1.1 设计 随机分组对照动物实验,多组间比较采用单因素方差分析,两组间进行t检验。
1.2 时间及地点 实验于2021年9月至2022年6月在川北医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 共准备130只SD大鼠,6月龄,雄性,体质量220-270 g,SPF级,购自川北医学院,动物生产许可证号:SCXK(川)2018-18。大鼠置于25 ℃、50%相对湿度、自然光照下单笼饲养,在常温下无菌自由进食、饮水。按照《实验动物管理条例》规定进行实验。实验获得川北医学院伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂与设备 淫羊藿苷(纯度99%)购自购自赫澎生物上海科技有限公司;小动物超声影像仪购自北京益仁恒业科技有限公司;壳聚糖购自西安康诺化工有限公司;Ⅰ型鼠尾胶原蛋白购自北京索莱宝科技有限公司;β-甘油磷酸钠购自上海贤鼎生物科技有限公司;兔抗大鼠CD31、α-平滑肌肌动蛋白抗体购自杭州拓实生物科技有限公司;辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;激光共聚焦显微镜购自上海西努光学科技有限公司;扫描电镜购自北京中科科美科技股份有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 壳聚糖/胶原/淫羊藿苷复合水凝胶的制备 参照陈思宇等[8]研究中介绍的方法,具体步骤为:①称取200 mg的壳聚糖,置入10 mL的醋酸溶液(0.1 mol/L)中,搅拌至壳聚糖完全溶解,得到20 g/L的壳聚糖溶液,过滤去除不溶物后静置,置于4 ℃冰箱保存。②称取450 mg的β-甘油磷酸钠,投入1 mL去离子水中,得到450 g/L的β-甘油磷酸钠溶液,过滤后置于4 ℃冰箱保存。③冰浴下将2.5 mL的β-甘油磷酸钠溶液缓慢加入10 mL壳聚糖溶液,边滴加边搅拌(600 r/min),滴加完毕后继续搅拌2 h,使两种溶液充分混合均匀,调节pH值为7.35-7.45,得到壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液,置于4 ℃冰箱保存。④冰浴下将12.4 mL的壳聚糖/β-甘油磷酸钠溶液均匀加入到2 mLⅠ型鼠尾胶原蛋白溶液(1 g/L)中,其中壳聚糖与Ⅰ型鼠尾胶原蛋白的质量比为1∶1;同时称量一定量的淫羊藿苷,加入到混合溶液中,使淫羊藿苷的质量浓度分别为0.4,0.8,1.6 mg/mL,充分搅拌使溶液混合均匀,注入6孔板内,随后置于37 ℃细胞培养箱内,待溶液成胶后即得到壳聚糖/胶原/淫羊藿苷复合水凝胶,分别记为CS/COI/ICA0.4、CS/COI/ICA0.8、CS/COI/ICA1.6。同理,制备不含淫羊藿苷的壳聚糖/胶原复合水凝胶,记为CS/COI。真空冷冻后,扫描电镜下观察水凝胶微观形貌。
1.4.2 复合水凝胶的生物相容性
细胞增殖:将经过紫外线照射消毒的上述制备的4种水凝胶分别置于96孔板底,每孔150 μL,随后将大鼠心肌细胞(BESPC20169,上海博尔森生物科技有限公司)分别接种于96孔板内,细胞密度为1×104/孔,同时设置阴性对照,每组设置6复孔,置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中。培养1,3,5 d后,弃掉培养上清,每孔加入120 μL CCK-8工作液,37 ℃孵育1.5 h,每孔吸取100 μL反应液至酶标板内,使用酶标仪在450 nm处检测吸光度值。
细胞活性:将经过紫外线照射消毒的上述制备的4种水凝胶分别置于12孔板底,每孔400 μL,随后将大鼠心肌细胞分别接种于12孔板内,细胞密度为5×107/孔,置于体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中。培养5 d后,取出孔板,弃掉上清,以PBS洗涤3次,加入Live/Dead染色工作液37 ℃
避光孵育15 min,激光共聚焦显微镜下观察细胞存活。死细胞发出红色荧光,活细胞发出绿色荧光。
1.4.3 复合水凝胶的体外药物释放 取CS/COI/ICA0.4、CS/COI/ICA0.8、CS/COI/ICA1.6水凝胶,分别加入24孔板内,每孔加入1 mL PBS,置于37 ℃恒温培养箱中。于1,4,8,12,16,20,24,28,32 d,收集孔板内的PBS,同时补充新鲜的等量PBS,使用酶联免疫吸附试剂盒测定水凝胶中淫羊藿苷的累计释放量。
1.4.4 复合水凝胶的动物体内实验
复制心肌梗死模型:随机选取100只SD大鼠,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉,固定后将针电极插入四肢皮下以观测心电图,然后接入呼吸机。常规备皮消毒,于大鼠左侧胸部约3、4肋骨处剪开皮肤,暴露出3、4肋骨并剪断,用扩胸器暴露出心脏,结扎左冠状动脉前支,数秒后可见左心室前部心尖处颜色改变,这说明发生心肌缺血,观察一段时间后闭合胸腔,心电图监测6 h,待大鼠自主呼吸后拔出气管插管并缝合,术后切口用碘伏消毒,清除血迹,观察渗血情况。检测术后标准肢导联及胸前导联心电图,若ST段弓背抬高则视为建模成功,建模过程中大鼠死亡4只,其余全部建模成功。
实验分组处理:将造模成功的96只大鼠采用随机数字表法分为4组,分别为模型对照组、CS/COI/ICA0.4组、CS/COI/ICA0.8组、CS/COI/ICA1.6组,每组24只,同时选取造模外的24只大鼠作为正常对照。造模成功后10 min,模型对照组在梗死区域、梗死区周围及后壁区域3点注射PBS,其余3组在梗死区域、梗死区周围及后壁区域3点分别注射对应的水凝胶,注射总剂量为50 μL[9]。快速将心脏推回至胸腔中,最后缝合伤口。
心脏结构及功能检测:术后第28天,麻醉后仰卧位固定大鼠,利用超声心动测试仪检测心功能参数,主要包括心率、射血分数、短轴缩短率、每搏输出量、心输出量、左室收缩末期容积、左室舒张末期容积、左室前壁收缩末期厚度、左室前壁舒张末期厚度、左室后壁收缩末期厚度、左室后壁舒张末期厚度、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径等。均测量3个连续心动周期的平均值。
心肌组织学分析:心功能检测结束后,麻醉状态下轻柔地分离大鼠心脏,以生理盐水反复清洗,置入40 g/L多聚甲醛中固定48 h,体积分数75%乙醇脱水后石蜡包埋,连续切片,片厚5 μm,对切片分别进行Masson三色染色与CD31、α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色。将切片放入60 ℃烘片1 h,脱蜡至水,将切片置于枸橼酸修复液中进行抗原修复,冷却至室温;以PBS清洗2次,滴加体积分数3%H2O2溶液37 ℃孵育20 min;以PBS清洗2次,滴加封闭血清于标本上,置于湿盒中37 ℃封闭30 min;滴加一抗CD31(1∶500)、α-平滑肌肌动蛋白(1∶500)4 ℃孵育过夜;以PBS清洗3次,滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗体(1∶300),置于湿盒中37 ℃避光孵育1 h;以PBS清洗3次,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明、封固,显微镜下观察梗死部位血管新生情况。
RT-PCR检测成血管基因表达:取梗死部位心肌组织,加入组织裂解液进行匀浆处理,提取总RNA;将 1 μL RNA 溶液与99 μL DEPC水混合,以 DEPC水作空白对照,利用紫外分光光度计检测RNA浓度。将RNA反转录为cDNA,反应条件:25 ℃ 10 min,48 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min,将cDNA 产物置于-80 ℃冰箱内。进行实时荧光定量 PCR反应,反应条件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,共40个循环。设计引物,见表1。
1.5 主要观察指标 各组大鼠心脏结构及功能、心肌组织学及RT-PCR检测结果。
1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0软件对各组大鼠相关指标进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间进行t检验,描述采用x±s,P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经川北医学院附属医院生物统计学专家审核。