灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.015

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3198-3201.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.015

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灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长

李俊彦¹，王东艳²，杨金伟³，赵楠¹，李力燕²，程敬茹²，茹金²，郭建辉³，刘俊¹

1昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650031；2昆明医科大学神经科学研究所，云南省昆明市 650500；3云南省第一人民医院普外二科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2014-04-08 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 郭建辉，主任医师，教授，云南省第一人民医院普外二科，云南省昆明市 650032 通讯作者：刘俊，副主任医师，昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650031
作者简介:李俊彦，男，1964年生，云南省昆明市人，1989年昆明医学院毕业，副主任医师，主要从事神经外科的基础与临床工作及神经损伤机制的研究。并列第一作者：王东艳，女，1989年生，河南省商丘市人，汉族，2012年西南大学毕业，主要从事神经生物学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81260075，31260253)；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项 (2012FB002，2012FB092)；云南省肿瘤转化医学工程技术研究中心(2011DH011)

Effect of Breviscapine on the survival and growth of rat cortical neurons cultured in vitro

Li Jun-yan¹, Wang Dong-yan², Yang Jin-wei³, Zhao Nan¹, Li Li-yan², Cheng Jing-ru², Ru Jin², Guo Jian-hui³, Liu Jun¹

1Department of Neurosurgery, First People’s Hospital of Kunming City, Kunming 650031, Yunnan Province, China; 2Institute of Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 3Second Department of General Surgery, First People’s Hospital of Kunming City, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2014-04-08 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Guo Jian-hui, Chief physician, Professor, Second Department of General Surgery, First First People’s Hospital of Kunming City, Kunming 650032, Yunnan Province, China Corresponding author: Liu Jun, Associate chief physician, Department of Neurosurgery, First People’s Hospital of Kunming City, Kunming 650031, Yunnan Province, China
About author:Li Jun-yan, Associate chief physician, Department of Neurosurgery, First People’s Hospital of Kunming City, Kunming 650031, Yunnan Province, China Wang Dong-yan, Institute of Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China Li Jun-yan and Wang Dong-yan contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260075, 31260253; Applied Basic Research Jointly by Yunnan Provincial Science and Technology Bureau-Kunming Medical University, No. 2012FB002, 2012FB092; Medical Engineering Technology Research Center for Tumor Transformation of Yunnan Province, No. 2011DH011

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经生长因子在维持中枢神经系统神经细胞的存活、分化，促进其生长、发育，维持其功能方面具有不可替代的作用。
目的：观察灯盏花素对SD大鼠大脑皮质体外培养神经元生长的影响，并初步探讨其机制。
方法：取新生SD大鼠胚胎，取其大脑皮质后，对神经元进行原代培养，随机分为3组，其中灯盏花素组加入10 g/L灯盏花素，对照组加入等量生理盐水，正常组不作任何处理，各组又分为24 h、48 h亚组。对24孔板中各组细胞各时间点采集图像，之后采用RT-PCR技术检测神经生长因子、酪氨酸激酶A mRNA的表达变化。对96孔板中各组细胞不同时间点采用MTT检测神经元生长活力。
结果与结论：正常组和对照组在各时间点细胞数、胞体面积、突起长度及细胞活力无明显差异(P > 0.05)，但正常组及对照组均有随时间点延长，3个指标均上调(P < 0.05)，灯盏花素组细胞数、胞体面积、突起长度及细胞活力均较正常组及对照组升高(P < 0.05)。神经生长因子及TrkA mRNA的表达在正常组和对照组在各时间点无明显差异(P > 0.05)，灯盏花素组各时间点较正常组和对照组上调(P < 0.05)。提示灯盏花素促进SD大鼠脑源性神经元的存活、生长，其机制可能是通过上调神经生长因子及其受体TrkA的表达发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 灯盏花素, 神经元, 神经生长因子, 酪氨酸激酶, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Nerve growth factor plays an irreplaceable role on the survival, differentiation and maintenance of the central nervous system cells, also promote the growth and development of these cells.
OBJECTIVE: To explore effect of Breviscapine on the growth of in vitro cultured neurons in cerebral cortex of Sprague-Dawley rats, and preliminarily investigate the action mechanism.
METHODS: The cerebral cortex of newborn Sprague-Dawley rat embryos was collected, the neurons were primary cultured and randomly divided into three groups: normal control group (no treatment), control group (neurons were cultured with normal saline), Breviscapine group (neurons were cultured with 10 g/L Breviscapine). Furthermore each group was assigned into 24-hour and 48-hour subgroups. Images were captured from the 24-well plates at each time points. RT-PCR was applied to examine the expression of nerve growth factor and TrkA mRNA. MTT was used to detect the neuronal growth at each time point.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no difference between normal control group and control group in the cell counts, cell body area, neurite length and viability (P > 0.05), as the time prolonged, all data were raised in the
two groups (P < 0.05). Breviscapine group showed a higher cell count, cell body area, neurite length and viability than normal control group and control group (P < 0.05). No significant difference was found in the expression of nerve growth factor and TrkA mRNA between normal control group and control group (P > 0.05). At each time point, these data in Breviscapine group were increased compared with normal control group and control group (P < 0.05). Breviscapine can promote the survival and growth of brain-derived neurons in Sprague-Dawley rats, and the mechanism might depend on the up-regulating expression of nerve growth factor and its receptor TrkA.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: drugs, Chinese herbal, nerve growth factor, receptor, TrkA

中图分类号:

R318

李俊彦，王东艳，杨金伟，赵楠，李力燕，程敬茹，茹金，郭建辉，刘俊. 灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3198-3201.

Li Jun-yan, Wang Dong-yan, Yang Jin-wei, Zhao Nan, Li Li-yan, Cheng Jing-ru, Ru Jin, Guo Jian-hui, Liu Jun. Effect of Breviscapine on the survival and growth of rat cortical neurons cultured in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3198-3201.

图/表（结果） 2

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引言

创伤性脑损伤是一类病死率较高的外伤性疾病，占急性颅脑损伤的13%-21%，死亡率及残疾率很高，达26%-50%^[1]，特别在中国，每年约有60万人遭受创伤性脑损伤，死亡近17%^[2-3]。灯盏花素是从抗心脑血管疾病作用的植物灯盏细辛中提取出来的，含灯盏花甲素和灯盏花乙素两种成分^[4]。神经生长因子是最早发现的靶源性神经营养因子^[5]，在中枢神经系统和周围组织中普遍存在，具有维持神经元存活及促进其分化、促进神经突起生长等作用^[6]。

灯盏花素作为云南特有山地中药材灯盏细辛的提取物，具有活血化瘀、通经活络、祛风除湿、消炎止痛等功效，现临床上主要用于缺血性心脑血管病的治疗，近年来也用于老年性痴呆、糖尿病、肝硬化、眩晕症、肺心病、肾衰、视网膜静脉阻塞等疾病的治疗，效果良好^[7]。国内不少研究证实，灯盏花素可直接抑制缺血-再灌注时蛋白激酶C激活引起的细胞内钙超载，抑制钙内流、血管收缩、细胞骨架成分降解，从而减少神经元的缺血性损伤，提高脑组织超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶、谷光甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的活性，减轻脑组织的脂质过氧化反应，抑制脑消肿的形成^[8]；降低血液黏滞度，抑制血小板聚集，从而减轻脑血管微循环障碍，改善脑组织灌注量，具有缺血后抗神经元凋亡作用^[9]。王小珊等^[10]通过灯盏花素治疗实验性缺血-再灌注鼠脑损伤的磁共振扩散加权象动态观察发现，缺血再灌注后灯盏花素能明显减小高信号区的体积，具胡明显的缺血后脑保护作用。

灯盏花具有改善微循环，增加脑血流量，提高血脑屏障通透性；改善血液流变学，降低全血黏度，抗血小板聚集作用显著；促纤溶活性，降低血纤维蛋白原，防栓溶栓；防治神经细胞内钙超载和胞外兴奋性氨基酸堆积；抑制蛋白激酶C位移激活或过度激活；减轻脑水肿，延缓缺血性脑细胞死亡；增加营养性脑血流量，改善脑微循环；有一定的降血脂作用^[11]。

研究发现，灯盏花素能抑制大鼠脑缺血后脑组织的细胞间黏附分子Ⅰ的表达^[12]，减轻脑缺血再灌注后脑组织中性粒细胞的浸润^[13]，还有研究发现，灯盏花素可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后c-Fos蛋白和Caspase-3蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白的表达^[14]。灯盏花素很可能通过上调Akt蛋白的表达改善脑缺血再灌注损伤^[15]。卢晓梅等^[16]发现灯盏花素可以使脑组织伊文思蓝(EB)及水含量减少，使血脑屏障损伤程度有所减轻，同时，伴随脑组织内髓过氧化物酶活性下降，炎症反应减弱。灯盏花素可以减轻缺血再灌注大鼠心肌梗死面积，其机制可能与减少大鼠心肌的Caspase-9蛋白及mRNA表达有关^[17-18]。有研究发现脑缺血可以引起神经元的凋亡^[19]，脑再灌流以后，伴随着再灌流的进行，凋亡神经元不断地增加，采用灯盏花素进行干预对脑缺血/再灌流导致的神经元凋亡有防治作用。最近研究显示，灯盏花素可治疗糖尿病周围神经病变^[20]，并可促进脑缺血后神经的康复^[21]。

实验拟通过体外原代培养SD大鼠大脑皮质神经元，采用灯盏花素进行干预，同时调查神经生长因子及其受体TrkA的变化及变化，希望对临床治疗脑神经损伤疾病提供进一步的理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年1至5月在昆明医科大学神经科学研究所完成。

材料：

实验动物：怀孕SD大鼠15只，SPF级，购自昆明医科大学动物科，许可证号：SCXK(滇)2009-0004。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

细胞培养及其分组：取怀孕SD大鼠胚胎大脑皮质，放入D12中离心，弃上清，加500 μL木瓜蛋白酶和500 μL DNA酶，消化15 min，胎牛血清终止，离心5 min。滤网过滤收集液，离心弃上清。调整细胞浓度为0.5×10⁷ L^-¹，放入包被好的培养板中(24孔板及96孔板)，37 ℃，体积分数5%CO₂培养，改加B27无血清培养液(含98% Neurobasal+ 2% B27+0.5 mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 U/L青、链霉素)。

将培养细胞随机分为正常组、对照组、灯盏花素组，其中灯盏花素组加入10 g/L灯盏花素，对照组加入等量生理盐水，正常组不作任何处理，各组又分为24 h、48 h亚组。

灯盏花素对大鼠神经元的影响实验所需试剂：
试剂	来源
注射用灯盏花素(批号：20121105)	湖南恒生制药有限公司
MTT(货号：11684817910)	Roche
琼脂糖	Sigma公司
RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit、PCR Master Mix Kit(货号：K1621)	Fermentas 公司
TRIZOL	美国MRC(Molecular Reseach Center)公司
一抗(Map2和Tujl 1∶1 000)	Santa cruz
二抗(Ra488 1∶1 000；MoCy3 1∶500)	Jackson
体积分数5%驴血清	上海亿欣生物科技有限公司
引物序列	由大连宝生物公司合成

免疫细胞荧光化学染色：40 g/L多聚甲醛固定细胞， 0.01 mol/L PBS漂洗3次，10 min/次，体积分数5%驴血清封闭液封闭，室温1 h，吸走封闭液(不用PBS漂洗)，加入一抗(Map2和Tujl 1∶1 000)，对照组加等量PBS，4 ℃冰箱过夜，吸出一抗，1×PBST漂洗3次，10 min/次，加入相应的二抗(Ra488 1∶1 000；MoCy3 1∶500)和DAPI，室温、避光静置2 h，1×PBST漂洗3次，10 min/次，Mounting medium封固，Nail pulish封边，LEICA共聚焦显微镜采集图像。

神经元生长情况观察：从每组中随机抽取5孔，在Leica倒置显微镜成像系统20倍镜下采集神经元的图片，每孔采集左上、右上、中、左下、右下方5个视野。计数每个视野中神经元数目。Leica LAS AF Lite软件测量每个视野神经元胞体面积、神经元突起长度。

MTT法检测神经元生长活力：96孔板每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L，用生理盐水稀释)，继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲两三遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，准备溶解结晶。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(神经元、灯盏花素、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

RT-PCR扩增目的基因：去除培养液，将1 mL预冷的TRIZOL(Molecular Research Center，INC)加入培养孔中，用细胞刮反复刮取，收集TRIZOL。RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Company)试剂盒对总RNA进行反转录反应。PCR Master Mix Kit(Fermentas Company)试剂盒对cDNA模板进行PCR反应。PCR反应条件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s，退火1 min，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 15 min。1%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像系统成像。GeneTools电泳图像软件作半定量分析(β-actin为内参)。本实验一共独立进行3次，每次实验重复检测3次。

主要观察指标：①神经元的鉴定及生长情况观察结果。②神经元生长活力。③神经生长因子及TrkA基因的表达。

引物序列：
基因	序列
神经生长因子	SENCE　5’-TCT CCG TCC TAT GTT GCG-3’， ANTI-SENCE 5’-GGC TGG TGC TGT CTT TGC-3’，退火温度54 ℃，314 bp
TrkA	SENCE　5’-GAA CAA GCT CAA ATG GAA CCT-3’， ANTI-SENCE 5’-GAA CTT CAC ATC TGT GGC ACA-3’，退火温度58 ℃，449 bp
β-actin	SENCE 5’-AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3’， ANTI-SENCE　5’-CTG GAA GGT GGA CAG TGA G-3’，退火温度53 ℃，523 bp

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包对所测得结果行统计学检测，组间采用t 检验，组内采用单因素方差分析。结果以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

灯盏花素是从菊科植物短亭飞蓬的干燥全草-灯盏花中提取的黄酮类有效成分，主要成分是灯盏乙素和少量灯盏甲素，具有广泛的药理活性，如增加血流量、改善微循环、扩张血管、降低血黏度、调节血脂、抗血栓等作用^[22-23]。Bre中含有还原性酚羟基，可直接清除羟氧自由基、过氧自由基和淬来单线态氧，抑制脂质过氧化而达到抗氧化的作用^[24]。张新战等^[25]通过实验研究发现Bre能通过提高超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛和一氧化氮的含量，清除氧自由基治疗脑缺血再灌注损伤大鼠。自20世纪70年代末首次分离得到以来已被制成各种剂型，广泛用于心、脑血管疾病的治疗，取得了较好的临床疗效^[26-27]。
有人采用胶原酶和肝素混合液注入大鼠尾壳核建立脑出血模型，探讨灯盏花素注射液对大鼠出血性脑损伤的保护作用。应用Berdson评分标准对各组大鼠进行神经功能评分，应用免疫组织化学方法检测出血灶周围肿瘤坏死因子α和白细胞介素8的表达，应用流式细胞术检测神经细胞凋亡率。结果显示，与模型组比较，治疗组大鼠神经功能评分明显增加，灯盏花素治疗组脑细胞的凋亡率明显减低，治疗组出血灶周围炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素8明显减少，结论为灯盏花素注射液能保护神经元，促进神经功能恢复^[28]。

灯盏花素注射液可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞和神经胶质细胞^[29]，当向体内注入灯盏花素时，可加强其对骨髓间充质干细胞的诱导分化，以促进周围神经局部的损伤修复。另外，灯盏花素具有调节微循环^[30]、抑制自由基产生以及抗氧化损伤的作用^[31]，在周围神经损伤局部具有抗炎、改善血液供应的功能，灯盏花素可能通过该方式促进周围神经的修复。灯盏花素为中药灯盏细辛的提取物。含多种黄酮类活性成分，包括二咖啡酰奎宁酸、焦袂康酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、丁香酸及灯盏花乙素、芹菜素、高黄芩素等^[32]。

灯盏花素是从有抗心脑血管疾病作用的植物灯盏细辛中提取出来的，含灯盏花甲素和灯盏花乙素两种成分^[33]。熊哲等^[34]在谷氨酸体外诱导原代培养大鼠皮质神经元损伤的研究中发现，灯盏花素预处理后神经细胞的细胞存活率呈浓度依赖性增加，表明其对谷氨酸引起的脑神经细胞损伤有一定的保护作用。在大脑创伤后，灯盏花素能显著减轻大鼠脑水肿程度，抑制脑损伤所致血脑屏障通透性增加，并且具有显著增加脑组织超氧化物歧化酶含量和显著减少丙二醛含量的作用^[35]。尹明华等^[36]发现灯盏花素对缺血再灌注小鼠学习记忆有保护作用。以上均表明灯盏花素可以作用于神经细胞上的某个靶点，从而对神经起到促进其生长和存活的作用。

实验结果也发现，在对神经元进行灯盏花素的干预后，细胞数、最长突起长度，胞体面积、突起数目及细胞活均较正常及对照组上调。是什么原因或机制导致了这一结果呢？很多学者做了相关研究，周乐全等^[37]发现灯盏花素可阻断神经元内L型Ca²⁺通道作用，使细胞外Ca²⁺内流减少，从而保护神经元；唐省三^[38]发现灯盏花素可能通过上调Bcl-2蛋白水平，下调c-Fos蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白从而抑制神经元的凋亡；徐光等^[39]发现灯盏花素对神经元死亡的保护作用是通过非竞争性抑制蛋白激酶活性，从而减轻迟发性神经元死亡。

实验中也对灯盏花素促进神经元生长和存活的机制做了深入研究，发现灯盏花可使神经元内的神经生长因子及TrkA mRNA表达显著上调。神经生长因子是神经系统一种重要的生物活性因子，广泛分布于神经系统和非神经系统中。大量动物及人体试验证明，神经生长因子对中枢神经元具有保护作用^[40-41]。而神经生长因子只有与其受体TrkA结合，才能发挥正常的生物学效应^[42-43]。因此实验结果提示，灯盏花素可能通过促进神经元自身神经生长因子的自分泌或旁分泌，并作用于上调的TrkA受体，使其发生一系列的生物学效应，从而影响神经元的存活及生长。本文只是对灯盏花素对神经生长因子信号通路做了部分的研究，至于其他神经营养因子在此过程中所发挥的作用，仍待进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长

Effect of Breviscapine on the survival and growth of rat cortical neurons cultured in vitro

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