小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2025.060

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (13): 2648-2654.doi: 10.12307/2025.060

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小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

杨超，罗宗平

苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2024-01-20 接受日期:2024-04-13 出版日期:2025-05-08 发布日期:2024-09-11
通讯作者: 罗宗平，博士，教授，苏州大学附属第一医院骨科,苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:杨超，男，1998年生，河南省南阳市人，苏州大学附属第一医院在读硕士，主要从事间充质干细胞成骨分化相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32071307)，项目负责人：罗宗平

Small molecule drug TD-198946 enhances osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Yang Chao, Luo Zongping

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2024-01-20 Accepted:2024-04-13 Online:2025-05-08 Published:2024-09-11
Contact: Luo Zongping, MD, Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Yang Chao, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 32071307 (to LZP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

TD-198946：一种噻吩吲唑衍生物，可以诱导干细胞向软骨方向分化，用于治疗软骨退变与髓核退变。
成骨分化：指多能干细胞转化为成骨细胞进而生成完整骨组织的过程。这个过程在骨骼的形成、生长和修复中起着至关重要的作用。

摘要
背景：小分子药物TD-198946是一种能诱导干细胞形成软骨的高效软骨生成剂，但目前尚不清楚其对成骨分化的作用。
目的：探讨小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果及其作用机制。
方法：提取SD大鼠骨髓间充质干细胞，利用CCK-8法评估不同浓度TD-198946对骨髓间充质干细胞增殖的影响，确定TD-198946的最佳使用浓度；然后加入最适浓度TD-198946和成骨分化培养基对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导；成骨诱导第3天用qRT-PCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原基因表达；成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶染色，Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达；成骨诱导第21天进行茜素红染色。
结果与结论：①CCK-8实验结果显示，100 nmol/L TD-198946能促进骨髓间充质干细胞增殖；②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示，TD-198946能促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化；③qRT-PCR结果显示，TD-198946可促进成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt 相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达；④Western blot结果显示，TD-198946可促进Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原以及p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果表明，小分子药物TD-198946可能通过激活PI3K/AKT信号通路，诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0001-7246-7003 (罗宗平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, TD-198946, 成骨分化, PI3K/AKT信号通路, AKT, p-AKT

Abstract: BACKGROUND: TD-198946 is a small molecule drug known to induce stem cells to form cartilage; however, its effect on osteogenic differentiation remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of the small molecule drug TD-198946 on promoting osteoblastic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells and its mechanism of action.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were extracted from SD rats. CCK-8 assay was used to evaluate the effect of different concentrations of TD-198946 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells to determine the optimal concentration of TD-198946. Then, the optimal concentration of TD-198946 and osteogenic medium were added to induce osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. On day 3, qRT-PCR was used to detect the expression of alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, osteopontin, osteocalcin, and type I collagen genes. On day 7 of osteogenic induction, alkaline phosphatase staining and western blot assay were performed to detect the expression of Runt-related transcription factor 2, type I collagen, AKT, p-AKT, PI3K, and p-PI3K proteins. On day 21 of osteogenic induction, Alizarin red staining was conducted.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay results revealed that 100 nmol/L TD-198946 could promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. (2) The results of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining showed that TD-198946 could promote osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. (3) qRT-PCR results showed that TD-198946 could promote the expression of osteogenic genes alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, osteopontin, osteocalcin, and type I collagen. (4) Western blot assay results showed that TD-198946 could enhance the expression of Runt-related transcription factor 2, type I collagen, p-PI3K, and p-AKT. The results indicate that the small molecule drug TD-198946 may induce osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by activating the PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, TD-198946, osteogenic differentiation, PI3K/AKT signaling pathway, AKT, p-AKT

中图分类号:

杨超, 罗宗平. 小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(13): 2648-2654.

Yang Chao, Luo Zongping. Small molecule drug TD-198946 enhances osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(13): 2648-2654.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态与分化能力 原代大鼠骨髓间充质干细胞为漩涡状贴壁生长的纤维状样细胞，见图1A。传代至第3代后杂细胞明显减少，见图1B。成骨诱导分化21 d后，使用茜素红染色观察到钙结节形成，见图1C。成脂诱导分化10 d后，使用油红O染色观察到细胞内出现了大量脂滴，见图1D。

2.2 TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响 第1天时，10 000 nmol/L TD-198946抑制细胞增殖；第3天时，100，1 000 nmol/L TD-198946促进细胞增殖，10 000 nmol/L TD-198946抑制细胞增殖；第5天时，100 nmol/L TD-198946促进细胞增殖，10 000 nmol/L TD-198946抑制细胞增殖，见图2。说明低浓度(10，100 nmol/L)TD-198946可以促进骨髓间充质干细胞增殖，但随着浓度升高，TD-198946抑制作用也逐渐显现。因此，在后续实验中选择100 nmol/L TD-198946进行处理。

2.3 TD-198946增强了大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力 与对照组相比，TD-198946组碱性磷酸酶染色颜色更深，阳性面积更多，见图3A。碱性磷酸酶活性定量测定结果显示，与对照组相比，TD-198946组碱性磷酸酶活性升高(P < 0.000 1)，见图3B。茜素红染色显示TD-198946组形成了更多的钙结节，见图3C。定量分析结果同样表明TD-198946组的钙结节更多，见图3D。

2.4 TD-198946促进了大鼠骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达 在成骨诱导分化第3天，TD-198946能够提高成骨相关基因：Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平，见图4。

2.5 TD-198946促进了大鼠骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白的表达 在成骨诱导分化第7天，与对照组相比，TD-198946组成骨相关蛋白Runt相关转录因子2和Ⅰ型胶原的蛋白表达显著增强，见图5。

2.6 PI3K/AKT信号通路参与TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的增强作用 Western blot 检测结果显示，与对照组相比，TD-198946组PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K、AKT表达升高，但差异均无显著性意义(P > 0.05)。与对照组相比，TD-198946组p-PI3K、p-AKT表达显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01，P < 0.05)，见图6。

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引言

骨质疏松症作为一种常见的代谢性骨疾病，其主要特征在于骨密度的下降和骨微观结构的破坏，这些改变导致了骨折风险显著增加[1-2]，主要发生在老年人尤其是绝经后妇女[3]。随着全球人口老龄化进展，骨质疏松症患病率持续上升[4]。骨质疏松症的发病机制是骨形成和骨吸收之间的不平衡，表现为骨吸收增强、骨生成减弱[5]。迄今为止，人类已经研制出众多骨质疏松症的治疗药物，其中效果良好、应用较为广泛的是双膦酸盐类药物、降钙素等，研究表明这些药物被人体吸收后，会通过抑制骨吸收来发挥作用。但是长期使用这些药物存在一定风险，可能会导致胃肠道毒性、心房颤动、骨坏死等不良反应，而且对刺激骨生成的作用有限[6-7]。因此，寻找不良反应小且能有效促进骨生成的新药物非常必要。
骨髓间充质干细胞是一种具有多重潜能的干细胞，源自于骨髓，并在骨骼发生发展过程中扮演关键角色。骨髓间充质干细胞能够根据骨髓微环境中存在的特定分子信号进行定向分化，除了能够分化为成骨细胞，还能分化成其他几种细胞类型，如脂肪细胞、软骨细胞等，从而在维持骨骼健康和修复受损骨骼方面发挥至关重要的作用[8]。同时，骨髓间充质干细胞具有增殖能力强、低免疫原性等优点，可用于细胞治疗和组织工程研究，已被证实可用于修复骨损伤和治疗骨关节疾病[9-10]。深入研究骨髓间充质干细胞分化调控的分子机制，探索诱导其向成骨细胞分化的新策略，是当前骨生物学研究的热点。通过促进骨髓间充质干细胞的增殖，加快新骨形成，有助于增强骨质疏松症患者的骨代谢功能，从而发挥治疗疾病的作用。
TD-198946是一种噻吩吲唑衍生物，YANO等[11]使用Col2GFP-ATDC5系统发现TD-198946可以显著提高ATDC5细胞的COL2A1启动子活性，进一步研究发现其通过促进软骨生成因子Runt相关转录因子2的表达增强软骨基质合成，而不会导致软骨肥大。TD-198946也可以与细胞片技术结合产生丰富的软骨基质用于再生软骨[12]。TD-198946可以通过激活NOTCH3信号通路促进人滑膜间充质干细胞的软骨生成[13]，还可以通过激活PI3K-AKT信号通路来增强髓核细胞的基质合成来防止椎间盘变性[14]。多项研究已经证明TD-198946可以通过不同途径促进干细胞的成软骨分化、软骨与髓核的基质合成，但目前还没有研究关注TD-198946对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
PI3K/AKT信号通路在细胞增殖、分化、免疫应答调节中至关重要[15-18]。PI3K/AKT/mTOR通路激活可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[19]。而PI3K/AKT通路抑制剂LY294002[20]、LY3023414的使用则抑制了成骨分化[21]。TD-198946在髓核细胞中通过激活PI3K/AKT信号通路促进基质合成[14]，因此作者推测在骨髓间充质干细胞中TD-198946同样可以激活PI3K/AKT信号通路，活化成骨分化相关基因，从而促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
该研究通过向成骨诱导培养基中加入TD-198946，探讨TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及PI3K/AKT信号通路在其中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年8月至2024年1月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠8只，4周龄，体质量100 g左右，购买自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0006。开展实验研究期间，所有的动物手术均在麻醉状态下进行，以最大限度地减少动物的疼痛和痛苦，并严格遵守了相关的动物福利和伦理标准。实验方案经苏州大学伦理委员会批准，审定编号为SUDA20231116A05。
1.3.2 实验主要试剂 TD-198946(美国MedChemexpress生物科技公司)；DMEM高糖培养基、α-MEM培养基[赛默飞世尔生物制品(北京)有限公司]；0.25%胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液(双抗)(武汉普诺赛生命科技有限公司)；β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松(美国Sigma-Aldrich公司)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛、胰岛素(上海源叶生命科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛(兰杰柯科技有限公司)；RIPA 裂解液、茜素红染色液(北京索莱宝科技有限公司)；Trizol 裂解液、反转录酶(南京诺唯赞医疗科技股份有限公司)；通用型SYBR Green预混液(美国伯乐公司)；PCR引物(苏州金唯智生物科技有限公司)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒、转膜液、快速封闭液(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清[依科赛生物科技(太仓)有限公司]；Runt相关转录因子2抗体、Ⅰ型胶原抗体、p-AKT抗体、AKT抗体、p-PI3K抗体、PI3K抗体、GAPDH抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞 对4周龄雄性SD大鼠进行深度麻醉后处死，然后将其浸泡在乙醇中5 min消毒。使用高压蒸汽灭菌后的器械取出大鼠双侧股骨与胫骨放入含5%双抗的PBS中保存，注意不要破坏骨骼完整性以防止细菌进入骨髓腔。在超净台中用无菌纱布将骨骼上残留的肌肉去除干净，随后用灭菌的剪刀剪掉股骨和胫骨两端暴露骨髓腔，用无菌注射器抽取α-MEM基础培养基对股骨和胫骨的骨髓腔进行多次冲洗，直到其内部颜色变为白色；将得到的骨髓液收集至离心管中，并通过100 μm的细胞滤网对细胞进行过滤；1 200 r/min离心5 min，去除上清液，再用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基重新悬浮细胞，转移至37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中的培养皿内进行培养；2 d后，更换培养基以移除未附着的细胞，并在此后每2 d更换1次培养基；当细胞融合达到培养皿表面积的90%左右时，PBS清洗，采用0.25%胰蛋白酶消化，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化。最后，将所得细胞分成2份，一部分细胞进行细胞冻存，需要时取出使用，一部分按照1∶3比例传代，并在后续实验中继续培养传代至第3代，让细胞纯度提高。
1.4.2 细胞分化能力鉴定
(1)成骨诱导分化：对第3代骨髓间充质干细胞进行消化和计数后，以2×104个/cm2的密度种植于12孔板中，向每孔中加入1 mL含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。当细胞融合度达到70%-80%时，吸弃孔内培养基，更换为1 mL成骨诱导分化培养基(含有10 mmol/L β-磷酸甘油钠、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL维生素C、体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基)，每隔3 d换液1次，成骨诱导21 d进行茜素红染色。具体方法见1.4.7。
(2)成脂诱导分化：对第3代骨髓间充质干细胞进行消化和计数后，以2×104个/cm2细胞的密度种植于12孔板中，向每孔中加入1 mL含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养。当细胞融合度达到100%时，吸弃孔内培养基，更换为1 mL成脂诱导分化培养基A液(含体积分数10%胎牛血清、50 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L吲哚美辛、5 mg/mL胰岛素的DMEM高糖培养基)，诱导2 d后吸弃培养基，加入等量成脂诱导分化培养基B液(含体积分数10%胎牛血清、5 mg/mL胰岛素的DMEM高糖培养基)维持1 d。A液、B液交替培养直至细胞内出现明显脂滴。诱导10 d左右细胞内出现明显脂滴进行油红O染色，具体方法：细胞用PBS洗涤1次，然后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，加入染色洗涤液20 s，吸除染色洗涤液，加入适量油红O染色工作液，染色30 min，吸除油红O染色工作液，加入染色洗涤液，静置30 s，然后去除染色洗涤液，用PBS洗涤20 s，使用显微镜拍摄数码图像。
1.4.3 CCK-8 检测大鼠骨髓间充质干细胞活性 对第3代骨髓间充质干细胞进行消化和计数后，以每孔3 000个细胞的密度接种在96孔板中，用含不同浓度(0，10，100，1 000，10 000 nmol/L) TD-98946的α-MEM完全培养基培养，在第1，3，5 天同一时间点去除原培养基，然后加入100 μL含10% CCK-8溶液的α-MEM基础培养基，放入培养箱避光培养1 h，使用全波长酶标仪测定波长450 nm处吸光度值。
1.4.4 实验分组及成骨分化诱导 对第3代骨髓间充质干细胞进行消化和计数后，以2×104个/cm2的密度种植于6孔板或12孔板中，当细胞融合度达到70%-80%时，吸弃孔内培养基，更换为1 mL成骨诱导分化培养基(对照组)或者1 mL含100 nmol/L TD198946的成骨诱导分化培养基(TD-198946组)。
1.4.5 碱性磷酸酶染色 在成骨诱导分化第7天，细胞用PBS洗涤3次，然后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，按照制造商的说明书使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒染色30 min，使用显微镜拍摄数码图像。
1.4.6 碱性磷酸酶活性测定 在成骨诱导分化第7天，以低温RIPA细胞裂解缓冲液提取蛋白，离心后上清液分成两部分，其中一部分采用增强型BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，另一部分采用碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性，采用全波长酶标仪在405 nm处测定吸光度值。根据各组蛋白浓度进行标准化计算酶活性。
1.4.7 茜素红染色 在成骨诱导分化第21天，细胞用PBS洗涤3次，然后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，在室温下用茜素红染液孵育30 min，PBS洗涤2次，使用显微镜拍摄数码图像。为了定量基质矿化水平，每孔加入1 mL 5%高氯酸以溶解钙化层的染色剂，使用全波长酶标仪测定波长420 nm处吸光度值。
1.4.8 实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR) 在成骨诱导分化第3天，按照制造商的说明书使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，然后使用反转录酶将mRNA 反转录成 cDNA，使用通用型SYBR Green预混液，CFX96™实时PCR系统进行PCR，检测成骨相关基因 Runt 相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平。采用2-ΔΔCt方法，并以GAPDH作为参照基因，计算各目标基因mRNA的相对表达水平。具体引物序列见表1。

1.4.9 Western blot检测 在成骨诱导分化第7天，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液进行细胞裂解，细胞在冰上孵育1 h，随后12 000×g离心15 min，收集上清液，即为蛋白样品。利用碧云天增强型BCA蛋白质浓度检测试剂盒对所得蛋白样本的浓度进行精确测定。取等量蛋白进行变性处理，然后用10%聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳分离蛋白，然后将凝胶上已被分离的蛋白转膜至硝酸纤维素膜上，将膜置于快速封闭液中在摇床上室温封闭30 min，然后在Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、GAPDH(1∶1 000)一抗中4 ℃过夜孵育，TBST洗涤，使用HRP偶联的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤，然后使用超敏ECL发光液进行曝光显影，使用Image J软件对条带的强度进行定量分析。

1.5 主要观察指标 ①TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的影响；②TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响；③TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因及蛋白表达的影响；④TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中PI3K/AKT信号通路关键因子PI3K、AKT蛋白及其磷酸化水平的影响。
1.6 统计学分析 所有的统计分析均通过GraphPad Prism 10.1.2软件完成。数据均以x±s表示。两组横向对比分析时，采用独立样本t检验(Student’s t test)，多组比较分析时，采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，使用Tukey检验进行事后比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨质疏松的发生主要是由于骨吸收大于骨形成[22]。目前临床用于治疗骨质疏松的药物大多为骨吸收抑制剂，对促进骨形成的药物研究较少。骨髓间充质干细胞是骨形成的基本细胞单位，在骨再生和修复中的关键作用已被广泛认可[23–25]，可作为骨质疏松治疗中促进骨形成的靶点细胞，但如何有效激活其成骨分化能力仍是一个挑战。TD-198946作为一种新型噻吩吲唑衍生物化合物，以往研究集中于其在软骨生成和防止椎间盘变性方面的作用[11-14，26]，但其在骨髓间充质干细胞成骨分化方面的作用尚未明确。
该研究首先通过全骨髓贴壁法得到了大鼠骨髓间充质干细胞，多向分化诱导实验证明得到的细胞具有成骨成脂分化潜能。使用不同浓度的TD-198946干预大鼠骨髓间充质干细胞，CCK-8检测结果表明低浓度TD-198946具有一定的促细胞增殖能力，但在浓度升高时逐渐转变为抑制细胞增殖，这可能是因为低浓度TD-198946对细胞的代谢活动有积极影响，而高浓度TD-198946对细胞产生了毒性效应，从而抑制细胞的生长和分裂。因此选择100 nmol/L TD-198946作为后续研究的使用浓度，与以往文献相近[11]。碱性磷酸酶染色与茜素红染色表明TD-198946干预可以使大鼠骨髓间充质干细胞在成骨分化过程中具有更高的碱性磷酸酶活性与更多的钙结节生成，证明了TD-198946的促成骨作用。YANO等[11]研究显示TD-198946并不影响小鼠胚胎瘤细胞(ATDC5细胞)成软骨分化时的肥大化，与该研究结果似乎有所不同，这可能是由于细胞类型与诱导分化条件不同导致的。
Runt 相关转录因子2参与多种信号转导通路促进多个成骨细胞分化表型和功能蛋白表达，阻断脂肪细胞特异性转录因子表达，抑制成脂分化。碱性磷酸酶代表成骨细胞合成Ⅰ型胶原、形成骨基质的能力，可水解有机磷酸酶，为羟基磷灰石的沉积提供必须的磷酸，同时水解破坏焦磷酸、ATP 等生理性生长抑制剂，有利于细胞成骨分化。骨桥蛋白是一种多功能的磷酸化糖蛋白，广泛存在于人体多种组织中，尤其在骨骼组织中表达丰富。它在骨骼的形成、重塑以及矿化过程中扮演着重要的角色。骨桥蛋白不仅参与细胞的黏附、迁移和存活，还影响免疫反应和炎症过程。在骨骼代谢方面，骨桥蛋白可以作为成骨细胞和破骨细胞之间通信的重要因子，调控它们的活动，从而影响骨质的生成和吸收。骨钙蛋白是一种在骨骼组织中特异性合成的蛋白质，有助于调节骨骼中钙磷酸盐的沉积和释放，从而维持骨骼的矿化和硬度。Ⅰ型胶原是主要的胞外骨蛋白，可引起成骨分化和矿化。qRT-PCR 实验结果显示，TD-198946干预后Runt 相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原的表达增强。Western blot结果显示，TD-198946干预后Runt相关转录因子2与Ⅰ型胶原蛋白水平升高。PI3K/AKT信号通路已被广泛认可为调控骨质疏松的重要信号传导通路，在骨形成过程中扮演着重要的角色[27–29]，已经成为骨缺损领域的热点研究方向[30-31]。该研究对PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT的蛋白表达水平与其磷酸化水平进行了验证，结果表明TD-198946干预组PI3K、AKT磷酸化水平显著提高，证明PI3K/AKT 通路可能参与调控TD-198946对大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的激活。
该研究首次明确了TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的效果，其可能是通过激活PI3K/AKT信号通路诱导成骨分化。该研究可为临床治疗骨质疏松症提供新的思路，也为深入理解骨髓间充质干细胞调控机制提供新的科学依据。但该研究也存在一些局限性：首先，研究使用的是大鼠骨髓间充质干细胞，其对人类的适用性仍需进一步验证；另外，实验仅在体外条件下进行，其结果可能与体内情况有所不同，因此需要在动物模型中进一步验证TD-198946的成骨效果和安全性；其次，TD-198946激活PI3K/AKT信号通路的具体机制以及这一机制在不同生物体和细胞类型中的普遍性仍需进一步探究；此外，TD-198946对细胞增殖的影响也显示出了其可能的剂量依赖性，这需要在未来的研究中进行更为详细的探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

小分子药物TD-198946促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

Small molecule drug TD-198946 enhances osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

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