基于中医证候与精液质量相关参数构建精子DNA碎片预测模型与验证

doi:10.12307/2024.148

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2661-2668.doi: 10.12307/2024.148

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

基于中医证候与精液质量相关参数构建精子DNA碎片预测模型与验证

周超1，庾广聿1，阳绍华1，高磊磊2，金珍2，蒋月园1，李欢3

1广西壮族自治区南溪山医院生殖中心，广西壮族自治区桂林市 541000；2浙江省人民医院生殖中心，浙江省杭州市 310000；3中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院检验科，广西壮族自治区桂林市 541000

收稿日期:2023-03-31 接受日期:2023-05-26 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 李欢，副主任技师，中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院检验科，广西壮族自治区桂林市 541000
作者简介:周超，男，1992年生，广西壮族自治区灵川县人，汉族，2014年右江民族医学院毕业，主管技师，主要从事辅助生殖胚胎实验室及男科实验室工作，现主要研究方向为辅助生殖临床相关预测模型。共同第一作者：庾广聿，女，1982年生，广西壮族自治区桂林市人，汉族，2012年广西医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事生殖内分泌方面的研究。共同第一作者：阳绍华，男，1980年生，广西壮族自治区桂林市人，汉族，2003年广西中医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事中医男科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82001539)，项目负责人：高磊磊；广西科技计划项目(2022AC04004)，项目参与人：蒋月园；广西壮族自治区卫生健康委员会自筹课题(Z20211100)，项目负责人：周超

Prediction model and verification of sperm DNA fragments based on traditional Chinese medicine syndrome and semen quality-related parameters

Zhou Chao1, Yu Guangyu1, Yang Shaohua1, Gao Leilei2, Jin Zhen2, Jiang Yueyuan1, Li Huan3

1Reproductive Center, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Reproductive Center of Zhejiang Provincial People’s Hospital, Hangzhou 310000, Zhejiang Province, China; 3Laboratory Department of 924 Hospital of the Joint Logistics Support Force of the People’s Liberation Army of China, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-03-31 Accepted:2023-05-26 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Li Huan, Associate chief technician, Laboratory Department of 924 Hospital of the Joint Logistics Support Force of the People’s Liberation Army of China, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhou Chao, Technician-in-charge, Reproductive Center, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Yu Guangyu, Master, Associate chief physician, Reproductive Center, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Yang Shaohua, Master, Associate chief physician, Reproductive Center, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin 541000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82001539 (to GLL); Guangxi Science and Technology Plan Project, No. 2022AC04004 (to JYY); Self Funded Project by Health Commission of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z20211100 (to ZC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

精子DNA碎片指数：通过反映男方精子核遗传物质的完整性与损伤程度，从基因层面为全面评估精液质量再增一个独立的生物学临床指标。研究证实，精子DNA碎片指数与男性不育、植入失败、妊娠丢失存在显著的相关性。
中医证候：通过反映疾病发生和演变过程中某阶段的本质特征，能多维度获取关于该疾病的病因、病机、病位、病势等丰富信息。但因中医证候缺乏定量指标与科学的统计学方法，因而其具有多变性、复杂性、模糊性、隐匿性。

摘要
背景：中医证候与精液质量相关参数相结合，共同预测精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)异常增高的发生并绘制列线图，能显著提高临床的实操性与应用效能，为临床全面评估精液质量，采取积极干预措施以改善临床结局及制定个体化医疗方案提供依据。
目的：探讨基于中医证候与精液质量相关参数构建精子DNA碎片的预测模型与验证。
方法：回顾性分析2019年7月至2021年7月在广西壮族自治区南溪山医院中医男科接受中医证候诊断及精子DNA碎片率检查的不育患者共420例，据《人类精液检查与处理实验室手册》(第6版)，将其中137例精子DFI > 30%患者纳入精子DFI异常增高组，将283例精子DFI≤30%作为对照组；首先采用单因素分析筛选精子DFI异常增高的影响因素，然后采用套索算法(LASSO)校正因子共线性问题并筛选出最佳匹配因子后，将其纳入多因素向前逐步Logistic回归找出其独立影响因素并绘制列线图，最后采用受试者工作曲线、校准曲线、临床决策曲线、临床影响曲线对该预测模型进行区分度与准确度及临床应用效能验证。
结果与结论：①单因素分析结果显示，年龄、体质量指数、前向运动率、精子总活率、精子浓度、精子形态学、肾阳虚衰证、湿热下注证、肾精不足证为引发精子DFI异常增高的影响因子(P < 0.05)；②通过LASSO回归进一步筛选出的最佳匹配因素为年龄、体质量指数、精子总活率、精子浓度、精子形态学、肾阳虚衰证、湿热下注证、肾精不足证(P < 0.05)；③多因素向前逐步Logistic回归结果显示年龄、体质量指数、精子浓度、精子总活率、湿热下注证、肾阳虚衰证共6项为引发精子DFI异常增高的独立影响因素；④受试者工作曲线显示，模型组曲线下面积为0.760(0.713，0.806)，验证组曲线下面积为0.745(0.714，0.776)，说明该预测模型具有较好的区分度；⑤校准曲线平均绝对误差0.040，Hosmer-Lemeshow检验P > 0.05，表明该模型预测发生精子DFI异常增高的概率与实际发生精子DFI异常增高的概率无显著统计学差异，证实该模型具有较好的准确度；⑥临床决策曲线与临床影响曲线显示，模型组与验证组分别在阈概率值为0.08-0.84与0.09-0.78时具有临床最大净获益，且在该阈概率范围内具有较好的临床应用效能；⑦结果表明，年龄、体质量指数、精子浓度、精子总活率、湿热下注证、肾阳虚衰证为引发精子DFI异常增高的独立影响因素，通过其构建的临床预测模型列线图具有较好的临床预测价值与临床应用效能，可为临床全面评估精液质量、预后与干预及个体化医疗服务提供依据。

https://orcid.org/0000-0001-9843-6731 (周超)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 精子DNA碎片, 精子DNA完整性, 中医证候, 精子DNA碎片指数, 预测模型

Abstract: BACKGROUND: The combination of traditional Chinese medicine syndrome and semen quality-related parameters can jointly predict the occurrence of abnormal increase in sperm DNA fragmentation index (DFI) and draw a column chart, which can significantly improve clinical practicality and application efficiency, provide a basis for comprehensive evaluation of semen quality in clinical practice, take active intervention measures to improve clinical outcomes, and formulate personalized medical plans.
OBJECTIVE: To explore the prediction model and verification of sperm DNA fragments based on traditional Chinese medicine syndrome and semen quality-related parameters.
METHODS: Retrospective analysis was made on 420 infertile patients who received traditional Chinese medicine syndrome diagnosis and sperm DNA fragment rate examination in the Department of Traditional Chinese Medicine Andrology, Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region from July 2019 to July 2021. According to the Manual of Human Semen Examination and Treatment Laboratories (6th Edition), 137 patients with sperm DFI>30% were included in the group of abnormally high sperm DFI, and 283 patients with sperm DFI ≤ 30% were taken as the control group. First, univariate analysis was used to screen the influencing factors of the abnormal increase of sperm DFI. Then, the best matching factor was selected by using the collinearity problem of LASSO correction factors. Then, it was included in the multifactor forward stepwise logistic regression to find out its independent influencing factors and draw a nomogram. Finally, the receiver operating characteristic curve, calibration curve, decision curve analysis and clinical impact curve were used to verify the differentiation and accuracy of the prediction model and its clinical application effectiveness.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of the univariate analysis showed that age, body mass index, forward motion rate, total sperm motility, sperm concentration, sperm morphology, kidney yang deficiency syndrome, damp heat downpour syndrome, and kidney sperm deficiency syndrome were the influencing factors for the abnormal increase of sperm DFI (P < 0.05). (2) The best matching factors further screened by LASSO regression were age, body mass index, total sperm motility, sperm concentration, sperm morphology, kidney yang deficiency syndrome, damp heat downpour syndrome, and kidney essence deficiency syndrome (P < 0.05). (3) Multifactor forward stepwise Logistic regression showed that age, body mass index, sperm concentration, total sperm motility, damp heat downpour syndrome, and kidney yang deficiency syndrome were six independent factors that caused the abnormal increase in sperm DFI. (4) Receiver operating characteristic curve showed that the area under the curve of the model group was 0.760(0.713,0.806), and the area under the curve of the validation group was 0.745(0.714,0.776). It showed that the prediction model had good discrimination. (5) The average absolute error of the calibration curve was 0.040, and the Hosmer Lemeshow test (P > 0.05), suggesting that there was no significant statistical difference between the probability of the abnormal increase in DFI of spermatozoa predicted by the model and the probability of the abnormal increase in DFI of spermatozoa actually occurred, which confirmed that the model had good accuracy. (6) Decision curve analysis and clinical impact curve showed that the model group and validation group had the maximum clinical net benefit when the threshold probability values were (0.08-0.84) and (0.09-0.78) respectively, and had good clinical application efficiency within the threshold probability range. (7) These findings conclude that age, body mass index, sperm concentration, total sperm viability, damp heat downpour syndrome and kidney yang deficiency syndrome are independent factors that cause the abnormal increase in sperm DFI. The nomogram of the clinical prediction model constructed by them has good clinical prediction value and clinical application efficiency, and can provide the basis for comprehensive clinical evaluation of semen quality and individualized medical service.

Key words: sperm DNA fragment, sperm DNA integrity, traditional Chinese medicine syndromes, sperm DNA fragmentation index, prediction model

中图分类号:

周超, 庾广聿, 阳绍华, 高磊磊, 金珍, 蒋月园, 李欢. 基于中医证候与精液质量相关参数构建精子DNA碎片预测模型与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2661-2668.

Zhou Chao, Yu Guangyu, Yang Shaohua, Gao Leilei, Jin Zhen, Jiang Yueyuan, Li Huan. Prediction model and verification of sperm DNA fragments based on traditional Chinese medicine syndrome and semen quality-related parameters[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2661-2668.

图/表（结果） 4

2.1 精子DFI异常增高的单因素分析 通过对精子DFI异常增高的单因素分析，结果显示年龄、体质量指数、精子前向运动率、精子总活率、精子浓度、精子形态学、肾阳虚衰证、湿热下注证、肾精不足证共9项为引发精子DFI异常增高的影响因子(P < 0.05)；将以上影响因子纳入Lasso回归，并采用十折交叉验证法以Lambda 1se为标准，校正共线性因素后获得该模型最佳匹配因素为年龄、体质量指数、精子总活率、精子浓度、精子形态学、肾阳虚衰证、湿热下注证、肾精不足证共8项为该模型最佳匹配因素，见表1，图1。

2.2 精子DFI异常增高的多因素分析 通过多因素向前逐步Logistic回归，纳入Lasso回归筛选出的最佳匹配因素，结果显示年龄、体质量指数、精子浓度、精子总活率、湿热下注证、肾阳虚衰证共6项为引发精子DFI异常增高的独立影响因素；其中年龄、体质量指数、湿热下注证、肾阳虚衰证为引发精子DFI异常增高的独立危险因素；精子浓度、精子总活率为其独立保护因素，见图2。
2.3 构建精子DFI异常增高的预测模型列线图 根据精子DFI异常增高的独立影响因素，绘制精子DFI异常增高的列线图，在临床实践与个体化医疗服务中，医生可根据患者年龄、体质量指数、精子浓度、精子总活率、湿热下注证、肾阳虚衰证的具体情况，依次对应列线图中具体单项得分，通过各单项分值的总和，直接对应该患者发生精子DFI异常增高的具体概率值；如该患者年龄为35岁，对应列线图得分为1.5分；体质量指数为21.00 kg/m2，对应列线图得分为4.7分；精子浓度为75.00×109 L-1，对应列线图得分为3.6分；精子总活率为46.00%，对应列线图得分为2.5分；无湿热下注证，对应列线图得分为0分，有肾阳虚衰证，对应列线图得分为1.2分；将各单项影响因素分值相加，总得分为13.5分；通过查询该列线图，得到DFI异常增高的发生概率为70.50%，见图3。

2.4 精子DFI异常增高预测模型的区分度与校准度评估 通过受试者工作曲线与校准曲线分别对该模型的区分度与准确度进行评估，结果显示，模型组的曲线下面积为0.760(0.713，0.806)，验证组的曲线下面积为0.745(0.714，0.776)，说明该预测模型具有较好的区分度；标准曲线结果显示，平均绝对误差为0.040；Hosmer-Lemeshow检验(R2=12.439，P=0.133 > 0.05)表明该模型预测发生精子DFI异常增高的概率与实际发生精子DFI异常增高的概率无显著统计学差异，证实该模型具有较好的准确度，见图4。

2.5 精子DFI异常增高预测模型的临床应用效能评估 通过临床决策曲线与临床影响曲线对精子DFI异常增高预测模型的临床应用效能进行评估，结果显示，当模型组与验证组阈概率分别为0.08-0.84与0.09-0.78时，具有临床最大净获利，并且在该阈概率范围内时，预测发生精子DFI异常增高的人数，均多于实际精子DFI异常增高的人数，同时损失∶获益值始终小于1，表明使用该模型具有较好的临床应用效能，见图5。

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引言

2021年国家统计局数据显示，中国育龄人口不孕不育的发生率达12%-18%；2022年中华医学会生殖医学分会通过对全国221家生殖中心上报数据显示，男性因素导致的不育占所有不孕因素的36.62%[1]。然而，临床数据显示，约15%的不育患者仅通过常规精液质量评估仍无法发现任何异常[2]，但对精子DNA完整性评估后显示，约17%的患者存在精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)超过30%的情况[3]。因此，DFI通过反映男方精子核遗传物质的完整性与损伤程度，从基因层面为全面评估精液质量再增一个独立的生物学临床指标。研究证实，精子DFI与男性不育、植入失败、妊娠丢失存在显著的相关性[4-5]；由DFI增高而致使遗传物质受损及甲基化导致的表观遗传学改变[6]，对子代的安全性构成严重的威胁。因此，DFI对精液质量的全面评估及早期干预与改善临床结局具有重要的意义。然而，由于DFI检测仪器设备与环境要求高、检测费用贵，并基于医疗资源与患者经济压力的综合考虑，使得DFI的临床应用相当有限。现对精子DFI研究主要集中于精子DNA的损伤机制及精液常规参数与精子DFI的相关性[7-8]，缺乏通过校正其他混杂因素后，构建实操性较强、预测效能较高的临床预测模型。研究证实，精子DFI与精液常规相关参数存在相关性，但由于其相关程度不高，单独与联合预测模型曲线下面积水平较低，且受混杂因素影响，使得通过精液常规相关参数预测精子DFI的临床可靠性相当有限。中医证候是疾病发生和演变过程中某阶段本质的反映，同时能多角度揭示病因、病机、病位、病势等，与精子DFI通过基因层面反映精子质量具有较好的相关性，且基于对中医证候的诊断，能较好地反映DFI增高的危险因素。但中医证候具有多变性、复杂性、模糊性、隐匿性等特点，缺乏定量指标与科学的统计学方法，因此，仅采用中医证候对DFI进行预测亦具有相当的局限性。基于以上，该研究通过将中医证候与精液质量相关参数相结合，共同预测精子DFI异常增高的发生，通过多因素Logistic回归校正其他混杂因素后，获得DFI异常增高的独立影响因子并绘制列线图，进而对DFI发生异常增高的具体概率进行预测，能显著提高临床的实操性与应用效能，为临床全面评估精液质量，采取积极的干预措施以改善临床结局及制定个体化医疗方案提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 回顾性分析，构建精子DFI异常增高的临床预测模型。
1.2 时间及地点 2019年7月至2021年7月在广西壮族自治区南溪山医院生殖中心病案室完成。
1.3 对象 回顾性分析2019年7月至2021年7月在广西壮族自治区南溪山医院中医男科接受中医证候诊断及精子DNA碎片率检查的不育患者共420例。依据《人类精液检查与处理实验室手册》(第6版) [9]，将137例精子DFI > 30%患者纳入精子DFI异常增高组，将283例精子DFI≤30%作为对照组[10-11]。
纳入标准：①符合男性不育的诊断标准及诊断流程[12]；②中医证候诊断标准参照《中华人民共和国中医药行业标准中医病证诊断疗效标准》制定[13]；③对此研究知情同意并接受中医证候诊断及精子DFI检查。
排除标准：①患者实验室数据不完整或丢失，未进行精子DFI检查及中医证候诊断者；②严重早泄、勃起功能障碍、取精困难及逆行射精者；③不签订知情同意书或精子经浓缩处理后浓度仍然低于0.5×109 L-1者。
该研究经广西壮族自治区南溪山医院医学伦理委员会审核批准后执行(伦理批号：NXSYY-2021031)。
1.4 方法
1.4.1 精子DFI的测定
检测原理：精子经酸化处理后，精子核受损导致染色质呈单链，其与吖啶橙结合并于激光488 nm处激发，呈现红色或黄色荧光；未受损精子核染色质具有完整的双链结构，与吖啶橙结合发绿色荧光；采用流式细胞仪对荧光进行测定，以红色或黄色荧光的占比表示精子核的受损程度及精子的完整性。
实验试剂：精子核完整性染色试剂盒(深圳市博瑞德生物技术有限公司)；试剂A：氯化钠、双氨基-三甲烷、双三甲烷盐酸盐；试剂B：氯化钠、聚山梨醇酯20；试剂 C：吖啶橙冻干粉。
实验步骤：①在试剂 C中加入冻干粉溶解液6.5 mL，充分溶解；②采用西班牙CSA计算机辅助精液分析仪测定精子浓度；③计算精液标本所需的加样量，使精子在试剂A中的终浓度为(2.0-3.0)×109 L-1；计算方法：假设原始精液标本中的精子浓度为M×109 L-1，则所需精液量(μL)=150÷M；④在适用的流式细胞仪小管中加入上述计算后的精液量，然后加入试剂A 50 μL，轻轻混合；⑤加入试剂B 100 μL，轻轻混合，计时30 s；⑥立即加入试剂C 300 μL，轻经混合；⑦将样本上流式细胞仪于488 nm激发光处检测，至少分析5 000个精子。
1.4.2 中医证候诊断 参照《中华人民共和国中医药行业标准中医病证诊断疗效标准》制定[13]，包括湿热下注证、瘀血阻滞证、肾阳虚衰证、肝气郁结证、肾阴不足证、脾胃两虚证、肾精不足证。由共同第一作者阳绍华副主任医师进行中医证候诊断。
1.5 主要观察指标 采用广西壮族自治区南溪山医院信息管理系统，收集男方完整的临床及实验室资料，主要包括：年龄、体质量指数、禁欲时间、精液pH值、精液液化时间、精液体积、精子浓度、精子前向运动率、精子总活率、精子正常形态率、精浆抗精子抗体、精子DFI等。

1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0、GraphPad 8.0及Stata 15.0软件包对数据与图形处理。首先，采用Kolmogorov-Smirnov test与Levene检验对数据进行正态性与方差齐性分析。正态分布计量数据以x±s表示；非正态分布计量数据以M(P25，P75)表示；计数资料采用n/%表示；采用单因素分析筛选出DFI异常增高的影响因子，并进一步采用Lasso回归及十折交叉验证法以Lambda 1se为标准，校正单因素分析中共线性因子并筛选出该模型的最佳匹配因素；将该些因子纳入多因素向前逐步Logistic回归，找出精子DFI异常增高的独立影响因素并绘制列线图；对模型组样本采用Bootstrap法重复抽样1 000次作为验证组，采用受试者工作曲线的曲线下面积评价模型组与验证组的区分度；Hosmer-Lemeshow检验评估该模型预测精子DFI异常增高的概率与实际精子DFI异常增高的概率是否存在统计学差异；采用标准曲线平均绝对误差显示该模型预测的准确性；通过临床决策曲线与临床影响曲线评价临床应用效能。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过广西壮族自治区南溪医院科研科生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

研究证实，精子DFI的异常增高与男性不育、胚胎受精率、卵裂率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、活产率、流产率、子代安全性具有显著的相关性[14-15]。DFI通过显示精子核DNA单、双链的断裂程度而反映精子DNA的完整性与损伤程度。现西医研究显示，氧化应激作用、精子细胞凋亡机制、精子染色质组装异常为精子DNA损伤的主要作用机制。中医证候对DFI的认识与相关性研究较少，但其对男性不育发病机制、发病病因、经方论治等研究得较为透彻，男性不育的中医证候主要包括湿热下注证、瘀血阻滞证、肾阳虚衰证、肝气郁结证、肾阴不足证、脾胃两虚证、肾精不足证。通过对中医证候的诊断，能较好地反映疾病发生和演变过程中某阶段的本质，同时能多维度获取关于该疾病的病因、病机、病位、病势等丰富信息，然而中医证候仍然缺乏定量指标与科学的统计学方法作为支撑。而单纯使用精液质量相关参数与精子DFI建立预测模型，又会出现相关性不高、混杂因素未校正及预测曲线下面积较低的情况。因此，该研究通过将中医证候与精液质量相关参数相结合，共同预测精子DFI异常增高的发生。该研究显示，湿热下注证、肾阳虚衰证、精子浓度、精子总活率、年龄、体质量指数共6项为引发精子DFI异常增高的独立影响因素。
该研究显示，年龄、体质量指数为引发精子DFI异常增高的独立危险因素。年龄与体质量指数引发DFI异常增高的原因，是基于其对精子DNA损伤机制，即氧化应激作用、精子细胞凋亡机制、精子染色质组装异常。临床研究证实，年龄的增长会导致过量的活性氧物质堆积，致使体内活性氧与抗氧化系统的失衡，从而导致活性氧物质对精子膜与核的破坏，进而致使精子DNA单双链的断裂，造成精子DNA损伤[16]。辜秀丽等[17]通过将年龄队列分层为21-30岁、31-40岁、41-52岁后，研究其精子DFI≥25% 的风险占比，结果显示，精子DFI随着年龄的增高呈逐渐升高趋势，依次为8.8%，14.5%，72.9%；NAHER等[18]研究显示，活性氧水平与DFI水平呈显著的正相关性；乜照燕等[19]研究显示，男性年龄与精子氧化应激水平及精子DFI水平存在显著的正相关关系；以上研究表明，男性年龄增加会致使活性氧物水平的增高，可能是造成DFI升高的原因之一。与该研究显示年龄为引发精子DFI异常增高的独立危险因素相符合，此观点亦可通过ABAD等[20]研究得到侧面证实，对患者进行抗氧化治疗后结果显示，随着活性氧水平的下降，DFI水平显著降低。GONZÁLEZ-MARÍN等[21]研究显示，男性年龄增加而致使精子DNA修复机制缺陷并可能引发精子染色质组装异常，是年龄导致DFI升高的另一个原因。SINGH等[22]研究显示，年龄的增长会致使睾丸支持细胞与间质细胞功能与数量的下降，进而导致精子凋亡效能降低，从而引发精子DFI增高。因此，年龄通过影响精子氧化应激作用、精子细胞凋亡机制、染色质组装进而对精子DNA完整性产生影响。该研究显示，体质量指数为引发精子DFI异常增高的另一个独立危险因素。彭洋洋[23]通过将体质量指数队列分层为偏瘦组(体质量指数≤18.5 kg/m2)、正常体质量组(18.5 kg/m2 <体质量指数< 24.0 kg/m2)、超重组(24.0≤体质量指数< 28.0 kg/m2)、肥胖组(体质量指数≥28.0 kg/m2)后，研究其DFI水平，结果显示，肥胖组中DFI≥30%人群所占比例为65.5%，明显高于偏瘦组、正常体质量组、超重组(分别为20.0%，27.1%，33.3%)。ERDEMIR等[24]研究显示，相对于正常体质量人群，肥胖人群精液中的活性氧水平显著增加。因此，体质量指数增长主要通过增加精子体内活性氧水平，致使精子核与线粒体DNA遭受破坏，从而影响精子染色质组装。与该研究显示体质量指数为引发精子DFI异常增高的独立影响因素相符。
该研究显示，精子浓度、精子总活率为引发精子DFI异常增高的独立保护因素。帅俊等[25]通过对9 694例精液标本回顾性研究，采用线性回归校正其他混杂因素后结果显示，精子DFI与精子总活率和浓度呈显著的负相关关系；EVENSON 等[26]通过对DFI队列分层研究显示，DFI水平较高组精子浓度、精子总活率水平显著下降；以上研究均表明精子浓度、精子总活率与精子DFI存在显著的相关性。王丽琼[27]通过将精子浓度进行队列分层为< 10×109 L-1组、< 20×109 L-1组及> 20×109 L-1组后，对精子DFI水平及DNA断裂方式进行研究，结果显示，精子浓度正常组与精子浓度较高组的精子DNA 损伤主要以单链断裂为主，而精子浓度较低组的双链断裂程度显著高于精子浓度正常组与精子浓度较高组，这表明精子浓度较低与精子DNA双链断裂具有显著的相关性。SPEIT等[28]
研究显示，单链损伤能通过碱基互补配对而得以修复，但双链损伤为一种不可逆损伤而难以修复。因此，精子浓度能直接反映男性精子的生发能力，当精子DNA双链断裂比例增加，DFI上升时可能会直接导致精子发生中某个关键基因的错乱，进而造成精液浓度降低。该研究显示，精子总活率为DFI异常增高的独立保护因素。精子总活率为精子前向运动率与非前向运动率的总和，相对于单纯的精子前向运动率更能全面反映出精子动力学性能。通过外在的精子总活率能直观反映精子纤毛及鞭毛的保守性与能供情况。BOUHALLIER等[29]研究显示，精子纤毛及鞭毛结构保守性与精子的活力存在显著相关性，其中心粒位于精子的颈部，是组成纤毛与鞭毛轴丝的重要组成部分。因此，精子活力降低可能与中心粒的结构与功能异常具有一定的相关性。大量研究证实，中心粒与纺锤体及细胞分裂等存在显著的相关性，当中性粒结构与功能异常时，极易造成精子DNA复制的不稳定性，从而导致DNA完整性受损，DFI上升，这可能是精子活力与精子DFI具有显著相关性的原因之一。
该研究显示，湿热下注证为引发精子DFI异常增高的独立危险因素。中医认为湿热下注对男性不育的影响主要基于藏象学中脾与肾的互相作用机制。脾通过其运化功能，对水谷等营养物质的转化与运输，推动机体水液的运行具有显著的意义。若脾气受损，则可导致其运化功能障碍，致使组织营养及水液运行受阻，继而引发湿聚成痰，痰湿内生，湿邪易侵袭下焦，湿邪久居下焦，日久化热，湿热煎灼阴精，精室不通，精液不化，久而久之便干扰了肾对精子的调摄、推动及输送功能。研究显示，现男性不育患者中以“肾虚夹湿热瘀毒虫”病因为主[30]；赵文等[31]通过对王祖龙治疗326例不育患者进行聚类分析结果显示，湿热下注为精子DFI损伤中出现频数最高的证候；以上研究说明，湿热下注与男性不育及精子DFI增高存在显著的相关性，与该研究显示湿热下注证为引发精子DFI异常增高的独立危险因素基本相符。湿热下注证与DFI异常增高存在显著的相关性，其主要原因可能有以下3点：①湿热下注能一定程度反映现代生活环境中引发高DFI的危险因素，大量研究证实，吸烟、大量饮酒、熬夜、肥胖等因素与精子DFI异常增高具有显著的相关性[32-33]。而湿热下注能不同程度反映患者不良的生活方式如大量饮酒、摄入大量高热量物质、熬夜等，并由于以上因素致使脾胃受损，进而最终影响肾藏精，主生长、发育与生殖的功能。陈小超[34]通过对817例不育患者中医证候危险因素进行分析，结果显示湿热下注证占所有证候的39.66%，且年龄、肥胖、既往生殖感染史为其独立危险因素。②由于湿热下注而导致脾气受损，进而造成运化功能障碍，致使组织营养及体液运行受阻。从而引发精子的发生物质不足，如微量元素或DNA合成物质的缺失，进而致使精子DFI升高。③由于脾气受损，体液运行与推动受阻，湿邪易侵袭下焦，湿邪久居下焦，日久化热，湿热煎灼阴精，精室不通，可能会造成过量的活性氧物质堆积，从而造成精子DNA损伤。因此，湿热下注证不仅能反映DFI异常升高患者所处的生活、环境危险因素，还能从精子DNA损伤机制中找到其与DFI升高的相关性。
该研究显示，肾阳虚衰证为引发精子DFI异常增高的独立危险因素。《黄帝内经》提出“肾藏精，主生殖”，确定了中医中以肾为生殖主导地位的看法。肾乃先天之本，体现在肾藏之阳为元阳，是肾发挥各种生理功能的动力，为人体阳气之根本。肾阳虚衰证是指肾元阳过度耗损，造成机体阳虚而缺乏推动与运化肾完成生理功能的能力。肾阳虚衰证是以畏寒肢冷、腰膝酸软、后背寒凉等为主症；以头晕耳鸣、夜尿频多、阳痿或性欲低下、易困嗜卧、舌淡苔白、脉沉迟或沉细等为次症的中医证候。刘海娟[35]通过对中医证候在精子DFI异常中分布频数的研究显示，肾阳虚衰证中DFI异常增高占所有中医证候的18.64%；与该研究显示肾阳虚衰证为引发精子DFI异常增高的独立危险因素基本相符。现分析肾阳虚衰证与精子DFI异常升高具有显著相关性的原因主要有以下几个方面：①由于肾元阳过度耗损，造成机体阳虚而缺乏推动与运化肾完成生理功能的能力，会直接影响精子的生发、运输与成熟。贾域等[36]研究显示，肾阳虚衰证会上调机体核糖体蛋白表达水平及下调精子保护因子水平，从而影响精子的发生、凋亡及雄激素水平。因而，肾阳虚衰证通过引发精子DNA凋亡异常及精子染色质组装异常而引发精子DFI升高。②肾阳虚衰证由于无力完成推动和运化作用，进而影响男性雄激素水平及脂质代谢过程，从而降低了超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化物质的水平，另一方面增加了脂质过氧化物质的水平，扰乱了活性氧在精子DNA中的平衡，引发了以活性氧为主导的精子DNA损伤机制。因此，肾阳虚衰证对精子DFI异常增高具有相当的预测价值。
然而，该研究存在一定的局限性：首先，该研究为单中心样本量相对有限的回顾性研究，缺乏多中心的外部验证及大样本量的前瞻性研究；其次，该研究为中医证候结合精液质量相关参数的预测模型，可能对其他非中医科存在预测效能降低及预测模型不适应的情况；最后，研究对象局限于男性不育人群，对其他健康人群可能存在预测效能降低或不适用的情况，并且缺乏与其他预测模型之间的横向对比。
综上所述，该研究通过将中医证候与精液质量相关参数相结合，共同预测精子DFI异常增高的发生，具有显著的预测价值与临床应用效能。通过多因素Logistic回归校正其他混杂因素后显示，湿热下注证、肾阳虚衰证、精子浓度、精子总活率、年龄、体质量指数共6项为引发精子DFI异常增高的独立影响因素，通过对其绘制的列线图能直接得到发生精子DFI异常增高的具体概率值，从而为临床全面评估不育人群精液质量，采取积极干预措施以改善临床结局及制定个体化医疗方案提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

基于中医证候与精液质量相关参数构建精子DNA碎片预测模型与验证

Prediction model and verification of sperm DNA fragments based on traditional Chinese medicine syndrome and semen quality-related parameters

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