新型超声快速处理活检标本保存不同年限对DNA质量的影响

doi:10.12307/2025.018

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2655-2660.doi: 10.12307/2025.018

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

新型超声快速处理活检标本保存不同年限对DNA质量的影响

石晨曦1，朱卫东1，李三恩1，李秀明1，师逢2，丁亚云1

1苏州大学附属第一医院病理科，江苏省苏州市 215000；2苏州市立医院本部皮肤科，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2023-11-13 接受日期:2024-02-05 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 丁亚云，博士，主管技师，苏州大学附属第一医院病理科，江苏省苏州市 215000
作者简介:石晨曦，女，1989年生，汉族，2014年南京医科大学毕业，硕士，主管技师，主要从事肿瘤分子病理技术研究。
基金资助:
苏州市科技局项目(2021YFA1100600)，项目负责人：师逢；苏州大学附属第一医院自然科学基金博习培育计划(2018YFA0107500)，项目负责人：丁亚云；南京医科大学科技发展基金(NMUB20220189)，项目负责人：师逢

Effects of different storage durations on DNA quality of biopsy specimens with novel ultrasound processing

Shi Chenxi1, Zhu Weidong1, Li Sanen1, Li Xiuming1, Shi Feng2, Ding Yayun1

1Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Department of Dermatology, Suzhou Municipal Hospital, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2023-11-13 Accepted:2024-02-05 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Ding Yayun, PhD, Technician-in-charge, Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Shi Chenxi, Master, Technician-in-charge, Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Suzhou Science and Technology Bureau Project, No. 2021YFA1100600 (to SF); Natural Science Foundation Doctoral Training Program of First Affiliated Hospital of Suzhou University, No. 2018YFA0107500 (to DYY); Science and Technology Development Fund of Nanjing Medical University, No. NMUB20220189 (to SF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

新型超声处理技术：该技术原理是在特定频率、功率和振动模态下作用于病理标本，超声发生空化效应产生的微泡发生爆炸，在细胞膜表面形成开孔，增加了细胞膜通透性，显著加速细胞内外物质交换过程，既加快组织标本处理速度，也保证组织处理安全性、均匀性。
DNA质量：DNA质控是保证分子检测成功的基础，DNA 的质量评价一般从3个方面进行，包括 DNA 的浓度、纯度以及 DNA 的片段完整性。

摘要
背景：新型超声组织处理技术越来越多地被用来进行分子生物学分析，研究新型超声处理不同存储年限组织DNA的质量，对进一步分子检测的标本质控具有重要意义。
目的：探讨新型超声处理活检标本存储不同年限对DNA质量的影响，以期为分子检测探索最佳的标本存储时间。
方法：收集40例乳腺穿刺小活检组织，采用超声技术制作石蜡标本，按照存储年限分为4组：< 1年组、1-3年组、> 3-5年组及> 5年组，每组10例，对石蜡标本进行切片，每张切片厚3 μm，切片10-15张，提取DNA后通过Nanophotometer N60超微量分光光度计和Qubit 4.0荧光计检测DNA的质量浓度，记录A260/A280 比值判定DNA的纯度，利用全自动毛细管电泳核酸分析仪(Qsep 100)检测DNA片段完整性，以评估DNA片段的质量。
结果与结论：4组样本A260/A280 均值在 1.8-2.0之间，达到纯度要求，无明显差异。4组样本的DNA质量浓度(Qubit浓度)均值分别为30.39，14.33，2.52，1.95 ng/μL；DNA的平均N/Q比值分别为6.48，14.18，24.56，29.86；DNA质量数均值分别为5.64，1.76，1.24，0.80；大片段占比均值分别为56.08%，17.72%，12.68%，7.90%。PCR检测内控基因Ct均值分别为15.32，17.09，18.39，21.24。与< 1年组相比，其余3组DNA浓度显著降低，N/Q比值显著增加，DNA质量数和大片段占比均值显著降低，Ct值升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结果表明，对于新型超声处理活检标本，应优先选择存储< 1年的样本进行日常分子检测，储存3年内的样本可满足二代测序等检测要求，5年内样本仅可尝试进行PCR等检测，存储超过5年的样本不建议进行后续分子检测。

https://orcid.org/0000-0003-0913-6281 (石晨曦)；https://orcid.org/0000-0002-0704-6066 (丁亚云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 超声处理, 存储年限, DNA质量, 片段完整性, 降解程度, 二代测序

Abstract: BACKGROUND: The technique of ultrasound processing is widely used for molecular biological analysis. It is of great significance to study the DNA quality of tissue with different storage years under new ultrasonic treatment for further specimen quality control of molecular detection.
OBJECTIVE: To explore the effects of different storage durations on DNA quality in specimens with ultrasound processing to investigate the optimal storage time for molecular tests.
METHODS: Forty specimens of breast biopsy were collected and paraffin specimens were prepared by ultrasonography. These specimens were divided into four groups based on their storage periods: < 1 year, 1-3 years, > 3-5 years, and > 5 years, which contained 10 cases in each group. Paraffin specimens were sliced; each slice was 3 μm thick; 10-15 slices were taken, and DNA was extracted. The mass concentration of DNA was examined by Nanophotometer N60 ultra-micro spectrophotometer and Qubit 4.0 fluorometer. The purity of the DNA was analyzed by the ratio of A260/A280. DNA fragment integrity was measured by capillary electrophoresis (Qsep 100) to evaluate the quality of the DNA fragments.
RESULTS AND CONCLUSION: The mean values of A260/A280 in the four groups were between 1.8 and 2.0, meeting the requirements of tests, without significant differences. The mean values of DNA mass concentration (Qubit concentration) were 30.39, 14.33, 2.52, and 1.95 ng/μL, respectively. The mean values of the N/Q were 6.48, 14.18, 24.56, and 29.86. The mean values of DNA were: 5.64, 1.76, 1.24, and 0.80. The percentage of large DNA fragments averaged 56.08%, 17.72%, 12.68%, and 7.90%. Moreover, the Ct values of the internal control detected by PCR were 15.32, 17.09, 18.39, and 21.24. The three other groups exhibited significantly lower DNA concentration, higher N/Q ratios, decreased DNA quality and percentage of large fragments, and increased values of Ct, compared with the group of within 1 year of storage (P < 0.05). The experimental results suggested that for novel ultrasound processed biopsy specimens, we should prioritize samples stored within 1 year for molecular testing. Samples stored within 3 years can also meet the requirements of second-generation sequencing and other tests. Samples stored within 5 years can only be attempted to carry out PCR. Samples stored for more than 5 years were not recommended to carry out molecular tests.

Key words: ultrasonic treatment, storage duration, DNA quality, fragment integrity, degree of degradation, second-generation sequencing

中图分类号:

石晨曦, 朱卫东, 李三恩, 李秀明, 师逢, 丁亚云. 新型超声快速处理活检标本保存不同年限对DNA质量的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2655-2660.

Shi Chenxi, Zhu Weidong, Li Sanen, Li Xiuming, Shi Feng, Ding Yayun. Effects of different storage durations on DNA quality of biopsy specimens with novel ultrasound processing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2655-2660.

图/表（结果） 5

2.1 快蜡标本存储时长增加，病理形态没有明显变化 不同年限4组样本苏木精-伊红染色层次均清晰分明，组织结构清楚，细胞形态完整，见图1。经病理医师评估确认，各组组织切片上肿瘤细胞含量均> 200个，肿瘤细胞占比≥20%，满足后续分子检测需求。

2.2 快蜡标本存储时长增加，DNA纯度不变，浓度明显降低 4组样本A260/A280均值在1.8-2.0之间，达到分子检测的DNA纯度要求，各组实验结果无明显差异。因此，存储年限对DNA纯度无显著影响(P > 0.05)，见表1。

对于DNA质量浓度的质控，目前常见的方法是Nanodrop定量法和Qubit荧光定量法。前者是利用紫外吸收特性获取样本浓度值，如果DNA样本中混有RNA、降解核酸及游离核苷酸等杂质时，定量数据会出现较大偏差。Qubit荧光定量法采用特异荧光染料，可以特异检测目标分子浓度，即使模板有游离核苷酸或降解核苷酸等杂质，检测结果也不受影响。因此，Qubit荧光定量法更加准确，有利于二代测序精准建库[17]。对于核酸质量要求较高的检测平台，如Sanger测序及高通量测序，建议使用敏感度特异性更高的Qubit荧光定量法检测，而Nanodrop可用来评价DNA的纯度。
Nanodrop检测4组DNA质量浓度均值分别为187.80，159.62，58.02，56.45 ng/μL。实验结果表明，存储时间< 1年组与1-3年组样本DNA质量浓度接近，无统计学差异；而存储时间> 3年的两组样本DNA质量浓度明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。
通过Qubit再次检测了以上样本DNA质量浓度，实验结果显示：4组DNA的质量浓度均值分别为30.39，14.33，2.52，1.95 ng/μL。实验结果表明，与存储时间< 1年组相比，其余3组的DNA质量浓度明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。4组DNA总量均值分别为1 519.4，716.7，126.23，97.33 ng。DNA总量显著下降，各组之间差异有显著性意义(P < 0.05)。
4组样本DNA的平均N/Q比值分别为6.29，14.18，24.56，29.86，各组之间差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表1。以上结果表明，随着存储年限增长，DNA质量浓度下降，片段降解程度增加。
2.3 快蜡标本存储时长增加，DNA片段完整性降低
2.3.1 快蜡标本存储时长增加，DNA质量数及大片段占比均值明显下降 每组随机选取5例标本，提取DNA，通过全自动毛细管电泳进行核酸分析。结果显示，4组样本DNA质量数均值分别为5.64，1.76，1.24，0.80。大片段占比均值分别为56.08%，17.72%，12.68%，7.90%。与< 1年组相比，其余3组DNA质量数及大片段占比均值明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.3.2 存储时长超过3年的样本DNA引起片段完整性降低 根据毛细管电泳峰图显示，存储时间< 3年的两组样本DNA片段大小超过1 000 bp，见图2，存储时长超过3年的两组样本DNA片段化程度严重。因此，快蜡标本存储年限越长，DNA片段完整性越低，提示病理技术人员需要根据具体的分子检测项目的DNA要求选择不同的标本存储年限。

2.4 存储5年内的样本符合DNA质控要求 BRAF基因VIC通道荧光信号曲线显示，内控基因Ct值分别为15.32，17.09，18.39，21.24。与样本存储时长< 1年组相比，其余3组Ct值明显升高，曲线升起晚，峰度低，Ct值差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。其中，存储时长超过5年的样本Ct值超出质控范围(13-21)。实验结果表明，存储5年内的样本符合DNA质控要求，见图3。

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引言

伴随着精准医疗的深化发展，肿瘤分子病理检测技术愈加普及，主要是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增技术，其中DNA提取的数量和质量是保证结果准确的重要因素，将直接影响PCR、Sanger测序、二代测序等分子检测。浓度高、纯度高、片段完整的DNA是实验室理想的样本[1]。
多种标本类型均可应用于分子检测。新鲜组织提取的DNA不易片段化，质量高，但不利于存储，而且组织中可能不含肿瘤细胞，导致假阴性的情况；液体活检无创，取样方便，但也无法进行准确病理评估，而且该类型样本基因检测具有较高的特异性，对检测方法灵敏度要求较高[2]。因此，以上标本用于分子检测具有明显的局限性。石蜡组织样本能够有效维持组织形态，便于储存，且可用于评估标本的病理结果，被广泛应用于分子检测及回顾性分析，然而受到多种试剂和因素的影响，如甲醛固定会造成DNA损伤，表现为交联、碱基转换、碱基脱落及DNA片段化[3]，对基于PCR的二代测序等检测产生极大的影响。分子检测的稳定性和可重复性依赖于核酸的完整性[4]，DNA的广泛片段化将减低文库性能，导致较低的唯一读数覆盖率[5]，降低检测的成功率[6-7]，并且随着石蜡标本储存时间的延长，DNA的片段化降解更严重，可扩增模板量直接减少，导致扩增后DNA序列假象，并降低PCR扩增效率[8-9]。已有报道表明，常规石蜡包埋组织储存时间越长，提取DNA的质量越差[10-11]。因此，石蜡标本的处理方式及储存时间对DNA的质量控制至关重要[12]。
超声处理组织技术是通过超声空化作用，加速分子运动，快速获取石蜡标本的技术(简称快蜡技术)，目前，快蜡技术已逐渐应用于胃肠镜活检、乳腺、肺等穿刺小活检标本中[13]，不仅能缩短组织处理时间，也保护了组织细胞形态的完整性，有利于病理的快速诊断，该技术不仅能够节省患者等待时间，而且能够提高病理诊断质量[14]。随着分子生物学技术的不断发展，快蜡技术也越来越多地被用来进行分子生物学分析。对于初治患者优先使用术后切除样本，选择最新采集的组织样本为最佳；在手术不可及或临床诊疗急迫等情形下，次优采用小活检组织进行分子检测，选择肿瘤含量最高或肿瘤最集中部位，有助于准确判断病变类型，便于临床第一时间为患者制定最佳治疗方案。快蜡技术操作简便、安全可靠、省时省力，仅需3个步骤就可完成脱水、透明和浸蜡的全部流程，与常规石蜡制片相比虽然可以显著缩短制片时间，但是由于在脱水过程中超声快速处理石蜡组织未经体积分数10%中性甲醛溶液充分固定，而是用环保型生物组织处理试剂结合超声波处理，在分子检测中核酸质量和基因检测结果与常规脱水组织是否一致有待进一步探讨。已有的研究表明超声处理组织技术适用于日常分子检测，且与传统常规组织处理技术相比，荧光原位杂交、PCR、Sanger测序等检测结果具有较高的一致性[15-16]。
研究表明，对于传统的石蜡组织标本，存储时间小于3年基本可满足包括NGS在内的分子检测和回顾性研究，存储> 3-5年的标本DNA片段化严重，5年以上的标本DNA片段化降解严重，不建议进行NGS检测[17-18]。然而，近年来，尚无大量文献报道超声处理标本的储存年限对分子检测项目中DNA质量的影响，基于快蜡技术的广泛应用及活检标本的珍稀性，探索最佳的标本存储时间对于临床分子检测、科研及回顾性分析具有重要意义。该研究收集了不同存储年限的超声处理标本，提取DNA，分析其浓度及纯度变化，评估片段完整性及降解程度，以探讨不同存储年限对DNA质量的影响，为分子项目检测提供更加完善的有效数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 分子检测研究。
1.2 时间及地点 实验于2023年7-9月在苏州大学附属第一医院病理科分子实验室完成。
1.3 材料 收集40例采用快蜡技术处理的乳腺穿刺小活检标本，病理诊断均为浸润性导管癌，患者就诊于苏州大学附属第一医院，就诊年限为2016年5月至2023年5月。按照样本存储年限分为4组，分别为存储< 1年组、存储1-3年组、存储> 3-5年组、存储> 5年，每组10例。所有标本均经规范取材，组织块厚度均< 3 mm，并用体积分数10%中性甲醛溶液充分固定。
纳入标准：穿刺组织至少2条，每条组织> 1.0 cm×0.1 cm。避免选择肿瘤细胞太少的部位、病变中心广泛纤维化的部位、黏液产生过高的部位、周围炎症严重的部位、含坏死组织过多的部位及含钙化灶并脱钙处理过的组织。
该研究的实施符合苏州大学附属第一医院的相关伦理要求，医院伦理批件号：(2022)伦研批第349号。患者或监护人同意参与研究。
1.4 方法
1.4.1 标本前处理 采用超声快速处理系统完成脱水、透明过程，温度为48-50 ℃，时间为35-40 min，脱水2次，处理好的标本再次放入超声波浸蜡缸中，浸蜡温度为65 ℃，时长10 min。HT-3自动组织脱水机及配套复合型环保试剂购自山东骏腾医疗科技有限公司。
1.4.2 苏木精-伊红染色 对快蜡标本进行切片，每张切片厚度均为3 μm，所有切片使用全自动苏木精-伊红染色仪(Dako CoverStainer)染色，参考2023版《乳腺癌病理诊疗指南》，切片染色结果由2位诊断医生对肿瘤细胞含量进行独立评估。
1.4.3 DNA提取 对快蜡标本进行切片，每张切片厚度均为3 μm，合计10-15张切片。将所有切片组织标记好，并置于1.5 mL 无菌离心管中，加入二甲苯进行脱蜡；向管中加入无水乙醇，洗去二甲苯；向管中加入Buffer ATL和蛋白酶K，置于56 ℃烘箱消化，当样本完全裂解时，洗去杂质；随后按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen)操作说明提取人类基因组DNA，最后用50 μL ATE缓冲液溶解DNA。
1.4.4 DNA浓度和纯度测定 通过Nanophotometer N60超微量分光光度计(IMPLEN)和Qubit 4.0荧光计检测DNA浓度(Invitrogen)，记录A260/A280 比值。
1.4.5 DNA片段完整性评估 利用全自动毛细管电泳核酸分析仪(Qsep 100)检测DNA片段完整性，以评估DNA片段的质量。每组随机选取5例标本，DNA的上机质量浓度为3 ng/μL。
1.4.6 荧光PCR检测 各组随机选取5例样本DNA为模板，使用荧光定量PCR仪(ABI7500)进行PCR检测人类某基因上某段保守序列，采用人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(厦门艾德生物技术有限公司)，按照说明书要求设置扩增程序，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，合计15个循环；93 ℃ 25 s，64 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，合计31个循环。该试剂盒设立了内控最为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，内控基因选择的检测区域是人类基因相对保守的外显子2区段，约100 bp，即便DNA有降解，内控仍然能够最真实地反映BRAF基因有效的DNA量。选择参比基因循环数(VIC)通道收集内控基因荧光信号，记录并比较Ct值，以评估DNA扩增能力。
1.5 主要观察指标
1.5.1 DNA浓度和纯度 通过 A260/A280比值来判定DNA纯度。A260/A280为1.8-2.0，即达到分子检测要求的纯度；A260/A280 < 1.8，DNA有蛋白质或酚等污染；A260/A280 > 2.0，DNA中含有RNA片段或DNA已变性。
1.5.2 DNA片段完整性 N/Q(Nanodrop/Qubit)比值可一定程度上反映DNA片段降解程度，其比值越小，DNA质量越高。Qsep100全自动核酸蛋白分析系统根据样本的降解程度及该样本高于设定阈值的占比，给出DNA质量数(DNA quality number，DQN)，范围为0-10。DNA质量数值越高，样本完整性越好，样本质量越高。
1.5.3 DNA扩增能力 内控基因正常Ct值应在13-21之间。若Ct值> 21，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入数量不够。
1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过苏州大学统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

规范化的组织标本前处理是病理后期各项技术顺利进展的保证，也是病理诊断准确的首要条件[19]。随着肿瘤患者诊疗需要的增加及微创技术的不断发展，肿瘤小活检标本快速处理已经成为一种趋势，能够为临床提供及时、准确的诊断信息，缩短诊断时限，减少患者等待时间。新型超声处理技术是在高速振荡的超声波和水浴加温下，快速完成对组织的脱水、透明及浸蜡工作。该技术能够有效改善细胞膜的通透性，不仅缩短了制片时间，还能对细胞形态、蛋白和核酸完整性予以保护[20-21]。已有文献结果表明，超声组织快蜡处理技术虽可使DNA片段化程度增加，但并不影响荧光原位杂交、荧光定量PCR和Sanger测序检测结果的准确性以及二代测序各项质控参数[22-23]。近年来尚无新型超声处理标本储存时间对分子检测影响的研究，该研究重点探讨新型超声技术处理后标本存储年限对组织DNA质量的影响，旨在为患者后续的分子检测提供符合质控要求的标本。
随着肿瘤精准治疗的普及，各项分子病理诊断技术迅速发展。目前常见的分子病理检测技术主要包括原位杂交(如显示色原位杂交、荧光原位杂交)、实时荧光定量PCR、数字PCR(ddPCR)及DNA测序(如Sanger 测序、高通量测序)等。在临床实践中，对于肿瘤个体化诊疗应用单一平台是无法完成的，需要综合检测平台来进行全面评估，所有的组织样本进行分子检测前都应进行病理评估，由病理专家进行阅片，确保有足够的肿瘤细胞用于分子检测。核酸的质量控制也至关重要，DNA的质量直接影响下游实验成功与否。在进行基于PCR扩增分子检测前，应先对DNA浓度、纯度及DNA片段完整性进行质控[24]。DNA浓度为样本需求量提供参考，DNA纯度能够确定样本中是否被其他核酸、蛋白质或化学物质污染，DNA片段完整性最主要用于评估样本的降解程度。对于组织蜡块样本，二代测序的DNA总量要求大于250 ng，片段分布超过1 000 bp，满足提取质量条件的DNA才能正常上机进行二代测序检测，不合格的核酸质量会直接影响建库的成功率及测序的准确性及可靠性。
在该研究中，不同年限4组样本苏木精-伊红染色层次均清晰分明，组织结构清楚，细胞形态完整，提示随着存储时长增加，病理形态没有明显改变，证实新型超声技术能够很好地适用于常规病理苏木精-伊红染色，且不受时间影响[25]。同样的，4组样本DNA纯度无显著差异，且A260/A280比值均在1.8-2.0之间，都能达到分子检测的DNA纯度要求，提示随着年限增加，DNA的纯度不受影响，与以往的研究结果一致[26]。然而，Nanodrop和Qubit检测出的DNA浓度结果相差较大。Nanodrop检测结果显示，1年内标本和1-3年内样本DNA浓度接近[27]。Qubit能够克服DNA中杂质的干扰，检测结果更为准确，结果显示，DNA浓度随着年限增加而显著降低。此外，> 3-5年的样本DNA总量不足200 ng，超过5年的样本DNA总量不足100 ng，未达到测序上机实验要求，可能会导致二代测序建库失败。因此，建议采用3年内样本进行二代测序检测。
既往文献提示，Nanodrop与Qubit值越接近，DNA质量越好，降解程度越低[28]。在该研究中，4组样本DNA的平均N/Q比值升高显著。随着存储年限增长，DNA片段降解程度增加。DNA片段完整性也是评判样本DNA质量的关键点。目前，对于样本DNA完整性质控，主要通过高精度凝胶电泳、微流控电泳和毛细管电泳进行检测[29]。该研究采用全自动毛细管电泳核酸分析仪检测，该分析系统以高质量片段占比作为质量标准，以DNA质量数来定义DNA样本的完整性。DNA质量数越高，样本完整性越好，即样本质量越高[30]。该研究中，与< 1年组相比，其余3组DNA质量数及大片段占比均值明显下降，根据毛细管电泳峰图显示，存储时间< 3年的两组样本DNA片段大小超过1 000 bp，而存储时长超过3年的两组样本DNA片段化程度严重，因此可以判断出，随着存储年限增长，DNA降解程度严重，DNA片段完整性显著降低。因此，超过3年的样本不建议进行二代测序检测，可能会产生大量异常数据，影响患者的诊疗，并导致实验成本的浪费。此外，通过荧光PCR检测VIC通道内控基因Ct值评价DNA扩增能力，实验结果表明，存储时长超过5年的样本Ct值超出质控范围，不建议进行后续常规分子检测，5年内的3组样本DNA扩增能力合格。因此，该实验结果为快蜡标本后续分子检测提供了具体的存储时限参考。
该研究存在一定的局限性：为提高实验结果的准确性及重复性，须在今后的工作中选取更多的肿瘤种类，并增加每组的样本数目；此外，将进一步探讨不同存储年限对后续分子检测结果的影响，尤其Sanger测序、二代测序等对DNA质量要求较高的检测平台，尚需更多数据验证。
综上所述，通过该研究可得出初步结论：对于新型超声处理的快蜡组织标本，随着存储年限的增加，DNA纯度不受影响，DNA浓度明显降低，DNA降解程度升高，DNA片段完整性显著降低。存储1年内的快蜡样本DNA质量最佳；存储3年内快蜡样本DNA质量能够达到PCR及二代测序检测的要求；存储5年内样本可尝试进行PCR等分子检测，而不建议对其进行二代测序；存储超过5年的样本不建议进行后续分子检测。与传统的石蜡组织标本相比，样本保存年限质控基本相符，但更推荐优先选用< 1年的样本进行后续分子检测及回顾性分析，处理时间更短，结果可靠，将显著提高临床运行效率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

新型超声快速处理活检标本保存不同年限对DNA质量的影响

Effects of different storage durations on DNA quality of biopsy specimens with novel ultrasound processing

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[1]	刘官娟, 宋娜, 安哲庆, 孙菁, 廖健. 宏基因组学与种植体周围炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(34): 5511-5516.
[2]	古丽，比力克孜•玉素甫，艾尼瓦尔•米吉提，阿地力•莫明. IRF6基因与新疆地区维吾尔人群非综合征性唇腭裂：基于二代测序技术的分析[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(37): 6064-6068.