不同月龄人脐带间充质干细胞移植梗死心肌的血运重建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.009

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (49): 8520-8526.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.49.009

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不同月龄人脐带间充质干细胞移植梗死心肌的血运重建

武丽萍¹，蔡力¹，陶剑虹¹，曹玫²，朱一帆³，李进嵩¹，王艳⁴

四川省人民医院，¹心内科，²临床中心实验室，³器官移植中心，⁴血液科，四川省成都市 610072

修回日期:2013-09-14 出版日期:2013-12-03 发布日期:2013-12-03
通讯作者: 蔡力，硕士，教授，硕士生导师，四川省人民医院心内科，四川省成都市 610072 scsrmyyyb@163.com
作者简介:武丽萍★，女，1985年生，山西省侯马市人，汉族，遵义医学院在读硕士，医师，主要从事干细胞移植基础研究及冠脉介入的临床研究。 wlp3124558@yahoo.com.cn
基金资助:
四川省应用基础研究项目(2009JY0094)*；四川省青年基金资助(2011JQ0018)*

Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different gestational age for myocardium revascularization after myocardial infarction

Wu Li-ping¹, Cai Li¹, Tao Jian-hong¹, Cao Mei², Zhu Yi-fan³, Li Jin-song¹, Wang Yan⁴

¹Department of Cardiology,²Clinical Laboratory,3Organ Transplantation Center,⁴Department of Hematology, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China

Revised:2013-09-14 Online:2013-12-03 Published:2013-12-03
Contact: Cai Li, Master, Professor, Master’s supervisor, Department of Cardiology, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China scsrmyyyb@163.com
About author:Wu Li-ping★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Cardiology, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China wlp3124558@yahoo.com.cn
Supported by:
the Applied Basic Research Program of Sichuan Province, No. 2009JY0094*; the Youth Foundation of Sichuan Province, No. 2011JQ0018*

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞移植有利于心肌梗死后的心肌血运重建及改善心功能，HLA-G分子在免疫耐受状态的形成及维持中具有重要作用。
目的：观察不同月龄有HLA-G表达差异的人脐带间充质干细胞移植后对急性心肌梗死兔血运重建的影响。
方法：健康新西兰大白兔30只，随机数字表法分为小月龄细胞移植组、足月龄细胞移植组及对照组。建立兔心肌梗死模型后2周，将小月龄人脐带间充质干细胞和足月人脐带间充质干细胞分别标记BrdU，多点注射心肌梗死的交界区和中心区，对照组注射无血清培养基。
结果与结论：移植后4周，小月龄和足月龄细胞移植组在心肌梗死区均发现有BrdU示踪细胞，且两组梗死区心肌纤维化程度、心肌梗死面积均少于对照组(P < 0.01)，两移植组间差异也有显著性意义(P < 0.05)。Ⅷ因子染色见小月龄细胞移植组毛细血管密度高于足月龄细胞移植组(P < 0.01)，且两移植组与对照组比较差异也有显著性意义(P < 0.05)。提示HLA-G表达量较高的小月龄脐带间充质干细胞能更好促进梗死区血管新生，改善血运重建，有潜力成为心肌细胞移植的更理想来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 人脐带间充质干细胞, HLA-G, 心肌梗死, 血运重建, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Transplantation of stem cells has a beneficial effect on myocardium revascularization and improving cardiac function after myocardial infarction, and HLA-G protein contributes to the formation and maintenance of the immune tolerance.
OBJECTIVE: To investigate the transplantation effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different gestational age with different HLA-G expression levels on myocardium revascularization after myocardial infarction in rabbits.
METHODS: Thirty healthy New Zealand rabbits were selected and were randomly divided into human small gestational age umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transplantation group, human full-term umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transplantation group and control group. After the rabbits models of acute myocardial infarction had been established, the former two groups were infused different umbilical cord-derived human umbilical cord mesenchymal stem cells labeled with 5-bromo-2-deoxyuridine into the edge and center of myocardial infarct region by multipoint injection. Rabbits in the control group were subjected to an equal volume of serum-free culture medium.
RESULTS AND CONCLUSION: Four weeks after cell transplantation, 5-bromo-2-deoxyuridine-positive cells were found surrounding the infarct site in both transplantation groups. Myocardial fibrosis and myocardial infarct size were significantly lower in both transplantation groups than those of the control group (P < 0.05), and there was a significant difference between the two transplantation groups (P < 0.01). The positive staining of factor VII indicated that capillary density was increased significantly in the small gestational age umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transplantation group as compared with the full-term umbilical cord-derived mesenchymal stem cells transplantation group (P < 0.01), and a sstatistical difference was found between two transplantation groups and the control group (P < 0.01). Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells with high HLA-G expression increases new capillary vessels and improves myocardium revascularization. All indicate that human small gestational age umbilical cord mesenchymal stem cells have the potential to become the better source of cardiomyocytes transplantation.

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Key words: mesenchymal stem cells, umbilical cord, mesenchymal stem cell transplantation, myocardial infarction

中图分类号:

R394.2

武丽萍，蔡力，陶剑虹，曹玫，朱一帆，李进嵩，王艳 . 不同月龄人脐带间充质干细胞移植梗死心肌的血运重建[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(49): 8520-8526.

Wu Li-ping, Cai Li, Tao Jian-hong, Cao Mei, Zhu Yi-fan, Li Jin-song, Wang Yan. Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different gestational age for myocardium revascularization after myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(49): 8520-8526.

图/表（结果） 6

2.1 人脐带间充质干细胞的培养和标记 第2代细胞株水浴复苏24 h后，可见贴壁生长、形态均一类似于成纤维细胞的人脐带间充质干细胞，3-5 d可铺满培养瓶底，见图2A，B。荧光显微镜下BrdU标记阳性细胞发绿色荧光，标记率达95%以上，见图2C。

2.2 HLA-G在不同来源人脐带间充质干细胞中的表达 不同来源的第3代细胞爬片经HLA-G免疫荧光显色后显示：小月龄组人脐带间充质干细胞胞浆荧光信号阳性，足月组人脐带间充质干细胞胞浆荧光信号微弱阳性或阴性，见图3。

2.3 心肌梗死模型的建立 心肌梗死成功标志：左室支完全结扎后，左心室前壁、心尖部变为暗紫色，搏动减弱及相应导联出现ST段持续性抬高，见图4。

2.4 各组心肌梗死面积 细胞移植4周后心肌组织的TTC特殊染色显示：小月龄细胞移植组心肌梗死面积(9.77±2.43)%和足月细胞移植组心肌梗死面积(15.87± 1.23)%均小于对照组(24.29±3.48)%(P < 0.01)，两移植组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 心肌组织的苏木精-伊红染色 人脐带间充质干细胞移植后4周各组心肌组织的苏木精-伊红染色，可见：小月龄细胞移植组心肌组织梗死区中有较多心肌细胞存活，心肌纤维化程度低，仅见少量炎细胞浸润。足月细胞移植组梗死区中亦有较多心肌细胞存活，出现脂肪变性现象，心肌纤维化程度较低，见多量炎细胞浸润。对照组心肌组织梗死区中肌纤维结构消失，代之纤维瘢痕组织，大量炎细胞浸润，见图6。

2.6 移植组中BrdU细胞示踪人脐带间充质干细胞移植后4周各移植组心肌组织切片均可见BrdU阳性示踪细胞，核粗大，形态学幼稚，见图7。

2.7 心肌组织毛细血管密度分析 人脐带间充质干细胞移植后4周对各组心肌组织切片行Ⅷ因子免疫组化染色可见：小月龄细胞移植组毛细血管密度[(98.60±9.56)个/400倍视野]高于足月细胞移植组[(59.60±6.88)个/ 400倍视野](P < 0.05)，且两组与对照组[(34.00±9.22)个/400倍视野]比较差异亦有显著性意义(P < 0.01)，见图8。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年2至10月在四川省医学科学院•四川省人民医院临床医学中心实验室完成。

材料：

实验动物：两三个月龄新西兰大白兔30只，雌雄不限，由四川省医学科学院•四川省人民医院动物实验中心提供，体质量(2.0±0.5) kg。按随机数字表法分为小月龄细胞移植组、足月龄细胞移植组及对照组，每组10只。

细胞株：小月龄第2代人脐带间充质干细胞株^[14]，来源于流产的两三个月龄人胚胎的脐带组织，由四川省医学科学院•四川省人民医院临床医学中心实验室提供。

足月龄第2代人脐带间充质干细胞株，来源于顺产的足月新生儿的脐带组织，由四川省医学科学院•四川省人民医院器官移植中心提供。

人脐带间充质干细胞对心肌梗死后血运重建影响实验所用主要试剂与仪器：

实验方法：

人脐带间充质干细胞的培养及标记：第2代细胞株水浴复苏后接种于含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素双抗溶液的α-MEM完全培养液中，放入37 ℃、体积分数为5%的CO₂饱和湿度孵箱中培养。贴壁48 h后换液，以后每3 d更换培养液，待细胞增殖到80%时传代，第3代细胞冻存备用。另取增殖到80%的第3代细胞，移植前48 h用含BrdU(10 μmol/L)培养液标记。

心肌梗死模型的建立：经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，保持兔自然呼吸状态，仰卧位固定手术台上。剪除胸前区毛，连接心电图机进行检测。胸骨左缘切口切断三四肋软骨，眼科开睑器撑开胸廓，眼科剪纵行切开心包，眼科镊轻夹心尖部脂肪垫，结扎左室支。心肌梗死成功标志：结扎血管远端心肌颜色变为暗紫色及相应导联出现ST段持续性抬高。术后在胸腔内、胸壁及皮下撒入适量青霉素粉及地塞米松，防止感染及减少粘连程度，逐层关胸。术后肌注头孢唑啉钠 0.5 g/次，连续3 d。

人脐带间充质干细胞移植：造模成功2周后再次开胸，小月龄细胞移植组和足月龄细胞移植组注射BrdU标记的含2×10¹⁰ L^-¹人脐带间充质干细胞悬浮液，分多点注射到心肌梗死的交界区和中心区，1 mL/只。对照组相同部位注射等量α-MEM培养基。关胸后肌注头孢唑啉钠3 d。

细胞免疫化学检测：

HLA-G在人脐带间充质干细胞中表达的检测：第3代细胞培养融合至培养瓶底80%时消化分离，合成培养基重新悬浮细胞，以0.5×10⁸ L^-¹注入二孔腔室载玻片，入孵箱爬片24 h，分别经40 g/L多聚甲醛固定、体积分数为3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶、小鼠抗人HLA-G一抗滴加(1∶100)、SABC(小鼠Ig-G)-FITC试剂盒避光孵育后，湿片滴加荧光抗淬灭剂封固，立即荧光显微镜下观察。阴性对照为PBS代替的特异性一抗。

BrdU标记细胞阳性率检测：滴加一抗前需加3 mol/L的HCl变性30 min，余步骤同上，一抗为小鼠抗BrdU一抗(1∶200)，湿片滴加荧光抗淬灭剂封固，立即荧光显微镜下观察。阴性对照为未加BrdU标记的细胞爬片。

心肌梗死面积检测：细胞移植后4周处死动物，迅速取下心脏，冰生理盐水行主动脉加压灌洗去除残余血液，剪除心房及残余大血管，沿心脏长轴切为2 mm左右的心肌短轴切片。将切片放入1%TTC溶液，37 ℃水浴孵化10 min，即见白色梗死区及红色非梗死区^[15]。捞出切片滤纸吸干水分后数码相机拍摄，Image-Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积，见图1。

组织病理及免疫化学检测：细胞移植后4周处死动物，取含梗死区的心肌组织经体积分数为10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、厚约4 µm切片后，分别行：①苏木精-伊红染色。②SABC法行BrdU免疫组化染色。③SABC法行Ⅷ因子免疫组化染色(一抗为小鼠抗Ⅷ因子一抗，工作浓度为1∶400)、DAB显色、苏木精复染、脱水及透明中性树脂封固后，镜下观察并照相。低倍视野(100倍)下定位组织，转高倍视野(400倍)下随机选取5个视野，分别计算其染色阳性的毛细血管平均数。

主要观察指标：HLA-G在人脐带间充质干细胞中的表达；兔心肌组织中的BrdU标记细胞阳性率；各组兔心肌梗死面积及切片中新生毛细血管计数^[16]。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0软件进行统计分析，结果以x(_)±s表示，若数据服从正态分布且方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析及q 检验，否则采用秩和检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

缺血性心肌病由于其高发病率，现已成为导致人类死亡的主要原因之一^[17]。急性心肌梗死后心肌细胞再生能力有限，因而近十年来，中外学者一直致力于研究除传统治疗外新的治疗策略：促进心肌再生及改善左室功能的干细胞移植。间充质干细胞因其具有多向分化潜能及良好的异体移植免疫耐受性，成为目前的研究热点。有研究运用细胞片技术，将单层的间充质干细胞移植至心肌梗死后的瘢痕组织部位^[18]。结果显示：移植薄片逐渐变厚，移植细胞促进新血管形成，从而具有阻止心室壁变薄的趋势，且改善了心脏功能。其他研究小组亦得到类似结果^[19]。间充质干细胞移植可能为心肌梗死后的治疗带来新的希望。

近年来Hsu等^[20]研究指出：前列腺素E2可加强间充质干细胞诱导的白细胞介素10⁺γ-干扰素⁺CD4⁺调节性T细胞，以控制移植动脉硬化。陈可^[21]实验结果证实：人脐带间充质干细胞发挥免疫抑制作用，主要通过前列腺素E2介导。新近报道显示：间充质干细胞可通过旁分泌信号(胰岛素样生长因子1、前列腺素E2等细胞因子)上调间隙连接蛋白43，促进梗死区及交界区血管再生，改善心脏传导功能^[22]。

现阶段间充质干细胞的主要来源为骨髓^[23-27]。但骨髓中间充质干细胞含量低，细胞数量和增殖分化能力随年龄增长显著下降，往往需要抽取患者大量骨髓，增加患者取材痛苦，且骨髓容易受到病毒感染，随之带来异体移植中的病毒传染等问题^[28-29]，都限制了骨髓成为最佳的间充质干细胞移植细胞源。人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞在移植治疗方面有很多相同特征，且取材方便，细胞含量更丰富。其相对的免疫不成熟性，较骨髓具有更多原始祖细胞，使之有可能成为间充质干细胞移植治疗的新选择^[30]。

HLA-G作为一种非经典的MHC分子，主要分布在孕期母胎界面上，其蛋白分子在胎盘形成期强表达，之后逐渐减弱。法国巴黎的Hematologie大学生化实验室通过研究发现^[31]，能够抵抗NK细胞及细胞毒性T细胞(CTL)的靶细胞上有HLA-G分子的表达^[32-33]。进一步的研究表明：膜结合蛋白亚型及可溶性蛋白亚型(sHLA-G)同样能抑制NK细胞及细胞毒性T细胞的溶细胞活性^[34]。Creput等^[35]报道HLA-G不仅抑制CD4⁺T细胞的增殖，并能诱导CD8⁺T细胞的凋亡，从而抑制细胞毒性T细胞的杀伤功能。

HLA-G还可抑制抗原提呈细胞的抗原递呈功能。以树突状细胞为例，Horuzsko等^[36-38]体内试验证明：HLA-G可抑制树突状细胞的分化成熟，从而抑制细胞免疫反应，使移植物存活时间延长。

Kanai等^[39]研究发现：HLA-G阳性细胞可激活外周血单核细胞，通过增加白细胞介素4、白细胞介素3、白细胞介素1的释放，同时降低γ-干扰素、肿瘤坏死因子α的表达，调节外周血单核细胞释放细胞因子的能力，诱导朝分泌Th2型细胞因子的转化^[40]，即Th2极化作用^[41]。故认为HLA-G致细胞因子分泌紊乱是引起机体免疫耐受的重要原因。

近年来研究显示，人脐带间充质干细胞可通过以下多种机制介导移植免疫耐受产生：①HLA-G蛋白直接或间接结合抑制性免疫球蛋白受体，传递抑制信号，进而抑制免疫细胞活性。②HLA-G还可通过直接与CD8⁺T细胞结合，导致被激活的CD8⁺T细胞发生Fas/FasL程序性死亡而除去同种异体反应性T细胞^[42-43]。③HLA-G可诱导免疫抑制性 T 细胞产生^[44]。④HLA-G表达能促进白细胞介素10的分泌，同时抑制γ-干扰素、肿瘤坏死因子α的分泌，有助于辅助性T细胞平衡Th2方向发展，诱导免疫耐受产生，并且这种免疫抑制作用呈白细胞介素10依赖性^[45]。但确切的机制仍在继续探索中。

课题组实验为人脐带间充质干细胞移植临床治疗心肌梗死提供了一定的理论和实验依据。结果显示：HLA-G在小月龄组人脐带间充质干细胞中表达强阳性，在足月组人脐带间充质干细胞中表达弱阳性或阴性。分别在兔心肌梗死模型上移植小月龄组人脐带间充质干细胞及足月组人脐带间充质干细胞，4周后可在心肌梗死区域发现标记的间充质干细胞。统计结果表明，相比于对照组，两组人脐带间充质干细胞均能显著减少心肌梗死面积(P < 0.01)，而相比于足月人脐带间充质干细胞组，小月龄组人脐带间充质干细胞更能显著促进梗死区新生毛细血管的生成，降低心肌纤维化程度，缩小心肌梗死面积(P < 0.05)，提示HLA-G含量较多的小月龄人脐带间充质干细胞能成为心肌细胞移植更理想的来源。因此推测：人脐带间充质干细胞移植免疫耐受在梗死区血运重建中发挥的作用可能由HLA-G介导产生所致，但HLA-G是否与前列腺素E2有共同的信号通路介导人脐带间充质干细胞免疫耐受产生?他们之间是否有共同促进表达的正反馈机制?是否还有其他机制发挥免疫抑制效应?仍需进一步深入研究。因此课题组下一步的计划：在体外环境下，小月龄组间充质干细胞分别在抗HLA-G抗体中和条件下和缺少抗体环境下与聚羟基脂肪酸酯刺激后的人外周血单个核细胞共培养，然后进行细胞增殖试验与前列腺素E2及白细胞介素10及γ-干扰素检测，进一步探索HLA-G免疫抑制效应可能发挥的作用与机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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不同月龄人脐带间充质干细胞移植梗死心肌的血运重建

Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells at different gestational age for myocardium revascularization after myocardial infarction

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