类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用

doi:10.12307/2025.324

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (12): 2536-2543.doi: 10.12307/2025.324

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类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用

朱鹏1，2，李瑛玉1，2，卢小倩1，2，吴琼1，2

1广西高校重点实验室干细胞与医药生物技术(广西师范大学)，广西壮族自治区桂林市 541004；2广西师范大学生命科学学院，广西壮族自治区桂林市 541006

收稿日期:2024-01-23 接受日期:2024-04-03 出版日期:2025-04-28 发布日期:2024-09-10
通讯作者: 吴琼，博士，教授，广西高校重点实验室干细胞与医药生物技术(广西师范大学)，广西壮族自治区桂林市 541004；广西师范大学生命科学学院，广西壮族自治区桂林市 541006
作者简介:朱鹏，男，1998年生，四川省内江市人，汉族，广西师范大学在读硕士，主要从事衰老及相关疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32160170)，项目负责人：吴琼

Anti-obesity effect of insulin-like growth factor 1 in naturally aging mice

Zhu Peng1, 2, Li Yingyu1, 2, Lu Xiaoqian1, 2, Wu Qiong1, 2

1Guangxi Universities Key Laboratory of Stem Cell and Biopharmaceutical Technology (Guangxi Normal University), Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-01-23 Accepted:2024-04-03 Online:2025-04-28 Published:2024-09-10
Contact: Wu Qiong, PhD, Professor, Guangxi Universities Key Laboratory of Stem Cell and Biopharmaceutical Technology (Guangxi Normal University), Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhu Peng, Master candidate, Guangxi Universities Key Laboratory of Stem Cell and Biopharmaceutical Technology (Guangxi Normal University), Guilin 541004, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 32160170 (to WQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF1)：是一种主要由肝脏产生的内分泌因子。机体内许多细胞都具有类胰岛素生长因子1的受体，这使得类胰岛素生长因子1可以成为促进细胞通讯或细胞分裂信号传导过程中的主要载体。
衰老与肥胖：衰老会导致脂肪质量和脂肪分布的变化，表现为肌肉质量减少、脂肪的质量增加。此外，衰老会导致去脂体质量和皮下脂肪逐渐减少，从而会使腹部的脂肪异位堆积，导致脂肪聚集在腹部、内脏和肌肉组织之间，从而导致中心性肥胖。

背景：实验室前期研究发现青年脂肪干细胞移植到老年小鼠体内会有减重效果，并且能改善老年小鼠体内炎症状态，推测类胰岛素生长因子1可能对于衰老和肥胖具有重要作用。
目的：探究类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用。
方法：①生物信息学分析：对GEO数据库中肥胖患者的脂肪组织测序，并对青年小鼠脂肪干细胞和老年小鼠脂肪干细胞进行转录组学测序，分析类胰岛素生长因子1表达情况。②动物实验验证：2月龄雄性C57BL/6J小鼠(青年小鼠)6只，20月龄雄性C57BL/6J小鼠(老年小鼠)12只。采用ELISA和qRT-PCR检测青年小鼠和老年小鼠的腹部脂肪组织和血清类胰岛素生长因子1的表达情况。将老年小鼠12只随机分为2组：实验组连续4周注射类胰岛素生长因子1蛋白(50 μg/kg)，对照组注射同等剂量的PBS。定期监测实验组和对照组小鼠体质量变化，实验结束时测量小鼠葡萄糖耐受，ELISA检测小鼠血清炎症因子、腹部脂肪组织炎症因子，苏木精-伊红染色观察肝、肾及腹部脂肪组织病理变化，qRT-PCR检测腹部脂肪组织炎症因子、PI3K-AKT信号通路mRNA的表达水平。
结果与结论：①肥胖患者脂肪组织低表达类胰岛素生长因子1，并在接受减肥手术后类胰岛素生长因子1表达上升；②老年脂肪干细胞低表达类胰岛素生长因子1；③老年小鼠腹部脂肪组织和血清均低表达类胰岛素生长因子1；④注射类胰岛素生长因子1蛋白能显著降低老年小鼠的体质量并改善胰岛素抵抗；⑤老年小鼠肝脏病理切片发现有脂肪堆积情况，注射类胰岛素生长因子1蛋白后，脂肪堆积情况显著改善，并且显著降低了脂肪组织的脂滴大小；⑥注射类胰岛素生长因子1能显著降低老年小鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达水平，显著增加脂肪组织PI3K-AKT信号通路的表达；⑦结论：外源性类胰岛素生长因子1能降低老年小鼠体质量、减小脂肪组织脂滴大小及改善肝脏脂肪堆积情况，改善老年小鼠的炎症状态，可能是通过激活PI3K-AKT信号通路改善老年小鼠的炎症状态，从而改善自然衰老小鼠的肥胖。
https://orcid.org/0009-0003-5088-5038(朱鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 类胰岛素生长因子1, 老年, 肥胖, 脂肪组织, 胰岛素抵抗, 炎症, PI3K-AKT信号通路

Abstract: BACKGROUND: In our previous experiments, it was found that transplantation of young adipose stem cells into aged mice would have weight loss effect and improve the inflammatory state in aged mice. Therefore, we speculate that insulin-like growth factor 1 may play an important role in aging and obesity.
OBJECTIVE: To explore the anti-obesity effect of insulin-like growth factor 1 in naturally aging mice.
METHODS: (1) Bioinformatics analysis: Sequencing of adipose tissue from obese patients in the GEO database and transcriptomic sequencing of young mouse adipose stem cells and old adipose stem cells were conducted to analyze insulin-like growth factor 1 expression. (2) Animal experiment verification: Six young C57BL/6J mice and twelve aged C57BL/6J mice (20 months old) were selected. Abdominal adipose tissue and serum insulin-like growth factor 1 expression in young and aged mice were examined by ELISA and qRT-PCR. All the 12 aged mice were randomly divided into two groups with 6 mice in each group: the experimental group was given insulin-like growth factor 1 (50 μg/kg) for 4 continuous weeks, while the control group was given the same amount of phosphate buffer saline. The body mass changes of mice were monitored regularly, glucose tolerance was measured at the end of the experiment, and serum inflammatory factors and inflammatory factors in abdominal white adipose tissue of mice were detected by ELISA. Hematoxylin-eosin staining was used to observe pathological changes in the mouse liver, kidney and abdominal white adipose tissue. The mRNA expression levels of inflammatory factors and PI3K-Akt signaling pathway in abdominal white adipose tissue of mice were detected by qRT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Obese patients showed lowly expressed insulin-like growth factor 1 in adipose tissue, but the expression of insulin-like growth factor 1 increased after weight loss surgery. Insulin-like growth factor 1 expressed lowly in aged adipose stem cells. Insulin-like growth factor 1 also showed a low expression in adipose tissue and serum of aged mice. Injection of insulin-like growth factor 1 protein could significantly reduce the body mass of aged mice and improve insulin resistance. Pathological sections of the liver of aged mice revealed fat accumulation. After injection of insulin-like growth factor 1 protein, fat accumulation was significantly improved and the size of fat droplets in adipose tissue was significantly reduced. Insulin-like growth factor 1 injection significantly reduced the expression levels of serum tumor necrosis factor α, interleukin 1β, and interleukin 6 in aged mice, and significantly increased the expression of PI3K-AKT signaling pathway in adipose tissue of aged mice. To conclude, exogenous insulin-like growth factor 1 can reduce body mass, reduce fat droplet size in adipose tissue, and improve liver fat accumulation in aged mice, thereby improving their inflammatory status. Exogenous insulin-like growth factor 1 may activate the PI3K-AKT signaling pathway to improve the inflammatory symptoms in aged mice, thereby improving obesity in naturally aging mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: insulin-like growth factor 1, aged, obesity, adipose tissue, insulin resistance, inflammation, PI3K-AKT signaling pathway

中图分类号:

朱鹏, 李瑛玉, 卢小倩, 吴琼. 类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(12): 2536-2543.

Zhu Peng, Li Yingyu, Lu Xiaoqian, Wu Qiong. Anti-obesity effect of insulin-like growth factor 1 in naturally aging mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(12): 2536-2543.

图/表（结果） 6

2.1 生信分析类胰岛素生长因子1表达情况 ①通过GEO数据库中样本为人脂肪组织的测序分析，结果如图1A所示，肥胖组中的类胰岛素生长因子1表达显著降低，但在减肥手术后类胰岛素生长因子1的表达回升。②对青年小鼠脂肪干细胞和老年小鼠脂肪干细胞进行了转录组学测序，结果如图1B所示，发现老年脂肪干细胞低表达类胰岛素生长因子1。因此推测类胰岛素生长因子1可能对于衰老和肥胖具有重要作用。
2.2 动物实验验证结果
2.2.1 实验动物数量分析 ①实验选用2月龄小鼠6只，20月龄小鼠6只进行ELISA和qRT-PCR检测；②选用20月龄C57BL/6J小鼠12只，分为2组，实验过程中无小鼠死亡、脱失等情况发生，进入结果分析12只。
2.2.2 小鼠类胰岛素生长因子1表达为了验证上述生信分析结果，采用qRT-PCR和ELISA检测了青年和老年小鼠腹部脂肪组织和血清类胰岛素生长因子1的表达情况。①qRT-PCR检测小鼠腹部脂肪组织，结果如图2A所示，发现老年小鼠低表达类胰岛素生长因子1 mRNA。②ELISA检测小鼠腹部脂肪组织，结果如图2B所示，同样发现老年小鼠低表达类胰岛素生长因子1。③ELISA检测小鼠血清，结果如图2C所示，依然发现老年小鼠低表达类胰岛素生长因子1。这个结果与上述生信分析结果一致，据此推测类胰岛素生长因子1可能对治疗老年小鼠的肥胖体征具有一定的作用。
2.2.3 小鼠体质量与摄食量为了探究类胰岛素生长因子1对于老年小鼠的具体作用，分别对老年、青年小鼠注射类胰岛素生长因子1蛋白或同等剂量的PBS，定期监测小鼠体质量变化及摄食量。①小鼠体质量变化如图3A所示，从第2周开始，实验组小鼠的体质量与对照组相比有显著性的变化(P < 0.05)，实验结束时，实验组小鼠平均减少体质量7 g，结果表明注射类胰岛素生长因子1蛋白能显著降低老年小鼠体质量。②小鼠摄食量情况如图3B所示，结果表明注射类胰岛素生长因子1蛋白对小鼠摄食量无影响。③连续注射4周类胰岛素生长因子1蛋白后，小鼠的葡萄糖耐受结果如图3C所示，曲线面积如图3D所示，结果发现注射类胰岛素生长因子1有效降低了小鼠的初始血糖，且曲线面积与对照组相比显著降低，说明类胰岛素生长因子1能够改善老年小鼠的胰岛素抵抗。
2.2.4 小鼠肝、肾和脂肪组织病理学观察 ①对照组和实验组小鼠的肝脏病理学切片如图4A所示，在对照组中发现老年小鼠肝脏具有脂肪堆积的情况，注射类胰岛素生长因子1蛋白后，显著改善了这种脂肪堆积。②对照组与实验组肾脏病理学切片如图4B所示，通过观察发现，对照组小鼠肾脏病理学切片与实验组小鼠肾脏病理学切片相比无明显差异。③对照组小鼠与实验组小鼠腹部脂肪组织病理学切片如图4C所示，通过Image J软件对脂滴大小面积进行测量，测量结果如图4D所示，发现实验组小鼠脂滴大小显著减小，说明类胰岛素生长因子1可能是通过减小脂肪组织脂滴大小来减轻体质量的。
2.2.5 小鼠炎症因子检测结果 ①小鼠腹部脂肪组织qRT-PCR检测结果如图5A所示，发现类胰岛素生长因子1能显著降低脂肪组织炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6 mRNA的表达水平。②小鼠血清炎症因子的检测结果如图5B所示，发现类胰岛素生长因子1能显著降低小鼠体内炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的表达水平，显著增加白细胞介素10的表达水平。③小鼠腹部脂肪组织ELISA检测结果如图5C所示，发现类胰岛素生长因子1能显著降低脂肪组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素β的表达水平。这些结果表明，类胰岛素生长因子1能改善老年小鼠体内炎症状况，但具体机制需进一步探究。
2.2.6 小鼠脂肪组织PI3K-AKT信号通路表达情况为了探究类胰岛素生长因子1的作用机制，采用qRT-PCR检测了小鼠腹部脂肪组织PI3K-AKT信号通路mRNA的表达，如图6所示。结果表明，与对照组相比，类胰岛素生长因子1显著提升了腹部脂肪组织PI3K-AKT信号通路的表达，提示类胰岛素生长因子1可能是通过类胰岛素生长因子1信号通路对老年小鼠发挥相关作用的。

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引言

全球人口老龄化是目前全世界面临的重大健康问题，老年人群中出现肥胖的比例不断增加(年龄≥65岁，体质量指数≥30 kg/m2)[1]。老年人肥胖是衰老和年龄相关疾病的结合，如骨质退化、2型糖尿病、癌症和心血管疾病，这些疾病会影响生活质量。衰老过程中的肥胖主要是由于腹部的脂肪异位堆积，导致脂肪聚集在腹部、内脏和肌肉组织之间。同时在老年人群中，肥胖对绝经后妇女的骨折没有保护作用，并且与踝关节和大腿骨折的风险增加有关 [2]。虽然老年人的骨密度正常或者较高，但在老年人群中，易发生骨折的潜在因素是肌肉减少症和骨质疏松症(与骨密度无关的骨强度)[3-4]。实际上，肥胖会导致老年人肌少症性肥胖，这除了会增加骨骼的机械负担外，还会增加骨折的发生率[5]。LIU等[1]发现肌少症性肥胖还能增加老年患心血管疾病的概率，并导致代谢紊乱、认知障碍、关节炎和肺部疾病的风险增加；并发现肥胖老年人拥有较高的肌肉质量和力量可以减少患肌肉减少症的风险。
类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)
是一种肽类生长因子，在生长、发育和代谢的多个方面具有重要功能。类胰岛素生长因子1 的生物作用是由类胰岛素生长因子1 受体介导的，由一组结合蛋白(IGFBP)调节，这些结合蛋白在循环和细胞外液中结合和运输配体。类胰岛素生长因子1 受体是一种在进化上与胰岛素受体(insulin receptor，InsR)相关的细胞表面蛋白，几乎所有的细胞都表达类胰岛素生长因子1 受体，所以类胰岛素生长因子1可以调控细胞的凋亡、增殖和功能等。类胰岛素生长因子1调节网络被认为是癌症治疗中的潜在分子靶点，并且正在尝试将临床前结果转化为医疗方案[6-10]。
前期研究发现青年脂肪干细胞能显著降低老年小鼠体质量并改善衰老相关指标，但老年脂肪干细胞无此效
果[11]，因此作者对青年脂肪干细胞和老年脂肪干细胞进行转录组学测序，发现了老年脂肪干细胞低表达类胰岛素生长因子1。CHEN等[12]通过对骨质疏松症相关的所有基因进行汇编，并评估其是否是与骨质疏松症具有关联，结果发现类胰岛素生长因子1在其中具有重要作用。SOHOULI等[13]发现减肥手术能显著增加类胰岛素生长因子1的水平。Sabzikarian等[14]发现类胰岛素生长因子1与酒精性脂肪肝之间存在重要联系。CHEN等[15]发现类胰岛素生长因子1的水平与肌肉质量存在重要关联。因此探究类胰岛素生长因子1对老年小鼠的具体作用对治疗衰老相关疾病具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞生物学实验，多组数据之间的比较采用one-way ANOVA分析。
1.2 时间及地点实验于2024年2-3月在苏州大学苏州医学院骨科研究所内完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物此次研究使用SPF级3周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠3只，体质量约为80 g，购自上海必凯科翼生物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2023-0009。实验方案经苏州大学动物伦理委员会批准(批准号：SUDA20240307A02)。全程严格恪守国际兽医学编辑协会颁布的《动物伦理与福利作者指南共识》，并严格执行地方及国家的相关法律法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂 DMEM/F-12培养基(源培生物有限公司，上海)，胎牛血清(Clark Bioscience有限公司，美国)，胰蛋白酶、BCA检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)，链酶蛋白酶E(索莱宝科技有限公司，北京)，Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，美国)，彩色蛋白maker、青霉素-链霉素溶液(新赛美生物科技有限公司，苏州)，DPBS、GAPDH抗体(赛维尔生物科技有限公司，武汉)，Pth1r抗体(Santa Cruz公司，美国)，Sparc抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)，K19抗体(Abcam公司，英国)，总RNA提取试剂盒、HiScript II Q RTSuperMix、SYBR Green 预混荧光定量PCR试剂盒(诺维赞生物有限公司，南京)，HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG、阿尔新蓝(生工生物工程股份有限公司，上海)，番红(Sigma-Aldrich公司，美国)。
1.4 方法
1.4.1 椎间盘软骨终板、髓核与纤维环组织的分离所有操作工具提前高压灭菌2 h并干燥，然后放置在干净的工作台上并用紫外线照射30 min。所有手术均在无菌条件下使用体积分数75%乙醇和干净的工作台进行。所有步骤都必须在冰上于DPBS中进行，以最大限度地减少生物降解。SPF级大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)，待完全麻醉后脱颈处死，将大鼠尾部浸泡于体积分数75%乙醇中1 min。将尾取下后去除尽可能多的表皮和韧带，根据WILLIAMS等[19]的描述，暴露出白色的椎间盘组织(图1A)。将取得的鼠尾浸泡在冰上预冷的DPBS中。使用手术刀如图1B所示从纤维环与椎骨交界的软组织处垂直切入，将软骨终板与髓核/纤维环分离。使用手术刀刮除椎骨底部残余的纤维环和/或髓核组织，然后如图1C所示割取透明的白色微红软骨终板组织。然后如图1D所示，手术刀沿纤维环内壁旋转1周，取出近似透明果冻状的髓核组织。去除髓核组织后，如图1E所示分离余下的纤维环组织与椎骨，即可得到白色空心圆柱状纤维环组织，再继续用相同的方法取出椎间盘下端的软骨终板。单一大鼠尾可顺利分离约10个尾椎椎间盘。上述所有组织取出后，均于冰上放入装有DPBS的1.5 mL无菌离心管中(图1F)。

1.4.2 椎间盘软骨终板、髓核与纤维环组织的消化与培养所有溶液都是在无菌细胞培养环境中制备，并于4 ℃下储存。细胞培养试剂在使用前均在37 ℃下预热。将纤维环组织在冰上用眼科剪于DPBS中剪碎，髓核与软骨终板组织无需剪碎。分离的软骨终板、髓核、纤维环组织用DPBS洗涤3次，然后浸入无菌青霉素-链霉素溶液中3 min，然后用DPBS洗涤。根据DAI等[20]和BASATVA等[21]的文献，并在其基础上使用改进后的方法对各组织进行消化。对于髓核与纤维环，在1.5 mL离心管中，37 ℃下0.1%的链酶蛋白酶E(DMEM/F-12和1%的青霉素-链霉素溶液)预消化30 min，然后以1 000 r/min离心4 min去除上清。随后使用预热的含有用1%青霉素-链霉素溶液与0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM/F-12重悬组织/细胞混合物，将纤维环和髓核分别转移至10 cm培养皿与6 cm培养皿中，37 ℃下消化4 h来释放其中的细胞，期间经常摇晃吹打。软骨终板组织则直接在10 cm培养皿中通过1%青霉素-链霉素溶液与0.2%胶原酶Ⅱ消化4 h释放其中的细胞。通过以上消化方法可以分离得到约1.0×106个细胞。分离的软骨终板、髓核与纤维环细胞去除消化液后，在含有1%青霉素-链霉素溶液和体积分数20%胎牛血清的DMEM/F-12中培养[21]。三四天后细胞将逐渐贴壁，此时可以换成胎牛血清体积分数为15%的培养基，在37 ℃和体积分数5% CO2下培养。

1.4.3 椎间盘细胞的传代第0代髓核细胞需要从6 cm皿传至10 cm皿外，椎间盘细胞的传代通常是1∶3或者1∶4，传代后需要培养四五天才能达到相似的融合程度。具体操作如下：从细胞培养皿中取出培养基，用适量DPBS洗净残留培养基。去除所有DPBS后添加2 mL胰蛋白酶溶液，并于37 ℃的CO2培养箱中消化2-5 min。轻敲培养皿壁于底，使细胞脱落，并在倒置显微镜下观察细胞是否悬浮和/或变圆缩。确认消化完全后，向培养皿中加入3 mL培养基中止消化，并通过1 000 r/min的离心4 min去除上清。将沉淀重悬于适量含1%青霉素-链霉素溶液和体积分数15%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中并进行后续的传代或者铺板等操作。传代后可逐步将胎牛血清体积分数降至10%。为了确保实验结果的准确性和可靠性，此文建议使用传代次数不超过3代的细胞进行后续实验。因为随着传代次数的增加，细胞可能会发生遗传变异或功能改变，从而影响实验结果的可信度和可重复性[16]。
1.4.4 细胞总RNA的提取、反转录及实时定量荧光PCR 向6孔培养板中每孔接种传代后第1代(P1)原代细胞2.0×105个，当培养板中细胞生长至融合度约为90%时，将培养板置于冰面上，弃上清，DPBS洗涤并弃去DPBS。每孔加入1 mL TRIzol 试剂，以大枪头于冰上快速均匀研磨，后将所得液体转移至1.5 mL 离心管中。冰上静置5 min，加入200 μL 氯仿，充分剧烈摇晃15 s，冰上静置 5 min。4 ℃下，11 200 r/min离心15 min。将所得液体最上层水相移至另一新离心管中，加入 500 μL预冷的异丙醇，上下颠倒摇晃多次，4 ℃下11 200 r/min离心10 min。弃去上清，向离心管中加入用DEPC处理后的水配制的体积分数75%乙醇，4 ℃下11 200 r/min离心10 min。弃去上清，在通风橱中自然晾干，加入30 μL DEPC处理后的水充分溶解所得RNA。根据GONG等[22-23]

的方法并对其做出一定的改进，于RNA溶液浓度测定后，使用反转录试剂盒将1 000 ng RNA反转录得到相应的cDNA。使用qPCR SYBR Green Master Mix进行实时定量荧光PCR检测，反应前 95 ℃预变性 3 min，每个循环中 95 ℃变性10 s，60 ℃复性30 s，65 ℃延伸5 s。总计经历40个循环，经相应计算可得每个基因的扩增倍数。靶基因的表达量以18S为标准对照。引物序列见表1。

1.4.5 细胞蛋白提取及蛋白免疫印迹检测向6孔培养板中每孔接种传代后第1代原代细胞2.0×105个，当培养板中细胞生长至融合度约为90%时，将培养板置于冰面上，弃上清，DPBS洗涤。每孔加入适量RIPA，以200 μL枪头于冰上均匀研磨，后将所得液体转移至1.5 mL 离心管中。参考MA等[24-25]的方法完成后续的蛋白免疫印迹检测。冰上裂解样品蛋白20 min，然后按照说明书使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。按照测定的蛋白浓度稀释蛋白样品，加入5×上样缓冲液，混匀后金属浴100 ℃加热5 min使蛋白变性即得可用于蛋白免疫印迹分析的蛋白样品。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃一抗[GAPDH(1∶2 000，内参)、K19(1∶4 000)、Sparc(1∶1 000)与Pth1r(1∶200)]孵育过夜，翌日洗膜后孵育二抗[HRP标记山羊抗兔IgG(1∶3 000)、HRP标记山羊抗鼠IgG(1∶3 000)]1 h。洗净后，将膜带置于化学发光成像系统中，加入适量ECL发光液，扫描图像后用Image J软件对条带灰度值进行定量分析。

1.4.6 大鼠原代纤维环细胞与终板细胞微团的培养与染色前期按照细胞传代的方法完成对细胞的消化，得到单个细胞，通过吹匀、计数、离心，并使用DPBS重悬等操作得到细胞浓度为1.0×1010 L-1单细胞悬液。在6孔板中每孔加入30 μL细胞悬液，37 ℃和体积分数5%CO2下贴壁培养2 h，然后加入含1%青霉素-链霉素溶液和体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基。细胞培养7 d，培养基每2 d换一次。阿尔新蓝与番红染色的方法参考了JIANG等[26]的文献。于细胞培养结束后，用DPBS洗净残余培养基，使用40 g/L多聚甲醛处理30 min，从而将细胞固定于6孔板上，并于DPBS洗净多聚甲醛处后，在室温下向孔板中加入1 mL 1%阿尔新蓝或1%番红染料(确保染液完全没过微团)，静置30 min，使用DPBS洗净后完成染色，并于显微镜下观察并完成图像采集。
1.5 主要观察指标 ①大鼠尾椎椎间盘原代纤维环细胞、软骨终板细胞与髓核细胞形态以及特征基因表达水平；②原代纤维环细胞与软骨终板细胞的胞外基质表达情况。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示，多组数据之间的比较采用one-way ANOVA分析，显著差异度表现为P值，P < 0.05认为差异有显著性意义，使用GraphPad软件进行统计学分析及绘图。文章统计学方法已经苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

年龄与多种疾病的发病息息相关，包括2型糖尿病[16]、阿尔茨海默症[17]、抑郁症以及肥胖等[18-19]；同时，肥胖还会加速与年龄有关疾病的发展[20-21]。但是控制肥胖的常规疗法并不适用于老年人[22]，因此，现在迫切需要安全有效的抗肥胖疗法。实验室前期发现对老年小鼠注射青年脂肪干细胞能够显著降低老年小鼠体质量，并改善了相关指标[11]，因此为了更好地探究青年脂肪干细胞是如何发挥作用的，对其进行了转录组学的测序，并通过对GEO数据库肥胖人群脂肪组织的转录组学测序结果进行分析，发现了肥胖患者脂肪组织与老年脂肪干细胞低表达类胰岛素生长因子1；因此实验直接探究类胰岛素生长因子1对老年小鼠是否具有相似作用，为治疗年龄引起的相关疾病提供一定的思路。
在这项研究中，发现类胰岛素生长因子1是一种涉及组织修复的治疗方法，基于许多积极作用可以预防和逆转自然衰老引起的肥胖，这可能是延迟衰老和年龄相关疾病的潜在治疗方法。类胰岛素生长因子1已被用于治疗2型糖尿病和代谢综合征[23-24]，可以减轻炎症和促进组织修复[25-26]；也有报道称，类胰岛素生长因子1与衰老过程紧密联系[27]。为了探究类胰岛素生长因子1的具体作用，课题组在前期实验的基础上开展了此项研究。
先前的一项研究报道了脂肪量会随着年龄的增长而增加[28]。在此项研究中，选择了体质量相近的20月龄老年小鼠，实验结果发现，注射类胰岛素生长因子1蛋白会显著降低小鼠体质量，并改善了小鼠的胰岛素抵抗。值得注意的是，这些体质量减轻并不是由于喂养行为的变化而引起的，因为实验组与对照组的摄食量相似，是否由于注射类胰岛素生长因子1而减轻小鼠体质量有待进一步证实。之外，类胰岛素生长因子1还有许多其他有益效果，如减少全身炎症，其原因可能是由于类胰岛素生长因子1具有抗衰老的功能。
衰老过程的特征是慢性炎症[29]，类胰岛素生长因子1具有阻止细胞凋亡[30]、修复组织[26]、促进细胞增殖等功能[30]。类胰岛素生长因子1对老年小鼠促炎因子白细胞介素1β的表达具有显著的抑制作用。其他研究表明，类胰岛素生长因子1能改善机体炎症状况，并有效地改善机体的胰岛素抵抗[31-32]，这些与此次研究的结果一致。此次研究结果显示，类胰岛素生长因子1能降低老年小鼠的体质量，并改善老年小鼠的胰岛素抵抗。一些临床应用证明了类胰岛素生长因子1的安全性和可行性，无内毒素污染，无明显的有害基因组异常[33-34]。类胰岛素生长因子1与抗炎活性、葡萄糖稳态的相关性为类胰岛素生长因子1治疗衰老相关疾病的可能提供了证据。
肥胖和与年龄有关的疾病对全世界的健康有着深远的影响，人们越来越关注肥胖和衰老的治疗以及预防其并发症[35]。总的来说，此次研究结果表明类胰岛素生长因子1在治疗老年动物的肥胖和代谢综合征方面是有效的。尽管对小鼠腹部脂肪组织进行了qRT-PCR检测PI3K-AKT信号通路mRNA的表达情况，提示类胰岛素生长因子1可能是通过PI3K/AKT信号通路来对老年小鼠发挥相关作用的。但具体如何作用，过程如何？还需进一步实验证实，这也为未来探索指明了研究方向。探索类胰岛素生长因子1的特定功能将是未来治疗衰老及相关疾病的潜在方向。
综上所述，此项研究揭示了类胰岛素生长因子1在自然衰老小鼠中的抗肥胖作用。结果表明，类胰岛素生长因子1治疗对老年小鼠具有减轻体质量、抑制炎症反应、改善胰岛素抵抗的作用；此外，类胰岛素生长因子1还改善了老年小鼠肝脏脂肪堆积的情况；因此，类胰岛素生长因子1可能是老年人抗肥胖的有效治疗方法，也是延缓衰老和治疗年龄相关疾病的潜在靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

类胰岛素生长因子1对自然衰老小鼠的抗肥胖作用

Anti-obesity effect of insulin-like growth factor 1 in naturally aging mice

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