雷公藤甲素缓解过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的线粒体动力学机制

doi:10.12307/2026.892

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (34): 8986-8993.doi: 10.12307/2026.892

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雷公藤甲素缓解过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的线粒体动力学机制

穆秉桃1，郭敏芳1，胡芬琦1，刘淇源1，贾辉1，徐明源1，陈佳媛2，张慧宇1，孟涛1，尉杰忠1，3

1山西大同大学脑科学研究所/分子细胞免疫学大同市重点实验室，山西省大同市 037009；2山西中医药大学，山西省晋中市 030619；3山西大同大学附属第一医院/大同市第五人民医院，山西省大同市 037009

收稿日期:2025-08-14 修回日期:2026-02-26 出版日期:2026-12-08 发布日期:2026-04-14
通讯作者: 尉杰忠，博士，教授，博士生导师，山西大同大学脑科学研究所/分子细胞免疫学大同市重点实验室，山西省大同市 037009；山西大同大学附属第一医院/大同市第五人民医院，山西省大同市 037009
作者简介:穆秉桃，女，1976年生，山西省大同市人，汉族，2011年青海大学医学院毕业，硕士，副教授，主要从事神经系统疾病方面的研究。
基金资助:
大同市基础研究计划项目(2024063)，项目负责人：穆秉桃；大同市平台计划项目(2024093)，项目负责人：孟涛；山西省基础研究计划项目(20210302123476)，项目负责人：郭敏芳；山西省基础研究计划项目(20210302123478)，项目负责人：张慧宇；中医药重点研究室项目单位(zyyyjs2024027)：中医药防治痴呆疾病重点研究室，项目负责人：尉杰忠；山西省中医药科研课题计划项目(2023ZYYB2042)，项目负责人：尉杰忠

Mitochondrial kinetic mechanism by which triptolide alleviates hydrogen peroxide-induced apoptosis in SH-SY5Y cells

Mu Bingtao1, Guo Minfang1, Hu Fenqi1, Liu Qiyuan1, Jia Hui1, Xu Mingyuan1, Chen Jiayuan2, Zhang Huiyu1, Meng Tao1, Yu Jiezhong1, 3#br#

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1Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; 2Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 3Datong Fifth People's Hospital, Shanxi Datong University, 037009, Shanxi Province, China

Received:2025-08-14 Revised:2026-02-26 Online:2026-12-08 Published:2026-04-14
Contact: Wei Jiezhong, PhD, Professor, Doctoral supervisor, Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; Datong Fifth People's Hospital, Shanxi Datong University, 037009, Shanxi Province, China
About author:Mu Bingtao, MS, Associate professor, Institute of Brain Science/Key Laboratory of Molecular Cellular Immunology in Datong, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
Research Project of Datong City Basic Research Program, No. 2024063 (to MBT); Research Project of Datong City Platform Research Program, No. 2024093 (to MT); Research Project of Shanxi Province Basic Research Program, No. 20210302123476 (to GMF); Research Project of Shanxi Province Basic Research Program, No. 20210302123478 (to ZHY); Project Unit of Key Research Laboratory of Traditional Chinese Medicine: Key Research Laboratory of Traditional Chinese Medicine for the Prevention and Treatment of Dementia, No. zyyyjs2024027 (to YJZ); Shanxi Province Traditional Chinese Medicine Research Project, No. 2023ZYYB2042 (to YJZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
雷公藤甲素：从中药雷公藤中提取的二萜内酯化合物，具有抗炎、抑制氧化应激、调节免疫、抗肿瘤及神经保护等作用。
线粒体动力平衡：线粒体是产生活性氧的主要场所，线粒体通过融合与分裂维持动态平衡，以适应细胞的能量需求和环境变化。

背景：课题组前期研究发现雷公藤甲素对神经细胞有保护作用，可以改善神经退行性疾病症状，但其是否通过改善线粒体动力学异常发挥作用尚需进一步探究。
目的：探索雷公藤甲素调控线粒体融合分裂平衡改善过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用及机制。
方法：培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，分为对照组、模型组(200 μmol/L过氧化氢)和雷公藤甲素组(2.5 nmol/L雷公藤甲素+200 μmol/L过氧化氢)，干预24 h后检测氧化应激指标超氧化物歧化酶和丙二醛水平、线粒体膜电位、细胞凋亡水平；Western blot检测凋亡相关蛋白、线粒体动力相关蛋白和呼吸链相关蛋白的表达，免疫荧光染色法检测磷酸化发动蛋白相关蛋白1、视神经萎缩症蛋白1、细胞色素C氧化酶1和ATP合酶F1亚基α表达。
结果与结论：与对照组相比，模型组超氧化物歧化酶活性、线粒体膜电位、抗凋亡蛋白Bcl-2、线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2、视神经萎缩症蛋白1以及泛醌氧化还原酶亚基B8、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2、细胞色素C氧化酶1、琥珀酸脱氢酶B、ATP合酶F1亚基α表达均显著降低(P < 0.05)；而丙二醛水平、促凋亡蛋白Bax和Caspase-3、线粒体分裂蛋白1、磷酸化发动蛋白相关蛋白1表达以及细胞凋亡率均显著增高(P < 0.05)；与模型组相比，雷公藤甲素干预能降低丙二醛水平，提高超氧化物歧化酶活性和线粒体膜电位，促进融合蛋白表达，抑制分裂蛋白表达，提高氧化磷酸化复合蛋白水平，降低细胞凋亡率(P < 0.05)。以上结果证实，雷公藤甲素可调控线粒体动力失衡缓解过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

https://orcid.org/0009-0003-5173-2404(穆秉桃)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 雷公藤甲素, 氧化应激, 神经元, 细胞凋亡, 线粒体动力平衡, 氧化磷酸化

Abstract: BACKGROUND: Previous studies from our group have shown that triptolide exerts protective effects on nerve cells and alleviates symptoms of neurodegenerative diseases. However, whether it acts by improving mitochondrial dynamic abnormalities requires further investigation.
OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of triptolide in regulating the mitochondrial fusion-fission balance to mitigate hydrogen peroxide (H₂O₂)-induced apoptosis in SH-SY5Y cells.
METHODS: Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were cultured and divided into three groups: control group, model group (200 μmol/L H₂O₂), and triptolide group (2.5 nmol/L triptolide + 200 μmol/L H₂O₂). After 24 hours of intervention, oxidative stress markers (superoxide dismutase activity and malondialdehyde levels), mitochondrial membrane potential, and apoptotic rate were measured. Western blot was used to detect the expression of apoptosis-related proteins, mitochondrial dynamics-related proteins, and respiratory chain-related proteins. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of phospho-dynamin-related protein 1, optic atrophy protein 1, cytochrome c oxidase 1, and ATP synthase F1 subunit α.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the model group showed significantly decreased superoxide dismutase activity, mitochondrial membrane potential, and expression levels of anti-apoptotic protein Bcl-2, mitochondrial fusion protein 1, mitochondrial fusion protein 2, optic atrophy protein 1, and ubiquinone oxidoreductase subunit B8, panthenol-cytochrome C reductase core protein 2, cytochrome C oxidase 1, succinate dehydrogenase B, and ATP synthase F1 subunit α (P < 0.05). In contrast, malondialdehyde levels, expression of pro-apoptotic proteins (Bax, Caspase-3) and mitochondrial fission protein 1 and phospho-p161, and apoptotic rate were significantly increased (P < 0.05). Compared with the model group, triptolide intervention reduced malondialdehyde levels, increased superoxide dismutase activity and mitochondrial membrane potential, promoted the expression of fusion proteins, suppressed the expression of fission proteins, elevated the levels of oxidative phosphorylated complex protein, and decreased the apoptotic rate (P < 0.05). These results confirm that triptolide can alleviate H₂O₂-induced apoptosis in SH-SY5Y cells by regulating mitochondrial dynamic imbalance.

Key words: triptolide, oxidative stress, neuron, apoptosis, mitochondrial dynamic balance, oxidative phosphorylation

中图分类号:

穆秉桃, 郭敏芳, 胡芬琦, 刘淇源, 贾辉, 徐明源, 陈佳媛, 张慧宇, 孟涛, 尉杰忠. 雷公藤甲素缓解过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的线粒体动力学机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(34): 8986-8993.

Mu Bingtao, Guo Minfang, Hu Fenqi, Liu Qiyuan, Jia Hui, Xu Mingyuan, Chen Jiayuan, Zhang Huiyu, Meng Tao, Yu Jiezhong. Mitochondrial kinetic mechanism by which triptolide alleviates hydrogen peroxide-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(34): 8986-8993.

图/表（结果） 5

2.1 过氧化氢最佳浓度的确定如图1所示，过氧化氢浓度在100，150 μmol/L时，细胞活力即有所下降，随着过氧化氢浓度增大，200 μmol/L过氧化氢干预后细胞活力明显下降(P < 0.01)，当浓度增至400，450 μmol/L时，细胞活力更低(P < 0.000 1)，参考文献[21-22]，确定200 μmol/L为过氧化氢干预浓度。
2.2 雷公藤甲素药物浓度的确定如图2A所示，雷公藤甲素浓度为2.5 nmol/L时细胞活力最高；与0 nmol/L雷公藤甲素相比，当雷公藤甲素浓度达到20 nmol/L时，细胞存活率开始下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，对细胞产生一定的毒性作用；如图2B

所示，用2.5 nmol/L雷公藤甲素干预过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞，细胞存活率较模型组显著升高(P < 0.001)，可见雷公藤甲素对细胞有保护作用。后续实验均选用2.5 nmol/L雷公藤甲素干预SH-SY5Y细胞。
2.3 雷公藤甲素改善了过氧化氢诱导的氧化应激状态超氧化物歧化酶活性间接反映机体清除活性氧的能力，如图3所示，模型组的超氧化物歧化酶活性较对照组显著下降(P < 0.01)，雷公藤甲素组超氧化物歧化酶活性较模型组显著上升(P < 0.05)；丙二醛水平可以直接提示氧化损伤程度，模型组丙二醛水平较对照组显著升高(P < 0.01)；雷公藤甲素组丙二醛水平较模型组显著降低(P < 0.05)。
2.4 雷公藤甲素提高了过氧化氢诱导的线粒体膜电位水平如图4所示，红色荧光提示线粒体膜电位正常，绿色荧光增强提示线粒体膜电位下降，细胞开始凋亡，常用绿/红荧光比值表示膜电位水平，比值越高，膜电位水平越低，呼吸链受损越重。与对照组相比，模型组的绿/红荧光比值明显升高(P < 0.001)；与模型组相比，雷公藤甲素组的绿/红荧光比值明显下降(P < 0.001)，说明雷公藤甲素改善了线粒体呼吸功能，减少细胞凋亡。
2.5 雷公藤甲素抑制了过氧化氢诱导的细胞凋亡如图5所示，与对照组相比，模型组促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3表达及细胞凋亡率都显著升高(P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01)，

抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，雷公藤甲素组抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著升高(P < 0.05)，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3表达及细胞凋亡率显著降低(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01)。
2.6 雷公藤甲素促进过氧化氢诱导的线粒体融合且抑制分裂如图6所示，与对照组相比，模型组线粒体分裂蛋白1和磷酸化发动蛋白相关蛋白1表达显著升高(P < 0.01，P < 0.01)；线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2和视神经萎缩症蛋白1表达显著降低(P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05)；与模型组相比，雷公藤甲素组线粒体分裂蛋白1和磷酸化发动蛋白相关蛋白1表达显著降低(P < 0.01，P < 0.01)，线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2和视神经萎缩症蛋白1表达显著增高(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.05)。上述结果表明雷公藤甲素通过促进过氧化氢诱导的线粒体融合，抑制分裂，调控线粒体动力平衡。

2.7 雷公藤甲素促进过氧化氢诱导的线粒体氧化呼吸链复合蛋白表达如图7A，B所示，Western blot结果显示，与对照组相比，模型组泛醌氧化还原酶亚基B8、琥珀酸脱氢酶B、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2、细胞色素C氧化酶1和ATP合酶F1亚基α蛋白表达显著降低(P均< 0.05)；与模型组相比，雷公藤甲素组泛醌氧化还原酶亚基B8、琥珀酸脱氢酶B、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2、细胞色素C氧化酶1和ATP合酶F1亚基α蛋白表达显著升高(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05)。如图7C-F所示，免疫荧光结果显示，与对照组相比，模型组ATP合酶F1亚基α和细胞色素C氧化酶1表达显著降低(P < 0.01，P < 0.000 1)；与模型组相比，雷公藤甲素组ATP合酶F1亚基α和细胞色素C氧化酶1表达显著升高(P < 0.05，P < 0.001)。上述结果表明雷公藤甲素恢复了过氧化氢诱导的线粒体氧化磷酸化水平。

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引言

神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化病等的共同特征是多种病因交互作用导致中枢神经元功能渐进性恶化丧失，出现认知、行为和运动功能障碍，目前仍无有效的临床治疗措施[1-2]。研究表明，氧化应激和线粒体功能障碍是造成神经元损伤的关键因素[3]。线粒体是细胞的“能量工厂”，通过氧化磷酸化过程将营养物质转变成ATP，并产生一定量活性氧，通常由超氧化物歧化酶等抗氧化酶中和。在细胞质中，线粒体需通过不断分裂、融合的高度动态变化来保障各项正常生理功能[4]。大脑神经活动对能量需求很高，几乎全部依靠线粒体氧化供能，而脑内脂质含量高，抗氧化能力相对较弱，使得大脑对氧化应激特别敏感，因此线粒体功能障碍通常是神经元异常凋亡的病理原因[5-6]。神经退行性疾病与线粒体动力学异常密切相关。有研究发现，阿尔茨海默病患者神经组织线粒体分裂相关蛋白异常增高，融合相关蛋白表达减少，表现为线粒体融合异常[7]，神经系统出现线粒体功能障碍[8]。在帕金森病研究中发现，线粒体功能障碍和神经炎症与帕金森病的病理变化密切相关 [9]，最新的研究发现，线粒体移植治疗对改善帕金森病症状有明显疗效[10]。由此可见，早期干预线粒体动力失衡对神经退行性疾病的治疗有重要意义，研究调控线粒体动力学平衡的药物也具有很大价值。
中药具有多组分、多靶点、低毒性等优点，可以多点位、多途径交叉发挥作用。在神经退行性疾病药物研究中发现，雷公藤甲素通过调节自噬修复受损的神经细胞[11]，通过抑制胞内信号通路及相关因子表达、增加胰岛素降解酶活性、抑制淀粉样蛋白生成酶活性，最大限度地减少淀粉样斑块沉积[12-14]。核因子E2相关因子2是抑制细胞氧化应激通路的重要转录因子，雷公藤甲素还可以通过激活核因子E2相关因子2及其下游因子，减轻炎症反应和氧化应激对神经元的损伤[15]。雷公藤甲素是从中药雷公藤中提取的三环氧二萜内酯类化合物[16-18]，在神经系统中具有抑制神经炎症、抗氧化应激、提高突触可塑性和抑制神经元凋亡的作用[19-20]，因此，雷公藤甲素可能是治疗神经退行性疾病的候选药物之一，但作用机制尚未明确。该实验以过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤，观察雷公藤甲素抗氧化应激的效果以及线粒体动力蛋白和呼吸链蛋白表达变化，探讨雷公藤甲素治疗神经退行性疾病的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2024年1-11月在山西大同大学脑科学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株由山西大同大学脑科学研究所提供。
1.3.2 实验试剂与仪器雷公藤甲素(纯度≥98%)(成都乐美天医药科技有限公司，货号DL0034)；CCK-8试剂盒、脂质氧化检测试剂盒、总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒、TUNEL染色试剂盒(上海碧云天公司，货号C0043、S0131S、S0109、C0038)；胰蛋白酶、青霉素和链霉素溶液、DMEM基础培养基(GIBCO公司，货号25200056、15070063、C11995500BT)；兔抗Bax、兔抗Caspase-3、兔抗重组人线粒体分裂蛋白1、兔抗磷酸化发动蛋白相关蛋白1、兔抗线粒体融合蛋白1、兔抗线粒体融合蛋白2、兔抗视神经萎缩症蛋白1(CST公司，货号14796s、 9662s、32525s、3455s、14739、9482、67589)；兔抗泛醌氧化还原酶亚基B8、兔抗琥珀酸脱氢酶B、兔抗细胞色素C氧化酶1、兔抗ATP合酶F1亚基α、兔抗泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(Abcam公司，货号ab110242、ab14714、Ab14705、ab14787、ab14745)；过氧化氢溶液(LIRCON公司)；线粒体膜电位检测试剂盒(Yeasen公司)；胎牛血清(CellMax公司)；鼠抗GAPDH(Bioss，货号5174S)；兔抗Bcl-2(ABclonal，货号A0208)；山羊抗兔抗鼠IgG(ABclonal公司)；羊抗兔及羊抗鼠IgG荧光二抗(Alex Flour® 594 Abcam公司)；Western blot凝胶成像仪(Bio-Rad公司)；全功能酶标仪(美国伯滕公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 SH-SY5Y细胞培养将1 mL冻融复苏的SH-SY5Y细胞接种到培养皿中，培养皿内为5 mL含1%青霉素、链霉素双抗和体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱，待细胞融合至85%-90%，用胰酶消化进行传代培养。
1.4.2 CCK-8试剂盒筛选过氧化氢浓度和雷公藤甲素浓度将对数生长期的SH-SY5Y细胞以5.5×103个/孔密度接种于96孔板中(100 μL /孔)，第1板设10组，第1组为空白组(只有培养液)，第2组为对照组(细胞和培养液)，第3-10组在细胞培养液中加入不同浓度的过氧化氢溶液(100，150，200，250，300，350，400，450 μmol/L)；第2板设10组，第1组为空白组(只有培养液)，第2组为对照组(细胞和培养液)，第3-10组细胞培养液中加入不同浓度的雷公藤甲素(0.1，0.5，1，2.5，5，10，20，30 nmol/L)，每组设置6个复孔，置于CO2培养箱培养24 h，各板各孔加入10 μL CCK-8溶液避光孵育2 h，酶标仪450 nm波长处测量吸光度值，通过计算细胞活力值确定过氧化氢和雷公藤甲素的最佳作用浓度。
1.4.3 SH-SY5Y细胞分组将对数生长期的SH-SY5Y细胞分为对照组、模型组和雷公藤甲素组，对照组正常培养，模型组细胞培养液中加入200 μmol/L过氧化氢，雷公藤甲素组细胞培养液中同时加入2.5 nmol/L雷公藤甲素和200 μmol/L过氧化氢，孵育24 h。
1.4.4 CCK-8法检测雷公藤甲素对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞活力的影响将SH-SY5Y细胞以5.5×103个/孔密度接种于96孔板中(100 μL /孔)，每组6个复孔，依据1.4.3细胞分组处理，培养24 h后加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，酶标仪450 nm波长处测量吸光度值，计算细胞活力。
1.4.5 氧化应激相关指标超氧化物歧化酶和丙二醛水平检测将对数生长期的SH-SY5Y细胞以1.5×106个/孔密度接种于6孔板中(2 000 μL/孔)，依据1.4.3细胞分组处理24 h，根据试剂盒说明检测超氧化物歧化酶与丙二醛水平。
1.4.6 JC-1法检测线粒体膜电位将对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于特定共聚焦培养皿中(1.8×106个/皿，1 000 μL)，依据1.4.3细胞分组处理24 h，按照线粒体膜电位检测说明书加入预先配好的1 mL JC-1染色工作液染色20 min，用试剂盒专用缓冲液洗涤2次，加入2 mL细胞培养液，在激光共聚焦镜下观察。正常线粒体膜电位显示红色荧光，膜电位下降绿色荧光增强，用红绿荧光比值统计线粒体去极化程度。
1.4.7 TUNEL法检测细胞凋亡情况在24孔板中放置细胞爬片，将对数生长期的SH-SY5Y细胞以2×104个/孔密度接种于24孔板中(1 000 μL/孔)，依据1.4.3细胞分组处理24 h，将爬片细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，用含0.3%Triton X-100的PBS孵育5 min，PBS清洗2次，用TUNEL试剂盒专用检测液孵育1 h，最后用含DAPI的封片液封固细胞，在激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.8 Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白、线粒体动力相关蛋白及氧化磷酸化相关蛋白表达将对数生长期的SH-SY5Y细胞以1.5×106个/孔密度接种于6孔板中(2 000 μL/孔)，依据1.4.3细胞分组处理24 h，收集细胞，加入RIPA裂解液并用超声震荡仪碎裂细胞，高速离心后收集上清液，微量分光光度计测量蛋白浓度，调整蛋白浓度保障上样量一致，将蛋白通过10%SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭处理1.5 h，用如下一抗抗体覆膜：Bcl-2(1∶1 000)、Cleaved-Caspase-3 (1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、线粒体分裂蛋白1(1∶1 000)、磷酸化发动蛋白相关蛋白1 (1∶1 000)、线粒体融合蛋白1(1∶1 000)、线粒体融合蛋白2(1∶1 000)、视神经萎缩症蛋白1 (1∶1 000)、泛醌氧化还原酶亚基B8(1∶500)、琥珀酸脱氢酶B(1∶500)、细胞色素C氧化酶1(1∶1 000)、兔抗ATP合酶F1亚基α(1∶1 000)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)，4 ℃冰箱孵育过夜，用相应的鼠抗或羊抗二抗室温孵育2 h，洗膜3次并通过化学发光底物显色，用ChemiDocTM成像系统观察记录，用Image Lab软件进行定量分析。
1.4.9 免疫荧光染色检测相关蛋白表达在24孔板中放置细胞爬片，将对数生长期的SH-SY5Y细胞以1.5×104个/孔密度接种于24孔板中(1 000 μL/孔)，按1.4.3细胞分组处理24 h，将爬片细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次，用含1%牛血清白蛋白和0.3%Triton X-100的PBS封闭1 h，PBS清洗2次，分别加入Cleaved-Caspase-3(1∶1 000)、磷酸化发动蛋白相关蛋白1(1∶1 000)、视神经萎缩症蛋白1 (1∶1 000)、兔抗ATP合酶F1亚基α(1∶500)、细胞色素C氧化酶1(1∶500)抗体4 ℃孵育过夜，PBS清洗，加入相应二抗避光孵育2 h，最后加入DAPI封固液，激光共聚焦显微镜下观察。
1.5 主要观察指标各组SH-SY5Y细胞活力、超氧化物歧化酶和丙二醛水平、线粒体膜电位、细胞凋亡率、凋亡相关蛋白、线粒体动力相关蛋白和呼吸链相关蛋白表达。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9.0统计软件进行数据处理，各独立实验均重复3次。计量资料均用x±s表示。不同组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山西大同大学统计学专家审核。

讨论

阿尔茨海默病患者脑内β-淀粉样蛋白沉积、Tau蛋白错误折叠及帕金森病患者脑内α-突触核蛋白异常聚集等病理变化，引起脑内神经元异常活跃工作，经线粒体形成的活性氧水平增高，诱导脂质过氧化物丙二醛生成，超氧化物歧化酶等抗氧化物酶活性下降，氧化和抗氧化过程对抗失衡，发生氧化应激[23-24]。
自由基累积破坏线粒体结构，碎片化线粒体就会增多，胞内多种代谢途径受阻；超氧自由基累积还诱发线粒体膜通透性转换孔异常增加，多种促凋亡因子释放到胞质中，促凋亡因子和抗凋亡因子失衡诱发细胞凋亡[25]；氧化修饰会降低代谢酶和抗氧化酶活性，引发一系列不利于细胞存活的反应，导致神经元持续受损丢失[26]。PERLUIGI等[27-28]研究发现阿尔茨海默病大脑蛋白质氧化升高，帕金森病大脑黑质发生氧化应激、线粒体功能障碍，多巴胺能神经元丢失增加。氧化应激成为各种疾病交互机制的核心角色，也成为候选治疗靶点。雷公藤甲素在体内多个系统都具有抗氧化应激效应，在心肌细胞缺氧/复氧实验中，雷公藤甲素激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1信号通路提高了心肌细胞的抗氧化应激能力[29]，雷公藤甲素对抗氧化应激减轻糖尿病肾病足细胞损伤[30]，在神经系统也观察到雷公藤甲素的抗氧化应激效应[15]。该实验结果显示过氧化氢处理SH-SY5Y细胞后脂质过氧化物丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶活性下降，过氧化氢造成SH-SY5Y细胞氧化应激损伤，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3释放到胞质中，Bcl-2蛋白减少，引起细胞凋亡增加。与模型组相比，雷公藤甲素组细胞凋亡率下降，脂质过氧化物丙二醛水平下降，超氧化物歧化酶活性升高，提示雷公藤甲素发挥了抗氧化应激保护神经元的作用。
线粒体动力平衡对调控细胞凋亡至关重要[31]。线粒体分裂时位于外膜的线粒体分裂蛋白1激活，募集发动蛋白相关蛋白1由胞浆转运到线粒体外膜，在收缩位点收缩分裂线粒体，通过自噬清除受损部分。线粒体融合时视神经萎缩症蛋白1介导内膜融合，同时激活线粒体融合蛋白1、线粒体融合蛋白2促进外膜融合[32]。磷酸化发动蛋白相关蛋白1是线粒体断裂的关键，介导线粒体过度裂变，引起线粒体功能障碍。已有研究发现，阿尔茨海默病大脑神经元存在发动蛋白相关蛋白1的过度磷酸化[33-34]。线粒体断裂也是帕金森病病理学的早期特征[35]，最新的研究已经可以通过移植线粒体来改善帕金森病动物模型症状[9]。这些证据提示针对线粒体动力平衡的靶点治疗有望延缓神经退行性疾病发病。该实验模型组磷酸化发动蛋白相关蛋白1和线粒体分裂蛋白1表达均明显高于对照组，而线粒体融合蛋白表达均明显低于对照组，提示氧化应激发生时线粒体发生过度分裂；雷公藤甲素干预后，分裂蛋白表达下降，融合蛋白表达增高，说明雷公藤甲素促进了线粒体融合，修复线粒体动力失衡。
线粒体动力平衡是保障线粒体产能的结构基础，产能是氧化磷酸化过程产生的电子经电子传递链分工合作传递给氧并偶联合成ATP的过程。组成电子传递链的Ⅰ-Ⅴ种复合物包括泛醌氧化还原酶亚基B8、琥珀酸脱氢酶B、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2、细胞色素C氧化酶1和ATP合酶F1亚基α[36]。复合酶活性是评估线粒体呼吸链功能的关键因素，复合酶活性下降就会引起线粒体膜电位下降[37]。研究发现，阿尔茨海默病患者脑内呼吸链复合酶活性明显下降[38]。有研究证实线粒体能量代谢紊乱早于疾病临床症状之前[39]，提示早期干预或可控制疾病发展。该研究结果显示模型组呼吸链复合酶活性下降，线粒体膜电位下降，提示线粒体合成能量不足，而雷公藤甲素提高了复合酶活性，恢复了线粒体膜电位。
综上所述，雷公藤甲素可能是通过调节线粒体动力平衡改善呼吸链功能，减轻氧化应激来改善过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，其作用的具体靶点和上下游通路尚需进一步实验验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

雷公藤甲素缓解过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的线粒体动力学机制

Mitochondrial kinetic mechanism by which triptolide alleviates hydrogen peroxide-induced apoptosis in SH-SY5Y cells

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