，这种平衡在骨质疏松症患者中被破坏，骨吸收超过骨形成，由成骨细胞的抑制或破骨细胞的过度激活引发，这一过程称为骨重塑[42]。在骨重塑过程中，免疫系统通过免疫细胞、细胞因子和信号通路发挥着至关重要的作用[43]。逐渐增多的研究指出，骨质疏松症患者的骨骼系统与免疫系统之间存在着密切的交互作用。特别是，免疫细胞在骨重塑中的作用已经得到了广泛认可[44]。有证据表明，成骨细胞和破骨细胞的活性不仅受到局部微环境的调节，还受到免疫细胞分泌的多种可溶性介质的影响[45-46]，包括细胞因子及趋化因子等[47]，这些介质在骨质疏松症的发展中起着至关重要的作用[48-49]。文章结果发现因果蛋白的功能富集与细胞因子受体结合、趋化因子受体结合以及信号受体激活因子活性密切相关，进一步强调了免疫介质在骨重塑过程中的重要性。此外，细胞因子网络和信号通路作为骨重塑的关键调节因素，其研究已经形成了较为系统的理论基础[50-51]，这也在该文的KEGG富集结果中得到了印证。深入探究免疫系统如何调控骨细胞活性以及骨重塑平衡，不仅有助于文章揭示骨质疏松症的复杂病理机制，而且对于开发有效的治疗策略具有重要意义。
文章与WU等[52]的先前研究均揭示了血浆蛋白对骨质疏松症发病风险的显著影响。尽管WU等[52]提出血浆蛋白可能通过参与胶原结合和调节细胞外基质来影响骨质疏松，但这一发现并未削弱文章对血浆蛋白与骨质疏松症之间因果关系的理解，这种差异可能源于文章与他们研究中使用的血浆蛋白数据来源不同。此外，文章虽然提供了新的见解，但也存在一些局限性，需要在后期的研究中加以解决和完善。首先，文章中使用的全基因组关联研究数据主要来源于具有欧洲血统的队列，由于不同种族间可能存在显著的遗传差异，这可能限制了研究结果对于其他种族人群的普遍适用性和解释力；其次，尽管文章在选择工具变量时遵循了严格的标准，并采用了多项敏感性分析以增强研究结果的稳健性，但水平多效性的潜在影响仍然不能完全被排除；此外，文章在结局中采用了骨质疏松症的全基因组关联研究数据，但没有对骨质疏松症的不同亚型进行细分，骨质疏松症是一个包含多种不同病理机制的疾病，对这些亚型进行区分可能有助于更精确地识别疾病相关因素；最后，在分析过程中，为了确保研究结果的清晰性，文章排除了一些可能具有水平多效性或表现出较大异质性的蛋白，这些蛋白可能在骨质疏松症的发病机制中也扮演着关键角色。
综上，文章采用了两样本孟德尔随机化及敏感性分析，系统评估了1 001种血浆蛋白与骨质疏松症的潜在因果关联，这种基于国际大规模数据库信息来源驱动的分析策略，为中国人群的相关研究提供了新的思路，尤其是在识别新的生物标志物和药物靶点方面，具有重要的参考意义。其次，通过构建蛋白-蛋白互作网络并进行功能富集分析，文章发现了免疫系统信号传导、细胞迁移和趋化等过程在骨质疏松症发病机制中的关键作用，这为特定遗传背景和环境因素下的骨质疏松症研究提供了新的方向，有助于深入理解其分子机制。最后，研究中识别的核心蛋白(如EGF，CCL5及CXCL13等)有望成为新的生物标志物或药物靶点，为骨质疏松症的精准防治提供新的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

血浆蛋白与骨质疏松症的关系及潜在治疗靶点：基于国际UK Biobank数据库信息

Association between plasma proteins and osteoporosis and identification of potential therapeutic targets: information analysis based on the UK Biobank database

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