β-羟基丁酸改善β淀粉样蛋白1-42诱导小鼠海马神经元HT22细胞的能量障碍

doi:10.12307/2025.074

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2713-2719.doi: 10.12307/2025.074

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β-羟基丁酸改善β淀粉样蛋白1-42诱导小鼠海马神经元HT22细胞的能量障碍

叶育采1，付朝晶1，李燕2，李欣儒1，柴世凡1，蔡红艳3，王昭君1

山西医科大学，1基础医学院生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，2医学科学院，3基础医学院微生物与免疫学教研室，山西省太原市 030000

收稿日期:2024-03-07 接受日期:2024-05-07 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 王昭君，博士，副教授，山西医科大学基础医学院生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，山西省太原市 030000
作者简介:叶育采，女，1998年生，广东省茂名市人，汉族，山西医科大学基础医学院生理学系在读硕士，主要从事阿尔茨海默病的防治及机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82171428)，项目负责人：蔡红艳；山西省基础研究自然科学研究面上项目(20210302123306)，项目负责人：王昭君

Beta-hydroxybutyric acid improves energy dysfunction of mouse hippocampal neuron HT22 cells induced by amyloid-β protein 1-42

Ye Yucai1, Fu Chaojing1, Li Yan2, Li Xinru1, Chai Shifan1, Cai Hongyan3, Wang Zhaojun1

Wang Zhaojun, PhD, Associate professor, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Key Laboratory of Cell Physiology, Ministry of Education, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

Received:2024-03-07 Accepted:2024-05-07 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Wang Zhaojun, PhD, Associate professor, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Key Laboratory of Cell Physiology, Ministry of Education, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
About author:Ye Yucai, Master candidate, Department of Physiology, School of Basic Medicine, Shanxi Medical University, Key Laboratory of Cell Physiology, Ministry of Education, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 82171428 (to CHY); Shanxi Province Basic Research Natural Science Research (General Project), No. 20210302123306 (to WZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

α-酮戊二酸脱氢酶：三羧酸循环中一种催化α-酮戊二酸琥珀酰辅酶反应的复合酶，有利于ATP产生。
Na+K+-ATP酶：为细胞膜中存在的一种特殊蛋白质，可以分解ATP获得能量，并利用此能量进行Na+、K+的主动转运，即能逆浓度梯度把Na+从细胞内转运到细胞外，把K+从细胞外转运入细胞内，控制细胞膜内外的K+和Na+浓度差，维持细胞内外液的渗透压。
线粒体生物能量功能：即线粒体生物能量学，指正常线粒体为细胞提供基本能量，包括通过电子传递链产生ATP，通过线粒体过渡孔调节钙处理和代谢，通过三羧酸循环中乙酰辅酶A的氧化产生能量，以及通过线粒体动力学(包括线粒体裂变和融合)维持线粒体完整性。线粒体生物能量丢失与人类疾病的发病机制有关。

摘要
背景：阿尔茨海默病患者存在严重的脑能量障碍，近年来基于酮体干预的脑能量拯救策略在阿尔茨海默病的治疗中越来越受到重视。
目的：探讨β-羟基丁酸能否改善β淀粉样蛋白1-42(β-amyloid protein 1-42，Aβ1-42)诱导的小鼠海马神经元HT22细胞能量障碍。
方法：将HT22细胞分为4组，分别为对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组。使用相应试剂盒检测HT22细胞的存活率、ATP水平、α-酮戊二酸脱氢酶活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位及活性氧水平。
结果与结论：与对照组相比，Aβ1-42组HT22细胞的存活率、ATP水平、α-酮戊二酸脱氢酶活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位均显著降低(P < 0.05)，活性氧水平显著升高(P < 0.05)。与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组HT22细胞的存活率、ATP水平、α-酮戊二酸脱氢酶活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位均显著升高(P < 0.05)，活性氧水平显著降低(P < 0.05)。结果表明：β-羟基丁酸提高了线粒体生物能量功能和细胞存活率，最终改善了Aβ1-42诱导的HT22细胞能量障碍。

https://orcid.org/0000-0003-2725-2358 (叶育采)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 阿尔茨海默病, HT22细胞, β-羟基丁酸, 线粒体生物能量功能, 能量障碍, 三磷酸腺苷

Abstract: BACKGROUND: Patients with Alzheimer’s disease have severe brain energy disorders. In recent years, brain energy rescue strategies based on ketone body intervention have attracted more and more attention in the treatment of Alzheimer’s disease.
OBJECTIVE: To investigate whether β-hydroxybutyric acid can improve energy dysfunction by improving mitochondrial bioenergy function in HT22 cells of mouse hippocampal neurons induced by amyloid-β protein 1-42 (Aβ1-42).
METHODS: HT22 cells were divided into four groups: Control, β-hydroxybutyric acid, Aβ1-42, Aβ1-42+ β-hydroxybutyric acid. Related detection kits were respectively used to detect HT22 cell survival rate, adenosine triphosphate level, α-ketoglutarate dehydrogenase activity, Na+K+-ATPase activity, mitochondrial membrane potential, and reactive oxygen species levels.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the survival rate, adenosine triphosphate level, α-ketoglutarate dehydrogenase activity, Na+K+-ATPase activity, and mitochondrial membrane potential of HT22 cells were significantly decreased (P < 0.05), and the level of reactive oxygen species was significantly increased (P < 0.05) in the Aβ1-42 group. Compared with the Aβ1-42 group, the survival rate, adenosine triphosphate level, α-ketoglutarate dehydrogenase activity, Na+K+-ATPase activity, and mitochondrial membrane potential of HT22 cells were significantly increased (P < 0.05), and the reactive oxygen species level was significantly decreased (P < 0.05) in the Aβ1-42+β-hydroxybutyric acid group. These results showed that β-hydroxybutyric acid improved mitochondrial bioenergetic function and ultimately improved Aβ1-42-induced energy impairment and survival rate in HT22 cells.

Key words: Alzheimer’s disease, HT22 cell, β-hydroxybutyric acid, mitochondrial bioenergetic function, energy dysfunction, adenosine triphosphate

中图分类号:

叶育采, 付朝晶, 李燕, 李欣儒, 柴世凡, 蔡红艳, 王昭君. β-羟基丁酸改善β淀粉样蛋白1-42诱导小鼠海马神经元HT22细胞的能量障碍[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2713-2719.

Ye Yucai, Fu Chaojing, Li Yan, Li Xinru, Chai Shifan, Cai Hongyan, Wang Zhaojun. Beta-hydroxybutyric acid improves energy dysfunction of mouse hippocampal neuron HT22 cells induced by amyloid-β protein 1-42[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2713-2719.

图/表（结果） 1

2.1 β-羟基丁酸改善Aβ1-42诱导的HT22细胞的存活率 对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组的细胞存活率分别为(101.080±1.738)%，(107.955±0.898)%，(42.375±1.916)%，(61.320±2.427)%。与对照组相比，β-羟基丁酸组的细胞存活率无统计学差异(P > 0.05)，Aβ1-42组的细胞存活率明显下降(P < 0.001)，提示Aβ1-42对HT22细胞具有损伤作用；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的细胞存活率明显升高(P < 0.001)，提示β-羟基丁酸提高了Aβ1-42诱导的HT22细胞的存活率，见图1。
2.2 β-羟基丁酸增加Aβ1-42诱导HT22细胞的ATP水平，改善能量缺陷 对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组细胞的ATP相对浓度(nmol/mg)分别为24.644±1.179，43.547±1.423，13.369±0.069，42.653±2.294。与对照组相比，β-羟基丁酸组的ATP相对浓度明显升高(P < 0.001)，表明β-羟基丁酸促进ATP生成。与对照组相比，Aβ1-42组的ATP相对浓度明显下降(P < 0.01)；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的ATP相对浓度明显升高(P < 0.001)，表明β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导的HT22细胞的ATP水平，改善能量缺陷，见图2。
2.3 β-羟基丁酸增加Aβ1-42诱导HT22细胞的α-KGDH活性，促进ATP生成 对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组细胞的α-KGDH的相对活性(U/mg)分别为6.035±0.749，10.298±1.372，2.245±0.622，12.429±1.068。与对照组相比，β-羟基丁酸组的α-KGDH相对活性明显升高(P < 0.01)，表明β-羟基丁酸有利于ATP的生成。与对照组相比，Aβ1-42组的α-KGDH相对活性明显下降(P < 0.05)；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的α-KGDH相对活性明显升高(P < 0.001)，提示β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导的HT22细胞的α-KGDH活性，促进ATP生成，见图3。
2.4 β-羟基丁酸增加Aβ1-42诱导HT22细胞的Na+K+-ATP酶活性，促进ATP分解产能 对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组细胞Na+K+-ATP酶的相对活性(U/mg)分别为0.859±0.058，1.420±0.118，0.356±0.068，1.960±0.131。与对照组相比，β-羟基丁酸组的Na+K+-ATP酶相对活性升高(P < 0.05)，表明β-羟基丁酸有利于ATP分解产能。与对照组相比，Aβ1-42组Na+K+-ATP酶的相对活性下降(P < 0.05)；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组Na+K+-ATP酶的相对活性明显升高(P < 0.001)，提示β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导的HT22细胞的Na+K+-ATP酶活性，促进ATP分解产能，有利于满足神经功能的高能量需求，见图4。
2.5 β-羟基丁酸增加Aβ1-42诱导HT22细胞的线粒体膜电位，改善线粒体生物能量功能 在倒置荧光显微镜×100倍镜下观察线粒体膜电位，与对照组相比，β-羟基丁酸组的红色荧光明显增加，提示β-羟基丁酸促进线粒体膜电位升高。与对照组相比，Aβ1-42组的红色荧光明显减少，绿色荧光明显增加；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的绿色荧光明显减少，红色荧光增加，提示Aβ1-42诱导线粒体膜电位受损，β-羟基丁酸提高了Aβ1-42诱导的HT22细胞的线粒体膜电位，见图5A。
使用多功能酶标仪测量JC-1 Red/JC-1 Green值，对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组细胞的JC-1 Red/JC-1 Green值分别为5.576±0.131，9.546±0.387，4.179±0.081，5.238±0.228。与对照组相比，β-羟基丁酸组的JC-1 Red/JC-1 Green值明显升高(P < 0.001)，表明β-羟基丁酸改善线粒体膜电位。与对照组相比，Aβ1-42组的JC-1 Red/JC-1 Green值明显下降(P < 0.01)；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的JC-1 Red/JC-1 Green值明显升高(P < 0.05)，见图5B，提示β-羟基丁酸提高了Aβ1-42诱导的HT22细胞的线粒体膜电位，改善线粒体生物能量功能。
2.6 β-羟基丁酸降低Aβ1-42诱导HT22细胞的活性氧水平，改善氧化应激 在倒置荧光显微镜的×100倍镜下观察活性氧水平，与对照组相比，Aβ1-42组的绿色荧光明显增加；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的绿色荧光明显减少，提示Aβ1-42诱导活性氧增加，β-羟基丁酸降低了Aβ1-42诱导的HT22细胞的活性氧水平，见图6A。
使用多功能酶标仪测量细胞活性氧荧光值，对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组细胞的活性氧相对荧光值(AU)分别为0.623±0.071，0.572±0.108，2.208±0.098，0.992±0.088。与对照组相比，β-羟基丁酸组的活性氧水平无统计学差异(P > 0.05)，Aβ1-42组的活性氧水平明显增加(P < 0.001)，提示Aβ1-42对HT22细胞具有氧化损伤作用；与Aβ1-42组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的活性氧水平明显降低(P < 0.001)，见图6B，提示β-羟基丁酸降低Aβ1-42诱导的HT22细胞的活性氧水平，有利于改善氧化应激。

参考文献

[1] BELFIORE R, RODIN A, FERREIRA E, et al. Temporal and regional progression of Alzheimer’s disease-like pathology in 3xTg-AD mice. Aging Cell. 2019;18(1):e12873.
[2] PANG K, JIANG R, ZHANG W, et al. An App knock-in rat model for Alzheimer’s disease exhibiting Aβ and tau pathologies, neuronal death and cognitive impairments. Cell Res. 2022;32(2):157-175.
[3] BALUSU S, HORRÉ K, THRUPP N, et al. MEG3 activates necroptosis in human neuron xenografts modeling Alzheimer’s disease. Science. 2023;381(6663):1176-1182.
[4] HOWARTH C, GLEESON P, ATTWELL D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. J Cereb Blood Flow Metab. 2012;32(7):1222-1232.
[5] CUNNANE SC, TRUSHINA E, MORLAND C, et al. Brain energy rescue: an emerging therapeutic concept for neurodegenerative disorders of ageing. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(9):609-633.
[6] ROLFE DF, BROWN GC. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 1997;77(3): 731-758.
[7] TAKAHASHI S. Neuroprotective Function of High Glycolytic Activity in Astrocytes: Common Roles in Stroke and Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6568.
[8] PAN RY, HE L, ZHANG J, et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer’s disease. Cell Metab. 2022;34(4):634-648.e6.
[9] SAITO ER, MILLER JB, HARARI O, et al. Alzheimer’s disease alters oligodendrocytic glycolytic and ketolytic gene expression. Alzheimers Dement. 2021;17(9):1474-1486.
[10] ZHANG SS, ZHU L, PENG Y, et al. Long-term running exercise improves cognitive function and promotes microglial glucose metabolism and morphological plasticity in the hippocampus of APP/PS1 mice. J Neuroinflammation. 2022;19(1):34.
[11] LI S, SHENG ZH. Energy matters: presynaptic metabolism and the maintenance of synaptic transmission. Nat Rev Neurosci. 2022;23(1):4-22.
[12] TZIORAS M, MCGEACHAN RI, DURRANT CS, et al. Synaptic degeneration in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 2023;19(1):19-38.
[13] ASHLEIGH T, SWERDLOW RH, BEAL MF. The role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease pathogenesis. Alzheimers Dement. 2023;19(1):333-342.
[14] VENKATARAMAN AV, MANSUR A, RIZZO G, et al. Widespread cell stress and mitochondrial dysfunction occur in patients with early Alzheimer’s disease. Sci Transl Med. 2022;14(658):eabk1051.
[15] HUANG CW, RUST NC, WU HF, et al. Low glucose induced Alzheimer’s disease-like biochemical changes in human induced pluripotent stem cell-derived neurons is due to dysregulated O-GlcNAcylation. Alzheimers Dement. 2023;19(11):4872-4885.
[16] AN Y, VARMA VR, VARMA S, et al. Evidence for brain glucose dysregulation in Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement. 2018;14(3): 318-329.
[17] KÜNTZELMANN A, GUENTHER T, HABERKORN U, et al. Impaired cerebral glucose metabolism in prodromal Alzheimer’s disease differs by regional intensity normalization. Neurosci Lett. 2013;534:12-17.
[18] WANG W, ZHAO F, MA X, et al. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 2020;15(1):30.
[19] SAMANTA S, AKHTER F, ROY A, et al. New cyclophilin D inhibitor rescues mitochondrial and cognitive function in Alzheimer’s disease. Brain. 2023:awad432. doi: 10.1093/brain/awad
[20] BUTTERFIELD DA, HALLIWELL B. Oxidative stress, dysfunctional glucose metabolism and Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 2019;20(3): 148-160.
[21] PUCHALSKA P, CRAWFORD PA. Multi-dimensional Roles of Ketone Bodies in Fuel Metabolism, Signaling, and Therapeutics. Cell Metab. 2017;25(2):262-284.
[22] CUNNANE SC, COURCHESNE-LOYER A, ST-PIERRE V, et al. Can ketones compensate for deteriorating brain glucose uptake during aging? Implications for the risk and treatment of Alzheimer’s disease. Ann N Y Acad Sci. 2016;1367(1):12-20.
[23] MUSA-VELOSO K, LIKHODII SS, CUNNANE SC. Breath acetone is a reliable indicator of ketosis in adults consuming ketogenic meals. Am J Clin Nutr. 2002;76(1):65-70.
[24] MUSA-VELOSO K, LIKHODII SS, RARAMA E, et al. Breath acetone predicts plasma ketone bodies in children with epilepsy on a ketogenic diet. Nutrition. 2006;22(1):1-8.
[25] CROTEAU E, CASTELLANO CA, FORTIER M, et al. A cross-sectional comparison of brain glucose and ketone metabolism in cognitively healthy older adults, mild cognitive impairment and early Alzheimer’s disease. Exp Gerontol. 2018;107:18-26.
[26] CASTELLANO CA, NUGENT S, PAQUET N, et al. Lower brain 18F-fluorodeoxyglucose uptake but normal 11C-acetoacetate metabolism in mild Alzheimer’s disease dementia. J Alzheimers Dis. 2015;43(4):1343-1353.
[27] JENSEN NJ, WODSCHOW HZ, NILSSON M, et al. Effects of Ketone Bodies on Brain Metabolism and Function in Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2020;21(22):8767.
[28] DING F, YAO J, RETTBERG JR, et al. Early decline in glucose transport and metabolism precedes shift to ketogenic system in female aging and Alzheimer’s mouse brain: implication for bioenergetic intervention. PLoS One. 2013;8(11):e79977.
[29] FUKAO T, SONG XQ, MITCHELL GA, et al. Enzymes of ketone body utilization in human tissues: protein and messenger RNA levels of succinyl-coenzyme A (CoA):3-ketoacid CoA transferase and mitochondrial and cytosolic acetoacetyl-CoA thiolases. Pediatr Res. 1997;42(4):498-502.
[30] PELLERIN L, BERGERSEN LH, HALESTRAP AP, et al. Cellular and subcellular distribution of monocarboxylate transporters in cultured brain cells and in the adult brain. J Neurosci Res. 2005;79(1-2): 55-64.
[31] PIERRE K, PELLERIN L. Monocarboxylate transporters in the central nervous system: distribution, regulation and function. J Neurochem. 2005;94(1):1-14.
[32] CUNNANE SC, COURCHESNE-LOYER A, VANDENBERGHE C, et al. Can Ketones Help Rescue Brain Fuel Supply in Later Life? Implications for Cognitive Health during Aging and the Treatment of Alzheimer’s Disease. Front Mol Neurosci. 2016;9:53.
[33] ZHOU Y, SUN L, WANG H. Ketogenic Diet for Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy. ACS Chem Neurosci. 2023;14(1):1-8.
[34] 韩维娜,徐晓庆,史晋宁,等.胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证[J].中国组织工程研究,2024, 28(16):2568-2573.
[35] DE LEON MJ, FERRIS SH, GEORGE AE, et al. Positron emission tomographic studies of aging and Alzheimer disease. AJNR Am J Neuroradiol. 1983;4(3):568-571.
[36] FARIA-PEREIRA A, MORAIS VA. Synapses: The Brain’s Energy-Demanding Sites. Int J Mol Sci. 2022;23(7):3627.
[37] ROJAS-MORALES P, TAPIA E, PEDRAZA-CHAVERRI J. β-Hydroxybutyrate: A signaling metabolite in starvation response? Cell Signal. 2016;28(8): 917-923.
[38] THEVENET J, DE MARCHI U, DOMINGO JS, et al. Medium-chain fatty acids inhibit mitochondrial metabolism in astrocytes promoting astrocyte-neuron lactate and ketone body shuttle systems. FASEB J. 2016;30(5):1913-1926.
[39] TRIGO D, VITÓRIA JJ, DA CRUZ E SILVA OAB. Novel therapeutic strategies targeting mitochondria as a gateway in neurodegeneration. Neural Regen Res. 2023;18(5):991-995.
[40] HUANG WC, PENG Z, MURDOCK MH, et al. Lateral mammillary body neurons in mouse brain are disproportionately vulnerable in Alzheimer’s disease. Sci Transl Med. 2023;15(692):eabq1019.
[41] BLAUSTEIN MP, LARICCIA V, KHANANSHVILI D, et al. Multipurpose Na+ ions mediate excitation and cellular homeostasis: Evolution of the concept of Na+ pumps and Na+/Ca2+ exchangers. Cell Calcium. 2020;87:102166.
[42] JORGENSEN PL, HAKANSSON KO, KARLISH SJ. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions. Annu Rev Physiol. 2003;65:817-849.
[43] HUANG CW, RUST NC, WU HF, et al. Altered O-GlcNAcylation and mitochondrial dysfunction, a molecular link between brain glucose dysregulation and sporadic Alzheimer’s disease. Neural Regen Res. 2023;18(4):779-783.
[44] XIANG X, WIND K, WIEDEMANN T, et al. Microglial activation states drive glucose uptake and FDG-PET alterations in neurodegenerative diseases. Sci Transl Med. 2021;13(615):eabe5640.
[45] FERNANDEZ-PEREZ EJ, MUÑOZ B, BASCUÑAN DA, et al. Synaptic dysregulation and hyperexcitability induced by intracellular amyloid beta oligomers. Aging Cell. 2021;20(9):e13455.
[46] ZOTT B, SIMON MM, HONG W, et al. A vicious cycle of β amyloid-dependent neuronal hyperactivation. Science. 2019;365(6453): 559-565.
[47] ANDERSEN JV, WESTI EW, JAKOBSEN E, et al. Astrocyte metabolism of the medium-chain fatty acids octanoic acid and decanoic acid promotes GABA synthesis in neurons via elevated glutamine supply. Mol Brain. 2021;14(1):132.

引言

阿尔茨海默病起病隐匿、多发生于老年人群，是一种不可逆的神经系统退行性疾病，临床表现为渐进性记忆障碍和认知功能减退，其主要病理特征为进行性神经元丢失和脑萎缩，包括大量β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)聚集形成的老年斑、过度磷酸化tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结[1-3]。成年人的大脑需要大量能量供应以满足各种脑细胞的存活和神经功能的正常运行[4-10]。神经元需要持续的能量供应，其中大部分用于突触传递[11]，而突触丢失与阿尔茨海默病认知能力下降的关系最为密切[12]。在阿尔茨海默病发展过程中，线粒体的结构和功能开始逐渐退化，导致细胞能量供应不足，最终神经突触断裂和记忆减退甚至消失[13]。在正常生理情况下，ATP主要由线粒体氧化磷酸化葡萄糖产生[5]。线粒体功能障碍和脑葡萄糖代谢障碍出现在阿尔茨海默病临床前期且进行性加重[14-16]。在阿尔茨海默病的早期阶段，正电子发射断层扫描显示大脑基础代谢率减退，表明葡萄糖代谢受损和线粒体功能低下[17]。阿尔茨海默病的脑葡萄糖代谢低下通常被解释为通过氧化磷酸化的能量代谢受损，这也强烈暗示线粒体生物能量学异常参与阿尔茨海默病的发生[13-14，18]。在阿尔茨海默病早期，线粒体相关的能量耗竭可能先于糖酵解相关的低代谢[19]。阿尔茨海默病的线粒体功能障碍产生了持续的脑能量缺口，从而导致突触功能障碍、神经元死亡和大脑关键区域变薄[20]。线粒体功能障碍在阿尔茨海默病的发生和进展中起着至关重要的作用[13]，探索挽救或增强阿尔茨海默病患者线粒体功能和能量代谢的治疗策略有重要意义[19]。
酮体是脑葡萄糖的唯一替代燃料，由β-羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮组成[21]。β-羟基丁酸和乙酰乙酸通常以2∶1-3∶1的比例存在于血浆中，β-羟基丁酸是人体循环中最丰富的酮体[22-24]。轻度认知障碍和早期阿尔茨海默病患者大脑对酮的吸收和代谢是正常的，且轻度酮代谢亢进仅出现在大脑的某些区域[22，25-26]。研究发现，轻度认知障碍和早期阿尔茨海默病患者的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的酮体利用速率远远高于葡萄糖的氧化速率[9，27]。适应性脑酮代谢可能是早期阿尔茨海默病脑能量不足的一种积极生理代偿[25]，随着阿尔茨海默病的病情进展，适应性脑酮代谢功能受损，这与线粒体功能的下降相吻合[28]。
β-羟基丁酸的主要生成场所是肝脏，但其在肝脏中不被利用，因为肝细胞缺乏重要的酮分解酶——琥珀酰辅酶a:3-酮酸辅酶a转移酶(由OXCT1基因编码，也称OXCT1酶)。OXCT1在所有含线粒体的哺乳动物细胞中表达，肝细胞除外[21，29]。β-羟基丁酸被肝细胞释放到循环血液中，通过血脑屏障到达神经元[30-31]。脑酮代谢速率与血液循环酮体的浓度呈正比[32-33]，提示β-羟基丁酸干预在改善脑能量障碍中的治疗潜力是巨大的。β-羟基丁酸在神经元线粒体内氧化代谢为乙酰辅酶A[21]，乙酰辅酶A参加三羧酸循环，通过氧化磷酸化产生ATP，为神经元提供能量支持[9]。因此，神经元的线粒体生物能量功能与β-羟基丁酸作为脑替代燃料产生ATP的作用密切相关。该研究通过使用人源Aβ1-42和小鼠海马神经元HT22细胞系建立阿尔茨海默病神经元模型，探讨β-羟基丁酸能否改善Aβ1-42诱导HT22细胞的线粒体生物能量功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 使用小鼠海马神经元HT22细胞系和Aβ1-42建立阿尔茨海默病神经元模型进行体外实验，研究β-羟基丁酸对Aβ1-42诱导HT22细胞的线粒体生物能量功能是否具有改善作用。
1.2 时间及地点 实验于2023年8-11月在山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室完成。
1.3 材料 小鼠海马神经元HT22细胞系 (中国医学科学院基础医学研究所)；人源Aβ1-42(上海强耀生物，中国)；β-羟基丁酸(HY-113378，MCE，美国)；ATP检测试剂盒(S0026，碧云天，中国)；α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH)活性检测试剂盒(BC0715，Solarbio，中国)；Na+K+-ATP酶活性检测试剂盒(BC0065，Solarbio，中国)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(C2006，碧云天，中国)；活性氧测定试剂盒(E004-1-1，南京建成，中国)；CCK-8试剂盒(AR1160，BOSTER，中国)；DMEM高糖培养基(PYG0073，BOSTER，中国)；胎牛血清(SA211，Cellmax，中国)；细胞培养级BS(MA0015，美仑，中国)；改良型0.25% EDTA胰酶(MA0232，美仑，中国)；青链霉素混合液(P1400，Solarbio，中国)；培养箱除菌剂(MA0638，美仑，中国)；水盘除菌剂(MA0637，美仑，中国)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养及分组 使用Aβ1-42构建阿尔茨海默病细胞模型是一种公认的造模手段。将小鼠海马神经元HT22细胞系分为以下4组：对照组、β-羟基丁酸组、Aβ1-42组、Aβ1-42+β-羟基丁酸组，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育。①首先，HT22细胞在含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素混合物的DMEM高糖培养基中孵育24 h。②第2天，对照组和β-羟基丁酸组更换为含体积分数2%胎牛血清和1%青霉素混合物的DMEM高糖培养基，Aβ1-42和Aβ1-42+β-羟基丁酸组更换为含20 μmol/L人源Aβ1-42[34]、体积分数2%胎牛血清和1%青霉素混合物的DMEM高糖培养基，孵育24 h。③第3天，对照组和Aβ1-42组更换为含体积分数2%胎牛血清和1%青霉素混合物的DMEM高糖培养基，β-羟基丁酸组和Aβ1-42+β-羟基丁酸组更换为含7 mmol/L β-羟基丁酸、体积分数2%胎牛血清和1%青霉素混合物的DMEM高糖培养基，孵育24 h。④第4天，各组细胞用胰蛋白酶在37 ℃下消化3 min，再用DMEM高糖培养基终止消化，然后进行细胞存活率、ATP含量、α-KGDH活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位和活性氧水平的检测。
营养性酮症是一种安全且持续的生理状态，β-羟基丁酸浓度大于500 μmol/L；而人体酮症酸中毒时β-羟基丁酸浓度大于7 mmol/L，可积累至20 mmol/L。在预实验中选择0-7 mmol/L β-羟基丁酸浓度范围内做CCK-8实验，发现7 mmol/L β-羟基丁酸最有益于细胞存活。因此，选用7 mmol/L β-羟基丁酸进行干预。
根据不同的检测项目选择不同的容器和细胞接种密度，见表1。

1.4.2 细胞存活率的检测 严格遵循CCK-8检测试剂盒说明书操作。在96孔板的每孔内加入10 μL CCK-8加强工作液，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养1.5 h，在酶标仪450 nm处读取吸光度值以检测细胞存活率。细胞存活率=[(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]×100%。

1.4.3 ATP、α-KGDH、Na+K+-ATP酶、线粒体膜电位和活性氧的检测 严格遵循制造商的说明使用ATP检测试剂盒、α-KGDH活性检测试剂盒、Na+K+-ATP酶活性检测试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧测定试剂盒，分别检测细胞中ATP含量、α-KGDH活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位及活性氧水平。
JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。使用红绿荧光的相对比值(JC-1 Red/JC-1 Green)对线粒体膜电位进行定量分析，JC-1 Red/JC-1 Green与线粒体膜电位呈正比。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为 DCFH(Dichlorofluorescin)。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。当细胞内有活性氧存在时，DCFH被氧化为强绿色荧光物质DCF(Dichlorofluorescein)，其荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。
1.5 主要观察指标 细胞存活率、ATP相对浓度、α-KGDH活性、Na+K+-ATP酶活性、线粒体膜电位及活性氧水平。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。所有的实验统计学方法均采用双向ANOVA分析，所有数据以均数±标准误表示，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西医科大学统计学专家审核。

讨论

轻度认知障碍的脑能量代谢缺陷约为10%，早期阿尔茨海默病约为20%[5，35]，因此改善、保存或挽救脑能量学的治疗方法对阿尔茨海默病有重要的治疗意义。神经元高度依赖线粒体氧化磷酸化所产生的ATP来支持突触传递的高能量需求[36]。酮体是脑葡萄糖的唯一替代燃料。线粒体氧化磷酸化是β-羟基丁酸产生ATP的唯一途径，不存在类似葡萄糖转化为乳酸的线粒体外途径[5，21，37]。β-羟基丁酸氧化磷酸化主要发生在神经元内，酮分解酶基因OXCT1在神经元高表达，而在脑内其余细胞表达不明显[5，38]。因此，β-羟基丁酸作为能量底物生成ATP的过程与神经元线粒体生物能量功能密切相关。
在阿尔茨海默病中，线粒体生物能量功能受损，如ATP的产生减少、三羧酸循环的酶活性降低、ATP水解受损、线粒体膜电位降低和氧化应激增加[13，39]。通过检测HT22细胞ATP含量，发现β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导HT22细胞的ATP水平，改善能量缺陷。α-KGDH是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A，有利于产生ATP[40]。实验发现β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导HT22细胞的α-KGDH活性，改善三羧酸循环的酶活性降低，促进ATP的生成。Na+K+-ATP酶通过水解ATP生成能量。大脑占2%体质量却消耗将近20%的能量，超过一半的能量被Na+K+-ATP酶用来恢复兴奋细胞的静息电位和神经突触间的电-化学信号传导，以满足神经功能的高能量需求[41-42]。实验发现β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导HT22细胞的Na+K+-ATP酶活性，促进ATP分解产能，有利于改善神经功能。正常的线粒体膜电位是线粒体进行氧化磷酸化和产生ATP的前提，是维持线粒体功能所必需的[13]。线粒体膜电位降低会损伤线粒体的呼吸链结构，导致ATP 的合成量受到抑制并产生大量的活性氧。活性氧的过度产生导致氧化应激增强，严重损害线粒体DNA、呼吸链复合酶和氧化磷酸化代谢过程。而线粒体的损伤又将进一步诱导活性氧爆发，从而形成恶性循环[19]。实验发现β-羟基丁酸提高了Aβ1-42诱导HT22细胞的线粒体膜电位，降低了活性氧水平，改善了线粒体生物能量功能。
阿尔茨海默病存在的脑能量代谢缺陷也与“能量供求失衡”密切相关。阿尔茨海默病的线粒体功能障碍产生了持续的脑能量缺口，导致能量供应不足[14，18]。阿尔茨海默病早期的脑葡萄糖代谢障碍也提示线粒体功能障碍[13，18，43]，同时阿尔茨海默病的病理特征如Aβ沉淀和神经炎症等，都导致神经元的能量需求增加[44]。研究发现，神经元胞内Aβ低聚物诱导的突触失调引起过度兴奋的功能性传递[45]、Aβ依赖性的神经元过度激活[46]，这些都增加了神经元的能量需求。作者推测Aβ1-42干预组的细胞能量需求高于非Aβ1-42干预组。轻度认知障碍患者和早期阿尔茨海默病患者大脑对酮的吸收和代谢是正常的[22，25，47]，并且脑酮代谢的速率与血液中循环酮体浓度呈正比[32-33]。因此，与对照组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的ATP相对浓度 (P < 0.001)、α-KGDH的相对活性(P < 0.001)和Na+K+-ATP酶的相对活性(P < 0.001)均增加。
与β-羟基丁酸组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的ATP相对浓度(P > 0.05)和α-KGDH的相对活性(P > 0.05)均无统计学差异，支持脑酮代谢的速率与血液循环酮体浓度呈正比这一认识。与β-羟基丁酸组相比，Aβ1-42+β-羟基丁酸组的Na+K+-ATP酶的相对活性增加(P < 0.05)，提示Aβ1-42+β-羟基丁酸组的能量需求高于β-羟基丁酸组，Na+K+-ATP酶水解ATP以产生更多能量维持Aβ1-42+β-羟基丁酸组神经元存活和神经突触传递间的信号传导。
综上所述，β-羟基丁酸增加了Aβ1-42诱导HT22细胞的ATP含量、α-KGDH活性、Na+K+-ATP 酶活性、线粒体膜电位，降低了活性氧水平，可见β-羟基丁酸从线粒体酶活性、氧化应激、电子传递链损伤和氧化磷酸化等多个方面提高了线粒体生物能量功能，最终改善了Aβ1-42诱导HT22细胞的能量障碍和细胞存活率，为基于β-羟基丁酸干预来拯救阿尔茨海默病脑能量障碍提供依据，提示β-羟基丁酸可能是阿尔茨海默病临床药物研发的一个重要靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

β-羟基丁酸改善β淀粉样蛋白1-42诱导小鼠海马神经元HT22细胞的能量障碍

Beta-hydroxybutyric acid improves energy dysfunction of mouse hippocampal neuron HT22 cells induced by amyloid-β protein 1-42

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[1]	王咪, 马书杰, 刘杨, 齐瑞. 缺血性脑卒中铁死亡特征基因NFE2L2的鉴定与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1466-1474.
[2]	谢刘刚, 崔书克, 郭楠楠, 李遨宇, 张菁瑞. 干细胞治疗阿尔茨海默病的研究热点与前沿[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1475-1485.
[3]	李甜, 任俞桦, 高艳萍, 苏强. 阿戈美拉汀缓解APP/PS1转基因小鼠焦虑及抑郁样行为的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1176-1182.
[4]	苏琴, 贾思玮, 郭敏芳, 孟涛, 李雁冰, 穆秉桃, 宋丽娟, 马存根, 尉杰忠. 枸杞多糖干预β-淀粉样蛋白1-42诱导SH-SY5Y细胞损伤：线粒体自噬的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6688-6696.
[5]	南淞华, 彭超杰, 崔应麟. 线粒体功能障碍与脑衰老：Web of Science核心数据库来源文献的计量学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5642-5651.
[6]	蒋千平, 杨丹, 万石磊, 徐丹丹, 曹璐, 周晶, . O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化在神经退行性疾病中的作用及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(26): 5704-5712.
[7]	林慧洁, 黄云, 黄志华, 江丽霞. 载药外泌体在中枢神经系统疾病中的热点问题[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 5013-5021.
[8]	王泽乾, 段彦哲, 吴艺舸, 马东, 黄建军, 闫玉清, 宋丽娟. 羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4044-4051.
[9]	刘丹丹, 秦合伟. 线粒体自噬、铁死亡、铜死亡和双硫死亡在阿尔茨海默病中的作用机制及进展[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4132-4144.
[10]	陈桂琳, 汤其强. 阿尔茨海默病NK细胞与铜死亡的相关基因分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(19): 4172-4180.
[11]	张松江, 李龙洋, 周春光. α7烟碱型乙酰胆碱受体与阿尔茨海默病的关系[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(18): 3915-3924.
[12]	李龙洋, 张松江, 赵献敏, 周春光, 高剑峰. 电针干预阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元和少突胶质细胞的增殖分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1029-1035.
[13]	温华能, 林润, 王逸潇, 王冰水, 刘璐, 刘传耀, 蔡灿鑫, 崔韶阳, 许明珠. 电针“智三针”对5xFAD小鼠Notch信号通路及突触可塑性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5148-5153.
[14]	李慧军, 李垂坤, 魏翠兰, 张业廷. Notch1介导有氧运动促进阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4951-4957.
[15]	柴世凡, 李欣儒, 叶育采, 孙俊丽, 蔡红艳, 王昭君. 索马鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在靶点：沉默信息调节因子1[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3235-3239.