改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8505-8511.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.007

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改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用

李斯翰^1，2，段建民²，李洪涛²，文军²

1南方医科大学研究生学院，广东省广州市 510000
2解放军广州军区广州总医院口腔科，广东省广州市 510000

修回日期:2013-09-25 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 段建民，博士，主任医师，硕士研究生导师，解放军广州军区广州总医院口腔科，广东省广州市 510000 duanjianmin3@126.com
作者简介:李斯翰★，女，1987年生，广东省汕头市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事牙体牙髓专业研究。 516044406@qq.com
基金资助:
广东省科技计划项目(2011B031800201)*，课题名称：改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞与乳牙髓干细胞体外扩增及成骨分化作用的对比实验研究

Improved platelet-rich plasma effects on the proliferation and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells

Li Si-han^{1, 2}, Duan Jian-min², Li Hong-tao², Wen Jun²

1Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
2Department of Stomatology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Revised:2013-09-25 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Duan Jian-min, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Stomatology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China duanjianmin3@126.com
About author:Li Si-han★, Studying for master’s degree, Graduate School, Southern Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China 516044406@qq.com
Supported by:
the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2011B031800201*

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期实验发现改良富血小板血浆对人牙髓细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，以10%浓度尤为明显。
目的：观察不同浓度改良富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞体外生长增殖的作用效果，以及最佳浓度改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞免疫原性的影响。
方法：使用健康志愿者捐献骨髓血培养的第三四代人骨髓间充质干细胞，行流式细胞术及成脂、矿化诱导分化鉴定。将由同一志愿者采集的静脉血制备的改良富血小板血浆作用于人骨髓间充质干细胞，以CCK-8法测定细胞增殖变化，绘制生长曲线。选取最适合人骨髓间充质干细胞增殖的改良富血小板血浆浓度，以体积分数10%FBS培养基为对照，通过流式细胞术测定连续培养3代的人骨髓间充质干细胞表面Stro-1的表达率。
结果与结论：5%-10%的改良富血小板血浆在培养第6，8天均显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，其中以10%浓度组尤为显著在培养第10天仍显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖且细胞表面Stro-1的表达率连续3代均高于对照组。说明改良富血小板血浆对人骨髓间充质干细胞增殖的促进作用具有浓度依赖性，10%改良富血小板血浆可以较好地保持人骨髓间充质干细胞的免疫原性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 富血小板血浆, 骨髓血, 增殖, 免疫原性, 生长因子, 细胞移植, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Previous experiments have shown that improved platelet-rich plasma can promote the proliferation of human dental pulp cells in a concentration-dependent manner, particularly when the concentration is 10%.
OBJECTIVE: To investigate the effect of platelet-rich plasma at different concentrations on the proliferation and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors were cultured and passaged for 3-4 passages, identified by flow cytometry and differentiation inductions. Platelet-rich plasma samples which were manufactured from the venous blood of the same donor were used for culturing human bone marrow mesenchymal stem cells. The proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells was measured by cell counting kit-8 method and the growth curves were drawn. The most suitable concentration of platelet-rich plasma was selected to culture human bone marrow mesenchymal stem cells for three generations and the Stro-1 expression rate on the surface of human bone marrow mesenchymal stem cells was determined through flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Platelet-rich plasma at the concentration of 5%-10% evidently promoted the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells on the 6th and 8th days. The most effective concentration to promote the proliferation was 10%. Platelet-rich plasma at the concentration of 10% still promoted the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells on the 10th day, and maintained a better immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells compared to the control group. These findings indicate that platelet-rich plasma can promote the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells in a concentration-dependent manner, and 10% platelet-rich plasma is better to maintain the immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells.

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Key words: mesenchymal stem cells, bone marrow, platelet-rich plasma, cell transplantation

中图分类号:

R394.2

李斯翰，段建民，李洪涛，文军. 改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增殖与免疫原性的作用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8505-8511.

Li Si-han, Duan Jian-min, Li Hong-tao, Wen Jun . Improved platelet-rich plasma effects on the proliferation and immunogenicity of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8505-8511.

图/表（结果） 7

2.1 改良富血小板血浆血小板计数 全血中血小板浓度为187×10⁹ L^-¹，改良富血小板血浆血小板浓度为 1 001×10⁹ L^-¹，为全血浓度的5.35倍。

2.2 人骨髓间充质干细胞生长和纯化情况 人骨髓间充质干细胞培养48 h后可见少量细胞贴壁，细胞呈梭形，培养10 d后细胞增生为成纤维样细胞，有少许不规则突触，呈团簇状生长。约2周后细胞达到80%左右融合，连续培养至第3代时细胞形态较均一，呈长梭形，胞核居中，见图1。

2.3 人骨髓间充质干细胞鉴定结果

成骨诱导和染色：换成骨诱导液1周后可见局部细胞密度明显增高，2周后镜下可见圆形、椭圆形反光物质，并逐渐增大。3周后茜素红染色可见红色矿化结节，见图2。

流式细胞术鉴定：人骨髓间充质干细胞CD44⁺表达率为97.68%，CD105⁺表达率为97.07%，而CD34表达为阴性，见图3。

成脂诱导和染色：换成脂诱导液1周后可见细胞形态较之前饱满，镜下可见胞浆内有串珠状圆形小泡。2周后油红染色可见胞浆内含有橙红色融合脂滴，见图4。

2.4 改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞生长的影响 5%-10%的改良富血小板血浆在培养第6，8天均显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，其中以10%浓度组尤为显著，与其他浓度相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。10%的富血小板血浆在培养第10天仍显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，见表1，图5-7。不同浓度改良富血小板血浆培养的骨髓间充质干细胞生长曲线见图8。

2.5 流式细胞术鉴定人骨髓间充质干细胞表面Stro-1表达 在含10%富血小板血浆的α-MEN培养液连续3代培养后，测定细胞表面Stro-1表达显著高于对照组(P=0.000)，见表2-4，图9。

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引言

材料方法

设计：完全随机设计的细胞学实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2013年2月在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。

材料：

骨髓血来源：男性志愿者，27岁，平素身体健康，无全身系统性疾病，无家族遗传病史，血常规检查正常。志愿者对实验知情同意，实验符合医学伦理学标准。

改良富血小板血浆对细胞免疫原性影响实验用主要试剂及仪器：

实验方法：

改良富血小板血浆的制备：按本科曾报道的方法从提供骨髓的志愿者肘静脉采集静脉血制备富血小板血浆^[4]。全血细胞分析仪进行血小板计数后，按终浓度2 U/mL加入肝素钠抗凝。将富血小板血浆分装入冻存管内，液氮反复冻融3次，将激活后的富血小板血浆3 500×g离心25 min，然后吸取上清液过滤用于实验。

人骨髓间充质干细胞的培养：无菌条件下抽取健康志愿者骨髓血5 mL(预先于注射器中加入肝素并调整终浓度至3 000 U/mL)，密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，于37 ℃，体积分数5% CO₂孵箱孵育48 h后换液，待细胞汇合至瓶底80%时传代，连续3代传代纯化培养^[5]。将培养的第三、四代细胞用于实验。

人骨髓间充质干细胞的鉴定：以1×10⁵/孔的密度将细胞接种于6孔板中，待细胞进入对数生长期后弃原培养液，PBS洗3遍，分别换为成脂诱导液(含体积分数10%胎牛血清，10^-⁸ mol/L地塞米松，10^-⁴ mol/L 吲哚美辛，10 mg/L胰岛素，50 mmol/L IBMX的α-MEN)和成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清，10^-⁸mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 μg/L L-抗坏血酸的α-MEN)^[6]，无矿化、成脂诱导成分的含体积分数为10%胎牛血清的α-MEN作为空白对照，每3 d换液1次，于诱导第14，21天分别进行油红O染色和茜素红染色^[7-8]。

将浓度为10⁹ L^-¹的人骨髓间充质干细胞悬液1 mL送至广州军区总医院血液科细胞中心行流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD105、CD34^[9]。

CCK-8法测定人骨髓间充质干细胞生长曲线：取生长良好的人骨髓间充质干细胞，消化、计数，稀释成浓度为1×10⁷ L^-¹的细胞悬液，按100 μL/孔接种至96孔板。细胞培养箱内培养24 h后吸弃培养液，PBS洗3遍后分别加入含2%，5%，10%，20%富血小板血浆的α-MEN培养液，含体积分数10%胎牛血清的α-MEN培养液作为对照，每组28孔，隔日换液。隔天每组取4孔，CCK-8法测定孵育2 h后于450 nm波长处A值^[10]。连续10 d以时间为横轴，A值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

流式细胞术测定人骨髓间充质干细胞表面Stro-1表达率：取第3代人骨髓间充质干细胞，接种于75 mm²培养瓶中，分别加入含10%富血小板血浆的α-MEN培养液，含体积分数10%胎牛血清的α-MEN培养液作为对照，每3 d换液1次，细胞融合至80%时消化，计数，传代，分别取2×10⁵个细胞，PBS洗涤并重悬，加入Stro-1抗体，4 ℃避光标记30 min，PBS洗涤2次后重悬，加入FITC标记二抗，4 ℃避光标记30 min，PBS洗涤两次，加入40 g/L多聚甲醛重悬，以至少5 000个细胞用于流式细胞仪检测。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，实验结果数据以x(_)±s表示，不同时段细胞增殖活性(CCK-8 A值)经Levene检验方差不齐组(6，8 d)，采用Welch法行方差分析，组间比较采用Dunnett’s T3法，方差齐组(10 d)采用One-Way ANOVA，组间比较采用Bonferroni法；Stro-1表达率采用四格表资料卡方检验进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，并连续3代培养分离纯化细胞群落。根据干细胞具有多向分化潜能，分别用成骨诱导液和成脂诱导液培养该细胞, 一定时间后发现了明显的矿化结节和脂滴形成，说明该细胞具有多向分化能力。虽然目前还没有哪一种干细胞表面标记物具有组织特异性，但是，通常可以根据细胞具有的几种表面标记物推断其来源和类型。本实验经流式细胞术鉴定，细胞表面抗原CD44⁺表达率为97.68%，CD105⁺表达率为97.07%，而CD34表达为阴性，符合间充质干细胞表面标志物一般表型。所得细胞为人骨髓间充质干细胞，可用于进一步实验研究。

本实验采用的改良富血小板血浆是通过液氮反复冻融的方式，促进血小板中生长因子的释放。相比较加入外源性物质(氯化钙、人或牛凝血酶)的激活方式，采用液氮反复冻融可以减少外源性物质所带来的潜在感染风险，避免传染性疾病(如HIV、乙肝、梅毒等)以及免疫反应的发生^[11]。另外，从组织工程的安全性考虑，为了减少胎牛血清和小牛血清等外源性血清的使用，以利最大限度地避免骨髓间充质干细胞在组织工程和临床应用中可能存在的人畜共患疾病传播风险^[12]，本实验尝试使用自体来源改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞进行体外培养、扩增和分化诱导等。

富血小板血浆经凝血酶或反复冻融裂解，可以释放血小板α颗粒中的多种生长因子，如血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子和转化生长因子β等^[13]，富血小板血浆中不仅富含上述生长因子，而且保持了生长因子间的天然生理学浓度比例。这些生长因子发挥联合或协同作用,可以调控成骨细胞及其前体细胞骨髓间充质干细胞的趋化、增殖和分化，进而影响骨组织的形成和再生^[14-15]。以往作者的实验研究发现改良富血小板血浆对人牙髓细胞增值的促进作用具有浓度依赖性，1%-10%的改良富血小板血浆明显提高了人牙髓细胞的增殖活性，以10%浓度尤为明显。本实验结果表明5%-10%的改良富血小板血浆在培养第6，8天均显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，10%的富血小板血浆在培养第10天显著促进了骨髓间充质干细胞的增殖，并且其对细胞的增殖促进作用具有浓度依赖性，过高浓度改良富血小板血浆反而导致了对细胞增殖的抑制。近期的研究表明大量浓聚生长因子(如富血小板血浆)注入到牙周及下颌骨损伤中可能是一种具备潜力的生物工程治疗方法^[16]。然而富血小板血浆应用于临床治疗的研究及实践中，尚有最佳使用浓度，应用于治疗的最佳时机等问题需要解决^[17]，本实验为其进一步临床应用，提供了其作用的原理及最佳的使用浓度的理论依据。

骨髓间充质干细胞为非均质性的细胞群体，其表面标记物Stro-1具有相对的特异性^[18]，Stro-1⁺细胞亚群为数量较少的更原始、均一性更佳的骨髓间充质干细胞，已被证实比Stro-1^-的骨髓间充质干细胞具有更强的免疫抑制效应、造血支持和动物模型中的归巢能力^[19]。本实验对细胞表面Stro-1表达的检测显示10%浓度富血小板血浆组Stro-1⁺表达率显著高于对照组，这提示了在体外培养中加入适当浓度富血小板血浆，能够在一定程度上调节细胞的均一性，通过更原始的Stro-1⁺细胞亚群的高表达，促进细胞的增殖和增强其分化潜能。

现阶段，牙周和口腔颌面部骨折的缺损重建修复依然是一个临床难题，这些骨质缺损有很少的潜力能够自行修复愈合。最近的骨组织工程学研究集中在通过手术方法于可降解支架材料上加入组织诱导因子和/或特定种类活细胞群，来促进骨组织修复^[20-21]。骨髓间充质干细胞由于其具有免疫抑制作用，多向分化能力、易于获取并于体外大量扩增的特性，故被认为是一种良好的植入种子细胞。本实验采用合适浓度改良富血小板血浆体外培养的骨髓间充质干细胞可获得比普通培养方式具有更强的免疫抑制效应，更好的细胞原性及均一性的细胞群落，将更有利于其在自体、异体骨移植、支架材料植入等的实验研究及临床上的应用，同时还可以避免使用动物血清进行体外细胞培养和扩增可能带来的人畜共患疾病的感染风险。

综上所述，体积比为5%-10%的改良富血小板血浆对体外培养的人骨髓间充质干细胞的增殖具有促进作用，其中以10%浓度为佳，该浓度改良富血小板血浆可以促进人骨髓间充质干细胞群落中Stro-1⁺细胞亚群的增殖，从而增强细胞群落的免疫抑制效应、均一性和原始性。该结果为将自体的改良富血小板血浆用于组织工程中的骨髓间充质干细胞(来源于自体)体外增殖扩展提供了理论支持，但是，有关改良富血小板血浆对骨髓间充质干细胞增值的促进作用呈现浓度特异性的原因，以及在体应用改良富血小板血浆进行骨组织再生的最适浓度等问题目前还不清楚，需要进一步的实验研究加以阐明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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