人类白细胞抗原基因分型与微珠反应格局

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.53.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：Flow-rSSO结合流式细胞分析技术和PCR-SSO技术的高通量分型方法，是目前国外人类白细胞抗原分型中应用最多的方法。
目的：筛选同组不同等位基因之间的微珠反应格局，加强人类白细胞抗原基因分型方法的标准化，使分型向最快最准确的方向发展。
方法：使用TECAN DNA全自动工作站从457份中华骨髓库捐献者全血样本中提取基因组DNA，DNA样本用One Lambda rSSO HLA-A、B和DRB1基因分型高分试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测。参考One Lambda公司提供等位基因微珠格局表(HLA-A, B and DRB1)分析常见等位基因，并对常见等位基因与微珠的相关性进行研究。
结果与结论：同一组常见等位基因除相同微珠反应格局外，与某个或某几个有区别的微珠是密切相关的。就临床组织器官移植而言，采用中分辨度DNA分型技术是最佳选择，一方面有利于快速筛选，另一方面能够降低匹配难度。就科研工作而言，一般采用高分辨率分型方法。

关键词: 基因组DNA, 全血, 中华骨髓库, HLA基因分型

Abstract:

BACKGROUND: Flow-rSSO in combination with flow cytometry and PCR-SSO with high throughout subtyping are the most commonly used methods for human leucocyte antigen (HLA) genotyping at present in the countries outside China.
OBJECTIVE: To select the beads reaction patterns of different alleles in the same group and standardize the HLA genotype method, hopefully to require a more specific and rapid genotype development.
METHODS: Genomic DNA was extracted automatically from 457 blood samples using TECAN DNA workstation. Each DNA sample was subjected to PCR amplification, molecular hybridization and Luminex magnetic beads analysis using One lambada rSSO HLA-A, B and DRB1 commercial kit. With reference to the HLA-A, B and DRBI provided by One Lambda Inc., the common alleles were analyzed and the correlation between common alleles and beads was studied.
RESULTS AND CONCLUSION: The common alleles in the same group are closely related to a certain or some different beads except the same beads reaction situation. To the organ transplantation in the clinic, the adoption of DNA genotype of middle resolution is the best choice. It not only contributes to quick screening, but also reduces the difficulty of matching. The high resolution genotype is commonly adopted in research work.

中图分类号:

R318

王大明，何柳媚，张红，魏天莉，李茜，邹红岩. 人类白细胞抗原基因分型与微珠反应格局　[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(53): 9960-9964.

Wang Da-ming, He Liu-mei, Zhang Hong, Wei Tian-li, Li Qian, Zou Hong-yan. Human leucocyte antigen genotyping and beads reaction patterns[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(53): 9960-9964.

参考文献

引言

材料方法

讨论

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，HLA基因分型技术不断完善，出现了多种检测方法，并且高通量的HLA分型技术也不断涌现。PCR-SSP、PCR-SSO和PCR-SBT方法是目前国际组织相容性协作组(IHWG1的推荐方法，PCR-SBT方法被誉为HLA分型的金标准^[6] ，但由于其成本昂贵、技术复杂而在中华骨髓库常规分型中较少使用^[7] 。本中心检测骨髓库标本时使用的Flow-rSSO是一种结合流式细胞分析技术和PCR-SSO技术的高通量HLA分型方法，是目前国外HLA分型中应用最多的方法[8]。
对PCR扩增产物采用系列标记寡核苷酸探针杂交而建立的探针杂交技术(PCR-SSO)是目前较常用的DNA分型技术，此为One Lambda rSSO HLA-A、B和DRB1基因分型高分试剂盒的DNA分型技术。One Lambda公司推出可利用DNA检测HLA特异性的试剂盒(序列微珠综合分析实验系统，Lambda array beads multi-analytic system，LABMASTM)，由众多个混合于同一悬浮液中的彩色微球体组成，微球体表面包被的SSO特异性探针可与单链DNA特异性结台，经彩色荧光素染色后，通过流式细胞仪即可测得HLA的基因型。LABMASTM的实验原理同反向PCR-SSOP，其优点有：自动化的检测系统有效地减少了人为误差，增加了结果准确性；1个反应管中混合有100个不同的SSO探针，极大的减少了工作量和试剂耗费量；检测结果客观、快速，另外与普通流式细胞术不同的是该方法不需新鲜标本，利用DNA作为实验原料，可以随时根据要求检测或进行回顾性研究。由于以上优点，该系统更加适合脐血库和骨髓库的大量配型要求^[9] 。
中国汉族人群常见的高频率分布的等位基因为A*1101、A*2402、A*0207 、A*0201和A*3303。中国汉族人群HLA-A等位基因分布与其他人群的比较， A*1101，2402和3303在中国人群中有较高分布，与其他亚洲人群相似，但与美国黑人，欧洲人群和西班牙裔人则有较大差别，而A*0207，0203在中国及其他亚洲人群中都有较高分布，但在其他地区人群中则非常罕见^[10] 。HLA-A*24组除HLA-A*2402外，其余基本上只存在于亚洲人群中。在先前的已有报道的南方汉族^{[2 ]} 、北方汉族^[11] 、台湾人^[12] 、基诺族^[13] 、佤族^[13] 、毛南族^[10] 、傈傈族^[14] 、怒族和门巴族等中国人群一样^[14-15] ，A*1101为最常见型。
因为本文表格仅列出每组等位基因之间有区别的微珠反应格局，所以，从表1中，可看出HLA-A*11组中，A*110201和A*110301除34和82号微珠与A*110101有相同的反应格局。HLA-A*33组中，除91号之外，A*330101和A*330301具有相同的微珠反应格局。在HLA-A*02组中，A*0207和A*0210在50号珠为阳性，同组其他等位基因为阴性，A*0207和A*0210在19、20和77号微珠上有不同的反应格局。同理，HLA-A*24组的等位基因的反应格局见表1。
在中国汉族人群和亚洲人群中HLA-B位点频率较高的5种常见等位基因为B*4001，B*4601，B*5801，B*1502，B*1301。除B*4001外，B*4601、B*5502、B*3802、B*1527、B*1511、B*4003和B*1529在美国黑人，欧洲人群和西班牙裔人群中都比较少见[16]。在HLA-B*13组中，B*1301和B*130201除60号微珠外具有相同的反应格局。同理，HLA-B*40、B*55、B*35、B*48、B*27、B*56和B*15组的等位基因的反应格局见表2和表3。HLA-DRB1*0901在中国汉族人群、亚洲人群和美国黑人中都分布较高，在欧洲人群和西班牙裔人中则比较少见。HLA-DRB1* 1501在各个人群中都出现频率较高，尤其在欧洲人群中。在各地区分布频率都很高的HLA-DRB1*0701在中国汉族人群中则相对较少。在中国汉族人群中检测出的HLA-DRB1*1454和1218在其他人群中未见报道^[16] 。从表4和表5中，可见HLA-DRB1*01组中，DRB1*010101和DRB1*010201之间除1号、18号、51号和55号微珠外具有相同的反应格局。HLA-DRB1*11组中，DRB1*110101、DRB1*110401和DRB1*110601在1号、25号、55号、83号和89号微珠上有不同的反应格局。同理，HLA-DRB1*08、DRB1* 14、DRB1*15、DRB1*04和DRB1*12组等位基因有区别磁珠的反应格局见表4和表5。
随着中华骨髓库高分结果入库的逐年增多，既要保证结果入库的数量又要保证准确性，进行相关的总结是极其必要的，以上总结在分析和复核结果时都有着非常重要的意义。就临床组织器官移植而言，采用中分辨度DNA分型技术是最佳选择，一方面有利于快速筛选，另一方面能够降低匹配难度，因为过细的分型结果不但增加了分型所需的时间和经费，也加大了寻找匹配者的难度；就科研工作而言，一般采用高分辨率分型方法^[17] 。但是，随着各学科之间的渗透与交叉，加强HLA基因分型方法的标准化，使分型向最快最准确的方向发展，将有助于推动HLA的相关研究和各领域研究成果的相互借鉴^[18-19] 。

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