人天然型和诱导型CD4+CD25+FoxP3+CD127-Treg细胞表型多样性的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.015

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (2): 236-241.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.02.015

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人天然型和诱导型CD4+CD25+FoxP3+CD127-Treg细胞表型多样性的比较

王海灏¹，朱莉²，仰霈雯³，郭倩男¹

华中科技大学同济医学院附属同济医院，¹心脏大血管外科、同济医院心肺移植研究所；²血液内科，湖北省武汉市 430030，³华中科技大学同济医学院，湖北省武汉市 430030

收稿日期:2015-11-15 出版日期:2016-01-08 发布日期:2016-01-08
作者简介:王海灏，男，1979年生，上海市人，汉族，2012年德国海德堡大学毕业，博士，主治医师，主要从事器官移植、移植免疫、调节性T细胞相关研究。
基金资助:
教育部留学回国人员科研启动基金课题(教外司留(2014)1685号)；华中科技大学自主创新研究基金课题(2013QN203)

Phenotypic diversity of human nature and induced CD4+CD25+FoxP3+CD127- regulatory T cells

Wang Hai-hao¹, Zhu Li², Yang Pei-wen³, Guo Qian-nan¹

¹Cardiopulmonary Transplantation Institute of Tongji Hospital, Department of Cardiovascular Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China;²Department of Hematology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; ³Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Received:2015-11-15 Online:2016-01-08 Published:2016-01-08
About author:Wang Hai-hao, M.D., Attending physician, Cardiopulmonary Transplantation Institute of Tongji Hospital, Department of Cardiovascular Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry of China, No. (2014)1685; the Independent Innovation Research Fund of Huazhong University of Science and Technology, No. 2013QN203

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

调节性T细胞：调节性T细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，分为天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞，如Th3、Tr1，CD8 Treg、NKT细胞等，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。

细胞表型：细胞表型是细胞的表现形式。遗传后染色体自有重组会产生新的“基因型”，但不同的基因型不一定都有不同的表现，而生物体外在表现出来的就是所谓“表型”。比如隐形是a，显性是A，基因型Aa和AA表现出来的样子可以是一样的(完全显性状况下)，即为他们的表型相同。

背景：人调节性T细胞(Treg)分为天然型Treg(nTreg)和诱导型Treg(iTreg)。虽然CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-是目前最公认的Treg细胞表型，但是nTreg与iTreg的细胞表型多样性，尤其是其共表达细胞因子的情况仍不清楚。

目的：了解并比较nTreg与iTreg的细胞表型多样性，并通过分析其表达细胞因子的情况以推测可能的作用途径。

方法：从5例健康受试者的外周血中分离得到外周血单个核细胞，以8色流式细胞仪检测(FACSCanto II)并分析CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-nTreg的细胞表型和其共表达细胞因子的情况；将外周血单个核细胞在体外接受同种异体抗原刺激，进行混合淋巴细胞培养，9 d后以8色流式细胞仪检测并分析CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^- iTreg的细胞表型和其共表达细胞因子的情况。

结果与结论：CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-nTreg占全部CD4⁺ T细胞的比例为(1.5±0.70)%，且几乎所有的nTreg细胞均表达IFN-γ^-、IL-2^-或TGF-β⁺，部分表达IL-10^-和IL-10⁺；同种异体抗原刺激诱导产生表达IFN-γ⁺、IL-2^-、IL-2⁺、IL-10⁺或TGF-β⁺的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-iTreg；人nTreg的细胞表型主要是CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ^-IL-2^-IL-10⁺TGF-β⁺和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ^-IL-2^-IL-10^-TGF-β⁺，其占全部CD4⁺ T细胞的比例分别为(1.1±0.59)%和(0.39±0.16)%；iTreg的主要细胞表型为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ⁺IL-2^-IL-10⁺TGF-β⁺和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ⁺IL-2⁺IL-10⁺TGF-β⁺。结果说明，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-nTreg的特征是IFN-γ^-IL-2^-，同时产生白细胞介素10和转化生长因子β，或者只产生转化生长因子β而不产生白细胞介素10，且nTreg在体外通过混合淋巴细胞培养是不会被增殖的。混合淋巴细胞培养刺激后，IFN-γ⁺iTreg增殖明显，其中约1/3的IFN-γ⁺iTreg表达IL-2⁺，而2/3的IFN-γ⁺iTreg表达IL-2^-，且这两组IFN-γ⁺iTreg均同时分泌白细胞介素10和转化生长因子TGF-β。产生细胞因子转化生长因子β和白细胞介素10可能是CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^- Treg具有免疫抑制功能的原因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-9717-6461(王海灏)

关键词: 组织构建, 组织工程, 调节性T细胞, 细胞表型, 多样性, 细胞因子, 多色流式细胞仪

Abstract:

BACKGROUND: Regulatory T cells (Treg) are classified into two subsets, nature Treg (nTreg) and induced Treg (iTreg). Although there is consensus that CD4+CD25+FoxP3+CD127- is the widely accepted phenotype of Treg, it remains unclear what is the difference in phenotypes including cytokine patterns of nTreg and iTreg.
OBJECTIVE: To understand and compare the plasticity of nTreg and iTreg and to search the exact mechanism of cytokine secretion in Tregs.
METHODS: We investigated the frequency and cytokine pattern of CD4+CD25+FoxP3+CD127-nTreg in freshly separated peripheral blood mononuclear cells of five healthy individuals using 8-color fluorescence flow cytometry (FACSCanto II). Subsequently, after 9 days of allostimulation in mixed lymphocytes, the frequency and cytokine pattern of CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg were determined and analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: In fresh cells, (1.5±0.70)% of CD4+ T cells were CD4+CD25+FoxP3+CD127- nTregs. Almost all these cells expressed interferon (IFN)-γ-, interleukin (IL)-2- or transforming growth factor-β+, and partial cells expressed IL-10+ or IL-10-. After 9-day allostimulation, the number of CD4+CD25+FoxP3+CD127- iTreg expressing IFN-γ+, IL-2-, IL-2+, IL-10+ or TGF-β+ increased strongly. The main subsets of human nTregs were CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ-IL-2-IL-10+TGF-β+ and CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ-IL-2-IL-10- TGF-β+ T cells. The proportion of each subset in CD4+ T cells was (1.1±0.59)% and (0.39±0.16)%, respectively. Whereas the main subsets of human iTregs were CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ+IL-2-IL-10+TGF-β+ and CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ+IL-2+IL-10+TGF-β+. Human nTregs were characterized as IFN-γ-IL-2- double negative, producing IL-10 and TGF-β or only TGF-β without IL-10, and not proliferating in vitro. During the allostimulation in mixed lymphocytes, IFN-γ+ iTregs proliferated remarkably. One-third of IFN-γ+ iTreg expressed IL-2+, and two-thirds of IFN-γ+ iTregs expressed IL-2, both of which produce IL-2 and TGF-β. Our results imply that CD4+CD25+FoxP3+CD127- Treg are potentially immunosuppressive probably because of their mandatory TGF-β and optional IL-10 production.

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王海灏，朱莉，仰霈雯，郭倩男. 人天然型和诱导型CD4+CD25+FoxP3+CD127-Treg细胞表型多样性的比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(2): 236-241.

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图/表（结果） 4

2.1 人nTreg细胞表型多样性分析从外周血中分离得到外周血单个核细胞后，检测发现，细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+CD127-的nTreg占全部CD4+T细胞的比例为(1.50±0.70)%，且几乎所有的细胞均表达IFN-γ-、IL-2-或TGF-β+，而不表达IFN-γ+、IL-2+或TGF-β-；在这些nTreg中，74%的nTreg细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+ CD127-IL-10+[ (占全部CD4+T细胞的(1.1±0.63)%]，26%的为CD4+CD25+FoxP3+CD127-IL-10-[占全部CD4+T细胞的(0.39±0.16)%，图1]。

2.2 同种异体抗原刺激后，人iTreg细胞表型多样性分析同种异体抗原刺激9 d后，检测混合淋巴细胞培养中iTreg的细胞表型，与未接受抗原刺激的nTreg相比较，可以发现，CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ+iTreg细胞数量明显升高(P < 0.01)；同样的升高趋势在表达IL-2-、IL-2+、IL-10+或TGF-β+的iTreg上同样可以观察到(均P < 0.01)，表明同种异体抗原可以诱导这些细胞表型的iTreg产生。同时，细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ-、CD4+CD25+ FoxP3+CD127-IL-10-或CD4+CD25+FoxP3+CD127-TGF-β-的iTreg细胞数量并无明显变化(vsnTreg: 均p=n.s.，图2)，表明这些Treg细胞亚群在经过同种异体抗原刺激后不能诱导产生。

2.3 多色流式细胞仪分析人nTreg细胞表型多色流式细胞仪结果发现，几乎所有的nTreg细胞，在同一个细胞上既不表达干扰素γ，也不表达白细胞介素2，但表达转化生长因子β，部分表达白细胞介素10。仅有(0.02±0.05)%CD4+细胞细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ+IL-2+和CD4+CD25+ FoxP3+CD127-IFN-γ+IL-2-，且这两个nTreg亚群全都同时表达IL-10和TGF-β。同时，CD4+CD25+ FoxP3+ CD127-IFN-γ-IL-2-IL-10+TGF-β+nTreg和CD4+CD25+Fox P3+ CD127-IFN-γ-IL-2-IL-10-TGF-β+ nTreg占全部CD4+T细胞的比例分别为(1.10±0.59)%和(0.39±0.16)%，表明nTreg的细胞表型主要是这二者(图3)。

2.4 同种异体抗原刺激9 d后人iTreg的细胞表型同种异体抗原刺激后，可以观察到细胞表型为CD4+CD25+Fox P3+CD127-的iTreg占全部CD4+T细胞的比例从受刺激前(1.50±0.70)%上升到(2.6±1.2)%(与nTreg比P < 0.01)。有意思的是，和nTreg相比，增加的部分全部为IFN-γ+的细胞，而细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+ CD127- IFN-γ-IL-2-的Treg细胞比例并不增加，而且CD4+ CD25+FoxP3+CD127- IFN-γ-IL-2- Treg细胞无论是否表达白细胞介素10和/或转化生长因子β，与nTreg相比均无明显变化(图4)。在nTreg和iTreg中，均没有任何细胞的细胞表型为CD4+CD25+ FoxP3+ CD127- IFN-γ-IL-2+，表明外周血中并不存在这种细胞，且这种细胞表型不会被同种异体抗原所诱导产生。在刺激后，细胞表型为CD4+CD25+FoxP3+CD127- IFN-γ+ IL-2-IL-10+TGF-β+和CD4+CD25+FoxP3+CD127-IFN-γ+ IL-2+ IL-10+ TGF-β+的iTreg增加最为明显(与nTreg比，均P < 0.01)，说明iTreg的主要细胞表型就是这二者；而除了共表达IL-10+TGF-β+之外的其他IFN-γ+IL-2-或IFN-γ+ IL-2+iTreg亚群均无明显变化(均p=n.s.)。

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引言

近半个世纪以来，伴随着临床器官移植学的进步，免疫学也取得了长足的发展，其中对于调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的认识和研究更是为免疫学开拓了一片广阔的新领域。这类具有免疫抑制功能作用的特殊的T细胞亚群在诱导移植免疫耐受、自身免疫性疾病以及抗肿瘤治疗等方面均有多项报道^[1-5]。目前已知，Treg分为天然型Treg(natural Treg，nTreg)和诱导型Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg来源于胸腺，经过阴性选择和阳性选择后产生，对维持人体自身免疫稳态发挥重要作用；而iTreg来自于外周血和外周淋巴组织，由原始T细胞经自体或异体抗原刺激而产生，在诱导移植免疫耐受中发挥着重要作用^[6-8]。然而，由于nTreg和iTreg是根据其细胞来源、细胞功能特性而定义的，其细胞表型却始终存有争议。

1995年，Sakaguchi研究组率先报道了表达CD25的CD4⁺T细胞亚群具有免疫抑制功能^[9]，CD4⁺CD25⁺在很长一段时间内被认为是Treg的细胞表型。但是后继研究发现，部分活化的T细胞也表达CD25，而只有那些高表达CD25(CD25high)的CD4⁺T细胞才能在体外发挥免疫抑制功能^[10]。2003年，Sakaguchi研究组发现并报道叉头状转录因子(forkhead transcription factor， FoxP3)与Treg的发育和功能密切相关^[8^，^11]。以小鼠为实验对象的动物实验表明，FoxP3只表达于Treg，而不在静息的CD4⁺CD25^-细胞或Th1、Th2细胞内表达^[11-12]。FoxP3基因的突变或缺失可以引起严重的自身免疫性疾病，在小鼠可以观察到皮屑病，在人类则会发生IPEX综合征(immune dysregulation， polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked)^[13-15]。在多数文献报道中，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺被视为经典的Treg细胞表型。近年来，Treg的另一个细胞标志物CD127^-被发现和报道，CD127的表达与FoxP3呈明显的负相关，Treg不表达或弱表达CD127^[16]。所以，CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-是目前最公认的Treg细胞表型。

nTreg和iTreg都具有免疫抑制功能，而且它们的作用机制都是依赖细胞-细胞直接接触和分泌细胞因子两种途径，细胞-细胞直接接触途径中也有细胞因子的作用^[17-18]；因此，表达白细胞介素10(Interleukin-10，IL-10)和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)以及不表达白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)也被多次用作非特异性Treg细胞标志物^[1^，^18-19]。近年来，表达干扰素γ (interforn-γ，IFN-γ)的Treg被发现与肾移植术后患者移植肾功能长期存活密切相关^[20]；研究表明，CD4⁺CD25⁺Fox P3⁺IFN-γ⁺ iTreg的免疫抑制功能是IFN-γ依赖性的^[21]，这种表达白细胞介素γ的iTreg被称为类Th1的Treg(Th1-like Treg)。虽然有很多的研究已经表明了分泌细胞因子在Treg中的重要作用，但是这些细胞因子在nTreg和iTreg中是否有着同样的表达、这些细胞因子的表达是在同一个细胞内还是各自有不同的细胞进行表达，这些问题却始终存在争议。本研究利用多色流式细胞仪，从健康受试者的外周血中分离得到外周血单个核细胞后进行检测，以获得人nTreg的细胞表型；对外周血单个核细胞进行混合淋巴培养以诱导产生人iTreg，检测获得iTreg的细胞表型，并比较其与nTreg的异同及其多样性变化。

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材料方法

1.1 设计分组对比观察。

1.2 时间及地点实验于2014年4至12月在武汉完成。

1.3 材料外周血单个核细胞取自取5名健康受试者。实验实施前已经获得本单位伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的精神。所有健康受试者均被详细告知本实验的过程和目的，并签署知情同意书。

试剂及仪器：APC-Cy7-mouse-IgG1、PerCP-Cy5.5- mouse-IgG1、PE-Cy-mouse-IgG1、Perm2溶液(BD公司)；DPBS(Invitrogen Gibco公司)；多色流式细胞仪(BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组实验分为2组：①nTreg组：分离出外周血单个核细胞后马上染色检测。②iTreg组：外周血单个核细胞与接受放射灭活后的同种异体外周血单个核细胞培养9 d后检测。

1.4.2 细胞制备和培养用Ficoll梯度离心法从外周血 (50 mL)中提取外周血单个核细胞。用含体积分数10%胎牛血清(FCS-500)的RPMI-1640将试管中外周血单个核细胞的浓度调整为1×10⁹ L^-1。nTreg组的外周血单个核细胞马上染色并上机检测。取分离得的外周血单个核细胞作为反应细胞，选择另一个HLA抗原相异的健康受试者，分离其外周血单个核细胞作为刺激细胞，以放射线照射的方式 (30 Gy放射量照射20 min)破坏其免疫原性，保留抗原性。以1∶1的比例，将反应细胞的外周血单个核细胞与刺激细胞的外周血单个核细胞进行混合淋巴细胞培养，置于CO₂培养箱中培养9 d。

1.4.3 流式细胞计数检测前准备每组均备有Isotype control和Treg两支试管。将外周血单个核细胞移入准备好的试管，1 300 r/min转速离心8 min，弃上清。在Isotype control试管中加入5 μL APC-Cy7-mouse-IgG1、5 μL PerCP-Cy5.5-mouse-IgG1和5 μL PE-Cy-mouse-IgG1作为细胞表面标志物的Isotype control；依实验计划，在Treg试管中加入细胞表面抗体CD4(APC-Cy，5 μL，BD)、CD25 (PerCP-Cy5.5，5 μL，BD)和CD127(PE-Cy7，5 μL，BD)，振荡后室温下避光培养15 min，加入2 mL缓冲液(DPBS)，洗细胞(1 300 r/min转速离心8 min，弃上清)。加入500 μL Perm2溶液作细胞透膜处理，振荡后室温下避光培养10 min。再加入2 mL DPBS洗细胞。加入胞内抗体，在Isotype control管中加入5 μL V450-mouse-IgG1(BD)、5 μL V500-mouse-IgG1(BD)、20 μL FITC-mouse-IgG1(BD)、10 μL PE-mouse-IgG1(R&D)和10 μL APC-mouse-IgG1 (R&D)；在Treg试管中加入FoxP3(V450，5 μL，BD)、干扰素γ(V500，5 μL，BD)、白细胞介素2(FITC，20 μL， BD)、白细胞介素10(PE，10 μL，R&D)和转化生长因子β(APC，10 μL，R&D)。振荡后室温下避光培养30 min，加入2 mL DPBS洗细胞；再加入2 mL DPBS，继续培养30 min，洗细胞。以多色流式细胞仪检测。

1.4.4 流式检测的设门策略每支试管有至少100，000 信号被记录和分析。首先根据前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)设门选择淋巴细胞群，然后再根据不同的实验目的进行再次设门，如选择CD4⁺CD25⁺ PBL等。阳性细胞选择标准为其在Isotype control中的比例< 1%。

1.5 主要观察指标 ①以8色流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-nTreg的细胞表型和其共表达细胞因子的情况。②以8色流式细胞仪检测并分析CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-iTreg的细胞表型和其共表达细胞因子的情况。

1.6 统计学分析所有实验数据用x(_)±s的形式表达，用PASW Statistics 18.0 (IBM，Chicago，Illinois，USA)统计软件进行方差分析，以P < 0.01为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

Treg被发现之后，关于Treg细胞表型多样性的研究一直方兴未艾，在各种文献报道中，不同的细胞表型被用来代表Treg，尤其是对nTreg和iTreg，由于目前研究的局限，往往认为，二者具有相似的作用机制，所以也具有相同的细胞表型。这在一定程度上混淆了对于nTreg和iTreg的认识。在以前的研究中，作者曾经利用多克隆刺激诱导产生人iTreg，并利用四色流式细胞仪对人nTreg和iTreg的细胞表型进行研究。研究发现，多克隆刺激后，表达IFN-γ⁺、IL-2^-、IL-10⁺或TGF-β⁺的人CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ iTreg数量明显升高^[22]；然而，由于受到流式细胞仪FACSCalibur仅有4种荧光色的限制，无法验证这些产生细胞因子的iTreg是否在同一个细胞内表达，其共表达对于iTreg的细胞表型和作用机制又有何意义。

本实验利用多色流式细胞仪FACSCanto II的优势，对人nTreg细胞表型进行分析的同时，研究在同一个细胞内共表达这些细胞因子的情况；同时，实验利用同种异体抗原刺激诱导产生iTreg，研究其与nTreg的异同。与多克隆刺激相比，同种异体抗原刺激更接近于人体内(in-vivo)的实际免疫状态，实验结果也更值得关注。BD公司的新型流式细胞仪FACSCanto II拥有3种固态激光，即波长为405 nm的紫色激光、波长为488 nm的蓝色激光和波长为640 nm的红色激光，可以同时检测8种荧光参数，检测结果比仅有一两种激光的流式细胞仪敏感性和精确度更高^[23]，是目前最新的流式细胞仪之一。

实验结果显示，虽然CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^–被公认为nTreg和iTreg的细胞表型及其特异性细胞标志物，但nTreg和iTreg的非特异性细胞标志物却明显不同。nTreg的主要细胞表型为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ^-IL-2^-IL-10⁺TGF-β⁺和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ^-IL-2^-IL-10^-TGF-β⁺，而有意思的是，这两个Treg亚群的细胞数量在经过同种异体抗原刺激后，并没有明显变化，这也可以证明iTreg的来源并不是由nTreg受刺激而诱导产生；经过同种异体抗原刺激后iTreg的主要细胞表型CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ⁺IL-2^-IL-10⁺TGF-β⁺和CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺CD127^-IFN-γ⁺IL-2⁺IL-10⁺TGF-β⁺，这一方面说明IFN-γ在iTreg诱导过程中发挥了重要作用，同时从nTreg几乎不表达白细胞介素2到iTreg部分表达白细胞介素2的变化中也可说明，在iTreg诱导产生过程中可能存在有白细胞介素2的自分泌现象。而类似的结果，在多克隆刺激中也同样观察到，这也是Treg细胞表型多样性变化的一个表现。

近年来，对IFN-γ⁺iTreg的研究和报道日趋增多。在iTreg所产生的细胞因子或分子中，干扰素γ是一类比较特殊的细胞因子。虽然几乎所有的淋巴细胞都可以产生干扰素α或者干扰素β，但是只有活化的T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和自然杀伤T细胞(NKT细胞)才能产生干扰素γ^[24]。以前，干扰素γ被认为是1型辅助性T细胞(Th1细胞)的标志性细胞因子，但是后来又发现Treg和CD8⁺ T细胞同样可以产生干扰素γ，且干扰素γ在抗炎症、抗肿瘤和免疫调节方面发挥着重要的作用^[22]，这也是IFN-γ⁺iTreg被称作Th1-like iTreg的原因。德国Daniel研究组(作者作为主要研究者参与其中)陆续报道，表达干扰素γ的CD4⁺ iTreg和肾移植后患者移植肾功能长期存活密切相关。在对肾移植术后患者的长期随访监测中发现，与移植肾功能受损的患者相比，移植物功能良好的患者体内表达干扰素γ的CD4⁺Treg(CD3⁺CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺IFN-γ⁺)数量明显升高，提示干扰素γ也许在诱导人移植物免疫耐受中发挥着重要的作用^[20]，同时研究认为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺IFN-γ⁺ iTreg的免疫抑制功能是干扰素γ依赖性的，是抗原非特异性的免疫抑制^[21^，^25]。本实验中发现，虽然同种异体抗原刺激后可以诱导产生IFN-γ⁺iTreg，但是并不所有的IFN-γ⁺iTreg数量都会增加，作者发现，只有同时表达IL-10⁺和TGF-β⁺的IFN-γ⁺iTreg数量才会增加，而这些都是以前用四色流式细胞仪所观察不到的。前期的实验报道中，作者通过在混合淋巴细胞培养中添加单克隆抗体已经证实，CD178、CD152、CD279、CD95和CD28对于IFN-γ⁺iTreg的诱导产生和功能有重要作用^[26]，本实验则进一步表明了，分泌细胞因子干扰素10和转化生长因子β对于诱导IFN-γ⁺iTreg也发挥着重要作用。另一个有趣的结果是关于干扰素γ和白细胞介素2的关系，在对nTreg和iTreg的比较中，作者发现，虽然IFN-γ^-IL-2^- PBL在nTreg和iTreg都有表达，但并没有明显差别，另一方面，IFN-γ^-IL-2⁺ PBL在nTreg和iTreg都没有检测到，说明并不存在IFN-γ^-IL-2⁺Treg，这也许表明白细胞介素2的产生需要依赖干扰素γ。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人天然型和诱导型CD4+CD25+FoxP3+CD127-Treg细胞表型多样性的比较

Phenotypic diversity of human nature and induced CD4+CD25+FoxP3+CD127- regulatory T cells

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