骨髓间充质干细胞在心血管疾病中的研究及应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.018

摘要/Abstract

中图分类号:

null

周岩，朴金花，金莲花，杨思睿. 骨髓间充质干细胞在心血管疾病中的研究及应用[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 112-117.

Zhou Yan, Piao Jin-hua, Jin Lian-hua, Yang Si-rui. null[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 112-117.

2.1 间充质干细胞的研究历史间充质干细胞属于成体干细胞的一种，是中胚层发育的早期细胞，不仅可以分化为造血实质和基质细胞，还可以分化为许多造血以外的组织，特别是中胚层和神经外胚层来源组织细胞。德国病理学家Cohnheim在1867年研究伤口愈合过程中，首次提出骨髓中存在间充质干细胞，表明骨髓具有造血以外的功能。Goujon在1869年发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了这一点。1987年Friendenstein等^[1]发现在塑料培养皿中贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20-30个培养周期后，

仍能保持多向分化潜能。因此把这种能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞称为间充质干细胞^[2]。1999年Pittenger等^[3]从髂骨骨髓样本中分离得到间充质干细胞，流式细胞术分析表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化诱导条件下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，并且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。骨髓间充质干细胞在培养分化过程中呈现出贴壁性、可塑性、异质性、自我更新、快速形成克隆、可移植性等生物学特征^[4]。间充质干细胞广泛存在于胎儿和成人的各种组织和脏器中，包括骨、软骨、脂肪和肌肉等^[5]，骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可以分离得到。骨髓间充质干细胞分离培养较为容易，且植入反应较弱，是一种良好的替代治疗的靶细胞。在组织器官损伤性疾病、组织器官退行性疾病、遗传缺陷疾病等领域具有重要的应用前景。

2.2 间充质干细胞在心血管疾病中的应用传统观念认为心肌细胞是分裂终末期细胞，在体内和体外都不能复制，没有增生和再生的能力。1994年，Soonpaa等^[6]将小鼠胚胎心肌细胞移植入成年小鼠心肌梗死模型中，结果证实移植的胚胎干细胞能够长期存活，改善心功能，并与宿主心肌细胞形成闰盘结构。1997年，Asahara等^[7]研究发现血管损伤后，循环内皮祖细胞具有促进新生血管形成的能力。2003年Beltrami 等^[8]报道心脏本身含有干细胞池，位于房间隔心尖处，但数量较少，这些驻心脏干细胞具有分化为心肌细胞，内皮细胞和平滑肌细胞的能力。以上研究打破了心肌细胞不能增生的传统观念，引入了细胞移植和心肌再生的概念。新的观念认为，心脏在心肌损伤后存在心肌细胞的增殖，但心肌的增殖程度极低，而且这种增殖是由已经存在的成熟心肌细胞启动的，还是由局部的干细胞引发的，仍是一个未知领域。

2.3 治疗心血管疾病的干细胞目前用于治疗心血管疾病的细胞主要有胚胎干细胞、胚胎心脏细胞、驻心脏干细胞、平滑肌细胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓造血干细胞、骨髓基质细胞和骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞及肝干细胞等。胚胎干细胞由于来源有限、取材困难、免疫排斥反应、伦理问题以及容易形成肿瘤组织等问题，应用受限^[9]。驻心脏干细胞数量少，再生能力有限^[10]。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，在生理和病理条件下能够修复损伤的血管内皮细胞，对维持血管内皮细胞的完整性极其重要。内皮祖细胞主要分化为新生血管，可以防止心肌细胞凋亡及左室重构，从而维护心功能^[11]。骨骼肌卫星细胞不能与受体心肌细胞形成闰盘连接，因而不能整和至受体心肌细胞群中形成生理功能合胞体，容易引起心律失常^[12]。神经干细胞和肝干细胞在实验条件下转化为心肌的效率很低^[13]。

众多研究表明，骨髓来源的干细胞可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。1995年，Wakitani等^[14]首先证实骨髓间充质干细胞在体外经5-氮杂胞苷诱导后分化成心肌样细胞，分化率约为30%。1999年Makino等^[15]研究表明骨髓间充质干细胞在体外经5-氮杂胞苷诱导后能产生自主收缩的具有肌管结构的细胞团，显微镜下类似胚胎心肌细胞结构，含有心肌特异性收缩蛋白及闰盘蛋白，表达心肌特异性结构蛋白基因如α、β肌球蛋白重链基因，以及心肌细胞特异性转录因子GATA4、Nkx2.5/Csx，电生理检查显示类似心肌细胞的动作电位。2000年Wang等^[16]将未经药物诱导的间充质干细胞直接移植入大鼠心肌组织中，4周后发现经标记的间充质干细胞分化成了心肌细胞，表达心脏表型，并与周围心肌细胞形成缝隙连接而同步收缩，从而证实依赖心脏本身特殊的微环境也可促使其分化为心肌细胞。干细胞移植治疗心肌梗死的研究众多。1994年，Soonpaa等将小鼠胚胎心肌细胞移植入成年小鼠心肌梗死模型中，结果证实移植的胚胎干细胞能够长期存活，改善心功能，并与宿主心肌细胞形成闰盘结构。2001年Strauer等^[17]报道将10例接受过标准治疗的心肌梗死患者，利用导管经冠状动脉进行了自体骨髓单个核细胞移植，3个月后移植组的梗死区面积明显下降，梗死区的室壁运动速度明显上升，左心室的收缩末期容积、收缩率、梗死区的灌注均有显著改善。自2000年后骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病的临床应用研究开始蓬勃发展^[18]。众多的研究表明骨髓间充质干细胞可以在梗死的心肌中分化形成有功能活性的心肌、血管内皮等组织，改善心脏的功能，干细胞移植在治疗急性心肌梗死方面已表现出传统治疗方法所无可比拟的优越性。而关于骨髓间充质干细胞治疗非缺血性心血管疾病如心肌病等的相关研究较少。各种非缺血性心血管疾病终末期出现心力衰竭，病理上表现为心肌细胞进行性减少，被纤维组织代替，心脏功能逐渐衰竭，干细胞在这方面的治疗也逐渐受到人们的重视。法国学者Agbulut等2003年第1次报道了将骨髓细胞移植到阿霉素诱导的急性非缺血性心肌病小鼠模型后的细胞分化情况。结果证实骨髓细胞移植到非缺血性心肌病也可以向心肌细胞发生转化^[19]。2004年Nagaya等^[20]研究发现植入扩张型心肌病大鼠心肌的部分骨髓间充质干细胞表达心肌细胞的标志。移植的骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞、内皮细胞及分泌大量促血管生成生长因子、抗凋亡因子及有丝分裂因子，并增加了心肌局部毛细血管密度，降低胶原容积分数，抑制心肌纤维化，从而提高了扩张型心肌病的心脏功能。Nagaya等^[21]对扩张型心肌病大鼠进行了骨髓间充质干细胞移植，移植后8周发现移植的骨髓间充质干细胞表达心肌表型如肌球蛋白重链、收缩蛋白、连接蛋白43等，移植组大鼠心功能明显改善。陈蓉等^[22]静脉移植骨髓间充质干细胞治疗阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠，提高血管内皮生长因子水平，促进心肌毛细血管新生，减少胶原纤维，改善心功能。王建安等^[23]对23例原发性扩张型心肌病患者，经冠状动脉内移植自身骨髓间充质干细胞治疗，结果表明可降低扩张型心肌病患者血浆B型利钠肽水平，在一定程度上增加运动耐量，无明显的致心律失常、栓塞和免疫炎症反应。同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度改善扩张型心肌病模型兔心功能，减轻病理损害，并可能抑制心电紊乱的进一步发展^[24]。骨髓间充质干细胞治疗扩张型心肌病的研究目前还较少，所以骨髓间充质干细胞移植治疗的效果和安全性仍需要进一步的客观评价。

2.4 干细胞归巢器官损伤和高水平的循环干细胞是动员各种内源干细胞治疗心脏病的两个重要影响因素。机体存在的潜在能够修复心脏损伤的干细胞主要有骨髓来源的干细胞，包括造血干细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、心肌干细胞。正常情况下，外周血循环中仅有极少量干细胞，当心脏损伤时，由于各种细胞因子、可溶性受体、黏附分子等可动员骨髓干细胞到外周血，使外周血循环中的干细胞有所增加，但仍不足以修复受损心肌^[25]。应用干细胞动员剂动员骨髓干细胞，能够提高外周血中的干细胞数量，促进其向梗死心肌归巢及进一步分化、修复，达到再生心肌和改善心功能的目的。目前干细胞动员剂可分为3种^[26]：①作用于干细胞和早期祖细胞的造血细胞生长因子，如干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素6及白细胞介素11等。②多系祖细胞刺激因子，如白细胞介素3及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。③作用于晚期祖细胞的生长因子，如促红细胞生成素、粒细胞刺激因子、单核细胞刺激因子、白细胞介素5及血小板生成素。此外，他汀类药物亦可作为骨髓干细胞动员剂。目前仅有粒细胞刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子被国际批准可应用于临床。总之，心肌损伤后的炎症反应是干细胞归巢的先决条件，干细胞归巢于受损心肌是机体潜在的修复机能。只是在正常情况下，这种修复机制很弱，而提高外周血干细胞数量可促进归巢，促进组织修复。目前干细胞动员治疗结果并不令人满意，故需要建立干细胞移植的治疗方法^[27]。

2.5 骨髓间充质干细胞治疗心血管疾病的机制骨髓间充质干细胞能够分化为心肌细胞，增加心肌数量、增强心肌收缩力、修复坏死心肌；骨髓间充质干细胞可以分化为血管内皮细胞、促进血管再生，在梗死部位形成新生毛细血管，重建梗死部位血运，增加缺血区的灌注，减少梗死范围；骨髓间充质干细胞能分泌多种细胞因子、生长因子以及细胞信号肽防止细胞死亡，如单核细胞趋化蛋白21、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2、白细胞介素26、血管生成素等，这些因子具有促进血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖，发挥促血管生成的作用。有研究表明移植的骨髓间充质干细胞能上调血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板源性生长因子、血管生成素、胰岛素样生长因子等分泌，促进血管生成，此外还分泌基质金属蛋白酶2，9、肾上腺髓质素、白细胞抑制因子、结合蛋白C、B型利钠肽等并可以下调凋亡前体蛋白BAX的表达，起到抗细胞凋亡的作用；骨髓间充质干细胞能够改善细胞外基质，下调梗死心肌Ⅰ型胶原酶、基质金属蛋白酶抑制剂的表达，调节梗死局部胶原代谢，促进胶原降解，减少胶原沉积，减轻心肌纤维化程度，抑制心室扩张和梗死后心室重构，改善心功能，此外植入的骨髓间充质干细胞在心肌细胞的微环境中，亦能够与邻近的心肌细胞产生电机械偶联，与宿主心肌发生同步收缩；骨髓间充质干细胞不仅免疫原性弱，还可能具有抑制局部免疫反应的作用，可能与其分泌一些可溶性因子有关^[28-33]。Guo等^[34]在大鼠急性心肌梗死模型中移植骨髓间充质干细胞后发现心肌组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6等炎症因子表达减少，心肌细胞凋亡减少、重构改善、心脏功能得到明显改善。Ohnishi等^[35]制作大鼠急性心肌炎模型并移植骨髓间充质干细胞，发现移植后心肌组织单核细胞趋化蛋白1明显减少，炎症细胞浸润也相应减少，提示骨髓间充质干细胞移植具有一定抗炎作用。

2.6 骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的机制目前动物体内实验证明，心肌微环境中的各种因素为骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化提供了关键的信号，即“环境诱导分化”。包括化学性因素和物理性因素。化学因素包括细胞因子、激素、离子梯度和其他可溶性因子，其中一些可溶性化学因子可从心肌细胞中提取而来，心肌条件培养基就含有相关的可溶性化学因子。物理性因素可能包括细胞间的直接/间接接触^[36]，刚性细胞外基质，流体剪切应力和机械张力等^[37]。此外基因水平调控也起着关键作用。在体外骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷、碱性成纤维细胞生长因子、两性霉素等诱导均可以向心肌细胞分化。其中5-氮杂胞苷是目前公认的可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的药物。研究表明，5-氮杂胞苷是胞嘧啶核苷的一个类似物，是一种去甲基化药物，可引起DNA中某些胞嘧啶的低甲基化，从而使控制向心肌分化的特定调控基因阻遏蛋白去甲基化而发生构型改变，促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。干细胞能在不同的环境及生长因子作用下发生定向分化，其中微环境是诱导干细胞分化的关键因素。因此也有研究在体外模拟心肌微环境，可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞。如通过体外心肌细胞与骨髓间充质干细胞共同培养、添加心肌细胞裂解液、添加心肌细胞条件培养液等体外模拟心肌微环境的方法均可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞^[38-39]。袁岩等^[40]通过向骨髓间充质干细胞培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法，体外模拟心肌微环境，观察骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导作用，并与诱导分化剂5-氮杂胞苷比较。结果显示心肌细胞裂解液是体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的理想条件，优于传统的5-氮杂胞苷，在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。研究表明心肌细胞裂解液在体外模拟心肌微环境可诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞，表达心肌细胞特异性的分泌蛋白及受体和具有受体后活性的信号转导通路。刘建华等^[41]研究表明，单纯使用急性心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，但急性心肌梗死血清能促进5-氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并促进分化的心肌细胞成熟。文献报道，在心脏的微环境内，骨髓间充质干细胞能分化出心肌细胞，并表达心肌细胞的功能表型^[42]。

参考文献

[1] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987;20(3):263-272.

[2] 裴雪涛.干细胞生物学[M].北京:科学出版社,2003.

[3] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science. 1999;284(5411):143-147.

[4] 胡资兵,曾荣,郭伟韬,等.骨髓间充质干细胞诱导分化特征[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(43):8561-8566.

[5] Sensebé L, Bourin P. Mesenchymal stem cells for therapeutic purposes. Transplantation. 2009;87(9 Suppl):S49-53.

[6] Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG,et al. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science. 1994;264(5155):98-101.

[7] Asahara T, Murohara T, Sullivan A,et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science. 1997; 275(5302):964-967.

[8] Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D,et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 2003;114(6):763-776.

[9] Dai W, Field LJ, Rubart M,et al. Survival and maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes in rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 2007;43(4):504-516.

[10] Ballard VL, Edelberg JM. Stem cells for cardiovascular repair -the challenges of the aging heart. J Mol Cell Cardiol. 2008; 45(4):582-592.

[11] Marsboom G, Janssens S. Endothelial progenitor cells: new perspectives and applications in cardiovascular therapies. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2008;6(5):687-701.

[12] Dib N, Michler RE, Pagani FD,et al. Safety and feasibility of autologous myoblast transplantation in patients with ischemic cardiomyopathy: four-year follow-up. Circulation. 2005; 112 (12):1748-1755.

[13] Anderson PA, Muller-Borer BJ, Esch GL,et al. Calcium signals induce liver stem cells to acquire a cardiac phenotype. Cell Cycle. 2007;6(13):1565-1569.

[14] Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 1995;18(12):1417-1426.

[15] Makino S, Fukuda K, Miyoshi S,et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest. 1999;103(5):697-705.

[16] Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J,et al. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000;120(5):999-1005.

[17] Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Intracoronary, human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction. Dtsch Med Wochenschr. 2001;126(34-35):932-938.

[18] Assmus B, Fischer-Rasokat U, Honold J,et al. Transcoronary transplantation of functionally competent BMCs is associated with a decrease in natriuretic peptide serum levels and improved survival of patients with chronic postinfarction heart failure: results of the TOPCARE-CHD Registry. Circ Res. 2007; 100(8):1234-1241.

[19] Agbulut O, Menot ML, Li Z,et al. Temporal patterns of bone marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin-induced cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2003; 58(2):451-459.

[20] Nagaya N, Fujii T, Iwase T,et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004;287(6): H2670-2676.

[21] Nagaya N, Kangawa K, Itoh T,et al. Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy. Circulation. 2005;112(8): 1128-1135.

[22] 陈蓉,张国辉,蒋世忠,等.骨髓间充质干细胞静脉移植对扩张型心肌病大鼠毛细血管生成的影响[J].中国微循环,2009,13(3):161- 165.

[23] 王建安,谢小洁,何红,等.骨髓间质干细胞移植治疗原发性扩张型心肌病的疗效与安全性[J]. 中华心血管病杂志,2006,34(2): 107-110.

[24] 余更生,沈兴,田杰,等. 同种异体骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病模型兔心功能与结构及电生理的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(34):6776-6780.

[25] Ip JE, Wu Y, Huang J,et al. Mesenchymal stem cells use integrin beta1 not CXC chemokine receptor 4 for myocardial migration and engraftment. Mol Biol Cell. 2007;18(8):2873-2882.

[26] 蔡继锐,刘仁光.骨髓干细胞动员治疗急性心肌梗死研究进展[J]. 中国心血管病研究杂志,2006,4(3):225-228.

[27] Novotny NM, Ray R, Markel TA,et al. Stem cell therapy in myocardial repair and remodeling. J Am Coll Surg. 2008; 207(3): 423-434.

[28] Ebelt H, Jungblut M, Zhang Y,et al. Cellular cardiomyoplasty: improvement of left ventricular function correlates with the release of cardioactive cytokines.Stem Cells. 2007;25(1): 236-244.

[29] Reffelmann T, Dow JS, Dai W,et al. Transplantation of neonatal cardiomyocytes after permanent coronary artery occlusion increases regional blood flow of infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2003;35(6):607-613.

[30] Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ,et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med. 2001;7(4):430-436.

[31] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S,et al. Bone marrow stem cells regenerate infarcted myocardium. Pediatr Transplant. 2003;7 Suppl 3:86-88.

[32] Dohmann HF, Perin EC, Takiya CM,et al. Transendocardial autologous bone marrow mononuclear cell injection in ischemic heart failure: postmortem anatomicopathologic and immunohistochemical findings.Circulation. 2005;112(4): 521-526.

[33] Kawasuji M.Cell transplantation for cardiac repair. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 2006;12(1):1-3.

[34] Guo J, Lin GS, Bao CY,et al. Anti-inflammation role for mesenchymal stem cells transplantation in myocardial infarction. Inflammation. 2007;30(3-4):97-104.

[35] Ohnishi S, Yanagawa B, Tanaka K,et al. Transplantation of mesenchymal stem cells attenuates myocardial injury and dysfunction in a rat model of acute myocarditis. J Mol Cell Cardiol. 2007;42(1):88-97.

[36] Fukuhara S, Tomita S, Yamashiro S,et al. Direct cell-cell interaction of cardiomyocytes is key for bone marrow stromal cells to go into cardiac lineage in vitro. J Thorac Cardiovasc Surg. 2003;125(6):1470-1480.

[37] Park JS, Huang NF, Kurpinski KT,et al. Mechanobiology of mesenchymal stem cells and their use in cardiovascular repair. Front Biosci. 2007;12:5098-5116.

[38] Liu XN, Yin Q, Zhang H,et al. Tissue extracts from infarcted myocardium of rats in promoting the differentiation of bone marrow stromal cells into cardiomyocyte-like cells. Biomed Environ Sci. 2008;21(2):110-117.

[39] Ge D, Liu X, Li L, et al. Chemical and physical stimuli induce cardiomyocyte differentiation from stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2009;381(3):317-321.

[40] 袁岩,陈连凤,张抒扬,等.心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究[J].中华心血管病杂志,2005, 33(2):170-173.

[41] 刘建华,洪亮,钟雪云,等.心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响[J].中国组织工程临床研究与临床康复,2009,13(14):2797-2800.

[42] Nassiri SM, Khaki Z, Soleimani M,et al. The similar effect of transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells with or without prior differentiation induction in experimental myocardial infarction. J Biomed Sci. 2007;14(6):745-755.