红景天苷与淤胆血清诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量实验证实骨髓间充质干细胞在诱导因子及特定微环境下可诱导分化为肝细胞，并已广泛用于终末肝病的临床替代治疗，而其最佳诱导条件目前尚不清楚。
目的：初步探讨中草药红景天苷联合淤胆大鼠血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性和有效性。　
方法：采用全骨髓贴壁培养法从大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞，流式法检测干细胞表型；胆总管结扎切断法制备大鼠淤胆血清。取第3代骨髓间充质干细胞分3组体外诱导培养：空白对照组，基础培养基+5%淤胆血清；红景天苷组：基础培养基+5%淤胆血清+30 µmol/L红景天苷；阳性对照组：基础培养基+5%淤胆血清+20 µg/L肝细胞生长因子；观察各组诱导培养过程中细胞形态变化，RT-PCR法、Western-Blot法检测各诱导组肝细胞特异性蛋白表达水平。
结果与结论：骨髓间充质干细胞高表达CD90、CD105，不表达CD45、CD14、CD34、CD79a；空白对照组、红景天苷组、阳性对照组细胞在诱导培养中均出现多角及双核细胞；空白对照组、红景天苷组、阳性对照组在诱导培养7 d开始出现甲胎蛋白、白蛋白的mRNA及蛋白表达；在同一时间点空白对照组表达率最低(P < 0.05)，红景天苷组、阳性对照组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。与传统淤胆血清体外诱导相比，红景天苷联合淤胆血清能更有效诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 红景天苷, 淤胆血清, 肝细胞生长因子, 体外诱导, 培养分化

Abstract:

BACKGROUND: A large number of experiments have confirmed that bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into hepatocytes under the induction of cytokines and specific micro-environment, and have been widely used in clinical alternative treatment for terminal liver disease, but the optimal inducing conditions are unclear.
OBJECTIVE: To explore the possibility and validity of differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes with a culture system containing salidroside and cholestatic rat serum in vitro.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by plastic adherence from the whole bone marrow of health rats, and cell phenotypes were identified using the flow assay; cholestatic serum was prepared by common bile duct ligation. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were randomly divided into three groups for in vitro induction by the different culture systems: blank control group: basic medium plus 5% cholestatic serum; salidroside group: basic medium plus 5% cholestatic serum plus 30 µmol/L salidroside; positive control group: basic medium plus 5% cholestatic serum plus 20 µg/L hepatocyte growth factor. Changes of cell morphology during culture time were observed in each group, reverse transcription-PCR assay and western blot assay were used to expression of hepatocyte-specific proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: The bone marrow mesenchymal stem cells highly expressed CD90, CD105, but did not express CD45, CD14, CD34, and CD79a. Polygonal and binucleate cells appeared in the three groups during the procedure of induction. The mRNA and protein expression of alpha-fetoprotein and albumin emerged in the three groups on the 7th day; in the same period, the lowest expression ratio was in the blank control group (P < 0.05), while there was no significant difference between the salidroside and positive control groups (P > 0.05). Combination of salidroside and cholestatic serum can effectively induce bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into hepatocytes.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, cell differentiation, hepatocyte growth factor

中图分类号:

R394.2

杜超，蒋明德，曾维政，高勇. 红景天苷与淤胆血清诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8512-8519.

Du Chao, Jiang Ming-de, Zeng Wei-zheng, Gao Yong. Salidroside and cholestatic serum induce differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8512-8519.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞的形态观察 倒置相差显微镜观察显示，接种4 h后细胞开始贴壁，48 h后形成集落，见图1。

经传代培养至第3代时，细胞形态较单一，状态饱满，呈梭形生长，漩涡状排列，见图2；诱导培养过程中，空白对照组、红景天苷组、阳性对照组细胞逐渐失去极性排列，形态由单一的梭形向多边形转化，见图3。

2.2 骨髓间充质干细胞的表型鉴定 流式细胞术分析结果表明，第3代骨髓间充质干细胞高表达CD90 (99.6%)、CD105(99.8%)，见图4；不表达造血系干细胞表面标记CD45(0.1%)、CD14(0.1%)、CD34(0.3%)、CD79a(0.1%)，见图5。

2.3 大鼠淤胆血清测定 淤胆型大鼠模型建立8 d后测定血清总胆红素浓度为(46.0±10.9) µmol/L，其5%培养基体系中胆红素浓度为(2.00±0.21) µmol/L。

2.4 RT-PCR法检测诱导后各组甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA表达 诱导培养7 d后空白对照组、红景天苷组、阳性对照组均可见甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA阳性表达。各组凝胶电泳图灰度值半定量分析结果显示，同一时间点红景天苷组、阳性对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，均高于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。其中各组甲胎蛋白基因mRNA在第7天表达量最高，以后逐渐下降，在21 d几乎未见表达，见图6-8；而白蛋白基因mRNA在第7天可见少量表达，后表达量逐渐增多，21 d后持续高表达，见图9-11。半定量分析结果见表1，2。

2.5 Western Blot法检测诱导后各组甲胎蛋白、白蛋白蛋白表达情况 Western Blot法检测结果表明诱导培养 7 d后空白对照组、红景天苷组、阳性对照组均可见甲胎蛋白、白蛋白蛋白阳性表达。各组凝胶电泳图灰度值半定量分析结果显示，同一时间点红景天苷组、阳性对照组比较无明显差异(P < 0.05)，均高于空白对照组，差异有显著性意义(P > 0.0.5)。其中各组甲胎蛋白蛋白

在第7天表达量最高，以后逐渐下降，在21 d几乎未见表达，见图12；而白蛋白在第7天可见少量表达，后表达量逐渐增多，21 d后持续高表达，见图13。

半定量分析结果，见图14，15。

参考文献

[1] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[2] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284(5411):143-147.

[3] Spees JL, Gregory CA, Singh H, et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Mol Ther. 2004;9(5): 747-756.

[4] Sarah S, Tamara V, Peggy P, et al. Sequential Exposure to Cytokines Reflecting Embryogenesis: The Key for in vitro Differentiation of Adult Bone Marrow Stem Cells into Functional Hepatocyte-like Cells. Toxicological Science. 2006;94(2):330-341.

[5] Dong XJ, Zhang H, Pan RL, et al. Identification of cytokines involved in hepatic differentiation of mBM-MSCs under liver- injury conditions.World J Gastroenterol. 2010;16(26):3267-3278.

[6] Huang YH, Shi MN, Zheng WD, et al. Therapeutic effect of interleukin-10 on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats. World J Gastroenterol. 2006;12(9):1386-1391.

[7] Weng HL, Wang BE, Jia JD, et al. Effect of interferon-γ on hepatic fibrosis in chronic hepatitis B virus infection:a randomized controlled study. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005;3(8):819-828.

[8] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 1999; 284 (5417):1168-1170.

[9] Am Esch JS 2nd, Knoefel WT, Klein M, et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells. 2005;23(4):463-470.

[10] Feng Z, Li C, Jiao S,et al.In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocytes. Hepatogastroenterology. 2011;58(112):2081-2086.

[11] 吴晓玲,曾维政,蒋明德,等.红景天甙对肝纤维化大鼠肝组织ROCK表达的影响[J].世界华人消化杂志,2009,8:765-769.

[12] 张华,戴立里,曾维政,等.红景天甙对大鼠肝组织TGF-β1/Smads 信号通路的作用[J].重庆医科大学学报,2011, 36(6):699-703.

[13] 杨斌,曾维政,蒋明德,等.红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中Wnt 信号通路的影响及其意义探讨[J].重庆医科大学学报, 2010,35(11):1630-1633.

[14] 荣黎,戴立里,曾维政,等.红景天甙对拟高原缺氧大鼠肝损伤的保护作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(31): 5813- 5817.

[15] Ouyang JF, Lou J, Yan C, et al. In-vitro promoted differentiation of mesenchymal stem cells towards hepatocytes induced by salidroside. J Pharm Pharmacol. 2010;62(4):530-538.

[16] 邹毅清,蔡志扬,李小宝,等.红景天苷预处理对大鼠全脑缺血再灌注后炎症反应的影响[J].现代中西医结合杂志,2011,22(3): 253-255.

[17] 高琨,胡美琴,祁洪刚,等.红景天苷对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的预防保护时限[J].吉林大学学报(医学版),2012,38(4):687-691.

[18] 黄晓颖,樊荣,蔡学定,等.腺苷A2a受体在红景天苷调节大鼠低氧性肺动脉高压中的作用[J].中国病理生理杂志,2012,28(12): 2135-2140.

[19] Colter DC,Class R, Digirolamo CM,et al.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97(7): 3213-3218.

[20] Tonraeau T,Lagneaux L,Edjeneffe M,et al.Isolation of BMSCs by plastic adhesion or negative selection:phenotype,proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 2004;6(4):372-379.

[21] Gindraux F,Selmani Z,Obert L,et al.Human and rodent bone marrow mesenchymal stem cells that express primitive stem cell markers can be directily enriched by using the CD49a molecule.Cell Tissue Res.2007;327(3):471-483.

[22] Lee BK, Choi SJ, Mack D, et al. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2011c;112(6): e86-93.

[23] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[24] Dong XJ, Zhang H, Pan RL, et al. Identification of cytokines involved in hepatic differentiation of mBM-MSCs under liver-injury conditions.World J Gastroenterol. 2010;16(26): 3267-3278.

[25] Hu JJ, Sun C, Lan L, et al. Therapeutic effect of transplanting β2m-/Thy1+ bone marrow-derived hepatocyte stem cells transduced with lentiviral-mediated HGF gene into CCl4-injured rats. J Gene Med. 2010;12(3):244-254.

[26] 哈小琴,董芳,吕同德.肝细胞生长因子基因对骨髓间充质干细胞的修饰及活性观察[J].中国修复重建外科杂志,2010,24(5): 613-617.

[27] Forte G, Minieri M, Cossa P, et al. Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal cells: Proliferation, migration, and differentiation. Stem Cells. 2006;24(1):23-33.

[28] Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 2002;109(10):1291-1302.

[29] Avital I,Inderbitzin D,Aoki T,et al.Isolation, characterization, and transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;288(1):156-164.

[30] 钟晓琳,万居易,王忠琼,等.淤胆血清及肝细胞生长因子体外诱导BMSCs向肝细胞分化[J].中国修复重建外科杂志,2010,24(3): 344-349.

引言

根据国际细胞治疗协会的标准定义，多能间充质干细胞是指具有较强的再生能力和能分化成中胚层起源的组织，如骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞等、同时不表达造血细胞表面标志的一类细胞^[1]。体内干细胞包括肝源性干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞等，其中骨髓干细胞又包括骨髓间充质干细胞和造血干细胞。骨髓间充质干细胞是位于骨髓间质的的一种多能成体干细胞^[2]，占所有骨髓单核细胞的1/10 000至1/100 000，通过50代的传代培养可扩大至500倍，产生几十亿细胞^[3]，单纯的骨髓间充质干细胞具有一定分化能力和增殖潜力，可在体内外环境下定向诱导分化为各胚层细胞。大量实验证实骨髓间充质干细胞在诱导因子及特定微环境下可诱导分化为肝细胞，如肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子^[4-5]、胰岛素样生长因子1、转化生长因子α、白细胞介素10^[6]、干扰素-γ等^[7]，并已广泛用于终末肝病的临床替代治疗，而其最佳诱导条件目前尚不清楚^[8-10]。

中药红景天苷具有抗氧化、抑制自由基形成等功效, 在抗缺氧、抗疲劳、调节免疫、抗缺血等方面广为应用。本课题组长期从事中药红景天苷的抗肝纤维化研究^[11-14]，证实红景天苷能保护肝细胞、减少肝脏胶原合成，能够抑制肝星状细胞增殖、活化，减少其合成胶原，从而逆转肝纤维化发展的作用，而Ouyang等^[15]已在体外用红景天苷成功诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝细胞；表明中草药红景天苷作为一种新的诱导因子具有更广泛的应用前景，在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的同时还可能具有逆转肝纤维化作用。实验拟通过红景天苷与淤胆血清联合诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化，模拟临床终末期肝病患者淤胆环境，以期找到一条更有效、更安全的诱导途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：动物分组，对照观察。

时间及地点：于2012年3至5月在解放军成都军区总医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：两三周龄清洁级健康SD大鼠5只，雌雄不拘，体质量80-100 g，制备骨髓间充质干细胞；11-13周龄清洁级健康SD大鼠10只，雌雄不拘，体质量210-250 g，制备淤胆血清，均由四川大学实验动物中心提供，许可证号：048。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

红景天苷联合淤胆血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与传代培养：无菌条件下分离大鼠双侧股骨与胫骨，完全去除周围组织，剪开干骺端后用体积分数10%FBS完全培养基反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液吹打制成单细胞悬液。细胞悬液在离心半径10.5 cm，1 000 r/min离心5 min后弃上清，体积分数10%FBS完全培养基重悬细胞后接种于10 cm²培养皿，于37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱孵育；48 h后首次换液，去除非贴壁细胞，以后每3 d换液1次；待贴壁细胞达80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例进行传代培养。倒置显微镜下观察细胞形态。

大鼠骨髓间充质干细胞表型鉴定：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后收获约1×10⁶细胞，PBS离心洗涤3次，重悬于上样管中，加入荧光标志抗体CD45/90/105/14/34/79a，用抗大鼠FITC-lgG；PE-lgG作同型对照；常温避光标记45 min，PBS洗3次，流式细胞仪进行检测。

大鼠淤胆血清制备：取清洁级SD大鼠10只，常规消毒后乙醚麻醉开腹行胆总管结扎切断手术建立淤胆模型。术后常规饲养，8 d后无菌心脏取血，测定全血总胆红素水平；全血置37 ℃水浴 60 min，2 000 r/min离心20 min，吸取上层血清，过滤除菌，56 ℃灭活30 min，置于-20 ℃保存备用。

定向分化诱导培养：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞以3×10⁴/cm²密度接种于 6 孔培养板，根据加入诱导培养液的不同分为3组，空白对照组：基础培养基+ 5%淤胆大鼠血清；红景天苷组：基础培养基+5%淤胆血清+30 µmol/L红景天苷；阳性对照组：基础培养基+ 5%淤胆血清+20 µg/L肝细胞生长因子；基础培养基为含10%FBS的低糖培养基，每组4个复孔。第3天细胞融合达50%后开始诱导培养，每3 d全量换液1次，诱导培养21 d。倒置相差显微镜下每天观察各诱导组细胞形态变化，拍照保存。

RT-PCR检测诱导后各组甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA表达：取诱导后第7，14，21天各诱导组细胞用RNAiso提取总RNA，第1步反转录为CDNA，根据GenBank中甲胎蛋白、白蛋白编码序列分别设计引物序列：白蛋白(Alb_F1 tct atg ccc cag aac tcc ttt a；Alb_R1 cac tcc ttg ttg att ttg gtg a；产物大小289 bp)；甲胎蛋白(AFP_F1 aaa atg agt agc gat gcg ttg；Afp_R1 ttg atg ctc tct ttg tct gga a；产物大小421 bp)；内参GAPDH( F1 caa ggt cat cca tga caa ctt tg；R1 gtc cac cac cct gtt gct gta g；产物大小496 bp)；第2步PCR扩增特异序列，产物进行琼脂糖电泳鉴定。

Western Blot检测诱导后各组甲胎蛋白、白蛋白的蛋白表达：取诱导后第7，14，21天各诱导组细胞提取总蛋白，测定蛋白浓度后以 40 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将蛋白转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，小鼠抗大鼠甲胎蛋白(ALB)单克隆抗体(1∶10 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入山羊抗小鼠 IgG (1∶10 000)结合，再次洗膜后加入 Western blot化学发光剂曝光，摄片。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

红景天苷，别名红景天甙，为景天科，红景天属植物，是景天科植物大花红景天的干燥根及根茎提取物。是一种苯基烷类化合物，为中药红景天的有效药理成分。具有抗肝纤维、增强免疫力、抑制肿瘤、调节神经内分泌系统等作用，决定了其良好的临床应用前景^[16-18]。

近年来国内外文献报道骨髓间充质干细胞分离方法目前大体上有如下3种^[19-21]：根据密度梯度从骨髓中分离出单核细胞的密度梯度离心法、利用骨髓间充质干细胞易贴附于塑料平板生长的全骨髓培养法及利用骨髓间充质干细胞特定表型标志进行的免疫分选法。比较这几种分离方法，全骨髓培养法操作相对简便，对细胞活性损伤小，细胞增殖速度快，生长形态较好，利于进一步诱导分化培养及作为组织工程种子细胞^[22]。文章采用全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞，流式细胞术分析结果表明，所获得第3代骨髓间充质干细胞高表达特异性标志CD90、CD105，不表达造血系及淋巴系干细胞表面标记CD45、CD14、CD34、CD79a^[23]，纯度较高，增殖旺盛，生长状态较好。

骨髓间充质干细胞可以在特定环境下定向分化为肝样细胞已经在国内外多次试验中得到证实^[24-25]，其分化诱导条件包括细胞因子、微环境等多种因素。细胞因子中肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子2，4等广泛用于诱导。其中肝细胞生长因子是调控干细胞增殖和定向分化极具潜力的一种因子，其最初从部分肝切除大鼠血清中分离出，通过与c-Met受体结合，启动受体二聚体化和酪氨酸残基(Tyr1234和Tyr1235)的转磷酸化而激活激酶活性，随后调节羧基端的酪氨酸磷酸化，从而调节多种信号分子，发挥生物学作用^[26]。Forte等^[27]发现肝细胞生长因子通过p38信号通路的参与促进间充质干细胞增殖，通过PI3K信号通路促进其迁移。Schwartz等^[28]利用肝细胞生长因子与成纤维生长因子体外共培养骨髓间充质干细胞，成功诱导其向肝样细胞分化。淤胆血清因能提供特异的肝干细胞增殖信号及肝细胞受损时分泌的系列炎症因子，如肝细胞生长因子、白细胞介素2等，被认为是肝干细胞增殖分化的良好微环境^[29]。体内干细胞增殖分化过程既有细胞因子参与，同时还有其特定微环境，因此决定了实验在体外进行诱导培养时必须联合上述因素。钟晓琳等^[30]联合淤胆血清与肝细胞生长因子体外共培养骨髓间充质干细胞，发现能够诱导其向肝细胞分化，并且明显提高分化效率。

实验采用红景天苷与淤胆血清联合诱导培养作为实验组，肝细胞生长因子与淤胆血清联合诱导培养作为阳性空白对照组，淤胆血清培养为空白对照组。甲胎蛋白作为一种胎肝细胞分泌的糖蛋白，常用于新生肝细胞监测，而成熟肝细胞则合成分泌白蛋白，几乎不合成或少量合成甲胎蛋白。实验结果表明诱导初期各组高表达甲胎蛋白，随着时间延长，甲胎蛋白表达量逐渐减低，而白蛋白表达量逐渐升高,其中红景天苷组与淤胆血清联合诱导培养表达量和阳性空白对照组比较，两组间比较，差异无显著性意义，但都显著高于空白对照组。　

综上所述，红景天苷联合淤胆血清体外诱导培养骨髓间充质干细胞，能明显提高白蛋白、甲胎蛋白的表达率，促进其向肝样细胞分化，显著优于传统淤胆血清体外诱导；同时红景天苷来源广泛，取材方便等特点，使其具有更广泛的应用前景。但其诱导机制目前尚不清楚，有待进一步研究解决。