糖皮质激素诱导成骨细胞线粒体损伤在激素性股骨头坏死中的作用机制

doi:10.12307/2026.872

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (34): 8845-8851.doi: 10.12307/2026.872

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糖皮质激素诱导成骨细胞线粒体损伤在激素性股骨头坏死中的作用机制

马润秋1，杨慧霞1，2，李雪儿1，2，白志刚1，3，李桂忠1，2，郝银菊1，4，马胜超1，5，姜怡邓1，2

宁夏医科大学，1国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，2基础医学院，5检验学院，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏回族自治区人民医院，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2025-09-18 修回日期:2026-02-06 出版日期:2026-12-08 发布日期:2026-04-11
通讯作者: 姜怡邓，博士，教授，宁夏医科大学，国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室，基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:马润秋，男，1997年生，宁夏回族自治区吴忠市人，回族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事激素性股骨头坏死方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区项目(82060412)，项目负责人：白志刚；国家自然科学基金区域创新发展联合基金(U21A20343)，项目负责人：姜怡邓；宁夏回族自治区重点研发计划项目(2020BFH02001)，项目负责人：白志刚；宁夏回族自治区重点研发计划重点项目(2022BEG02054)，项目负责人：李桂忠；宁夏回族自治区重点研发计划重点项目(2022BFH02013)，项目负责人：郝银菊；宁夏回族自治区重点研发计划重点项目(2023BEG02074)，项目负责人：姜怡邓

Mechanism of glucocorticoid-induced mitochondrial dysfunction in osteoblasts in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Ma Runqiu1, Yang Huixia1, 2, Li Xuer1, 2, Bai Zhigang1, 3, Li Guizhong1, 2, Hao Yinju1, 4, Ma Shengchao1, 5, Jiang Yideng1, 2

1Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research, National Health Commission, 2School of Basic Medicine, 5School of Laboratory Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Ningxia People’s Hospital, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2025-09-18 Revised:2026-02-06 Online:2026-12-08 Published:2026-04-11
Contact: Jiang Yideng, PhD, Professor, Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research, National Health Commission, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Runqiu, MS candidate, Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research, National Health Commission, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Regional Program), No. 82060412 (to BZG); Regional Innovation Development Joint Fund, National Natural Science Foundation, No. U21A20343 (to JYD); Ningxia Hui Autonomous Region Key R&D Program Projects, Nos. 2020BFH02001 (to BZG), 2022BEG02054 (to LGZ), 2022BFH02013 (to HYJ), and 2023BEG02074 (to JYD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
线粒体损伤：是指线粒体在结构、功能或遗传物质上遭受破坏，导致其正常生理功能受损的现象，主要表现为线粒体膜电位异常、活性氧过量产生及呼吸链复合体功能抑制等。线粒体损伤与骨关节炎、神经退行性疾病、药物性肝损伤等疾病存在直接关联。
激素性股骨头坏死：是长期或大剂量使用糖皮质激素(如泼尼松、地塞米松等)导致的股骨头血供障碍、骨细胞死亡及骨质塌陷的一种非创伤性骨坏死疾病。由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷。

背景：激素性股骨头坏死的发病机制尚不清楚，成骨细胞线粒体损伤与其关系密切。
目的：探讨地塞米松对激素性股骨头坏死中成骨细胞线粒体功能的影响，并分析其对成骨细胞凋亡及自噬的调控作用。
方法：将体外培养的MC3T3-E1细胞分为对照组(不处理)和地塞米松组(1 μmol/L地塞米松处理24 h)。通过茜素红染色和qRT-PCR评估成骨细胞分化能力；采用透射电镜、MitoTracker Red荧光染色及流式细胞术观察线粒体形态变化；JC-1荧光染色和ATP含量检测评估线粒体膜电位及能量代谢；MitoSOX荧光探针和流式细胞术检测线粒体超氧化物水平；同时测定细胞内总活性氧及谷胱甘肽含量以评估氧化应激状态。此外，Western blot和qRT-PCR检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及自噬标志物(LC3B、p62)的表达，流式细胞术分析细胞凋亡率，并通过mRFP-GFP-LC3腺病毒转染结合共聚焦显微镜观察自噬流变化。
结果与结论：①与对照组相比，地塞米松组MC3T3-E1细胞的成骨分化能力显著降低，线粒体结构异常(肿胀、嵴断裂)，膜电位下降，ATP合成减少，同时线粒体超氧化物和总活性氧水平升高，谷胱甘肽消耗增加(P < 0.05)。②地塞米松组促凋亡蛋白Bax表达明显上调(P < 0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调(P < 0.01)，自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值升高(P < 0.01)且p62水平降低(P < 0.01)；塞米松处理导致细胞凋亡率显著增加(P < 0.01)。③mRFP-GFP-LC3腺病毒示踪检测发现自噬体和自噬溶酶体形成均明显增多。④结果说明，地塞米松通过诱导线粒体功能障碍和氧化应激反应，协同调控MC3T3-E1细胞凋亡与自噬过程，进而损害骨形成与修复功能，这一机制可能是激素性股骨头坏死发病的关键病理基础。
https://orcid.org/0009-0005-3339-4215(马润秋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 线粒体, 线粒体功能障碍, 地塞米松, 凋亡, 自噬

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head remains unclear; however, it is closely associated with mitochondrial damage in osteoblasts.
OBJECTIVE: To explore the impact of dexamethasone on mitochondrial dysfunction in osteoblasts following steroid-induced osteonecrosis of the femoral head and to analyze its regulatory roles in osteoblast apoptosis and autophagy.
METHODS: MC3T3-E1 cells were cultured in vitro and divided into control group (no treatment) and dexamethasone group (1 μmol/L dexamethasone treatment for 24 hours). Osteoblast differentiation capacity was assessed by alizarin red staining and qRT-PCR. Mitochondrial morphology was examined using transmission electron microscopy, MitoTracker Red fluorescent staining, and flow cytometry. Mitochondrial membrane potential and energy metabolism were evaluated via JC-1 fluorescent staining and ATP content measurement. Mitochondrial superoxide levels were quantified using MitoSOX™ Red fluorescent probe combined and flow cytometry. Intracellular total reactive oxygen species and glutathione levels were simultaneously measured to evaluate oxidative stress status. Additionally, western blot and qRT-PCR assays were performed to examine Bax/Bcl-2 (apoptosis) and LC3B/p62 (autophagy) expression. Flow cytometric analysis was performed to assess apoptotic rates. Autophagic flux was assessed using mRFP-GFP-LC3 adenovirus transfection followed by confocal microscopy analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, dexamethasone-treated MC3T3-E1 cells exhibited significantly impaired osteogenic differentiation capacity (P < 0.05), accompanied by mitochondrial structural abnormalities (including swelling and cristae disruption), decreased membrane potential, reduced glutathione synthesis, elevated mitochondrial superoxide and total reactive oxygen species levels, as well as increased glutathione depletion. (2) Western blot analysis revealed that dexamethasone treatment significantly upregulated Bax (P < 0.01) while downregulating Bcl-2 (P < 0.01), concurrently increasing the LC3B-II/I ratio (P < 0.01) and decreasing p62 levels (P < 0.01). Flow cytometry analysis further confirmed that dexamethasone treatment significantly increased the apoptotic rate (P < 0.01). (3) mRFP-GFP-LC3 adenovirus tracer detection demonstrated a marked enhancement in the formation of both autophagosomes and autolysosomes. To conclude, dexamethasone regulates the apoptosis and autophagy processes of MC3T3-E1 cells in a coordinated manner by inducing mitochondrial dysfunction and oxidative stress response, and thereby impairs bone formation and repair functions. This mechanism may be the key pathological basis for the pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, mitochondria, mitochondrial dysfunction, dexamethasone, apoptosis, autophagy

中图分类号:

马润秋, 杨慧霞, 李雪儿, 白志刚, 李桂忠, 郝银菊, 马胜超, 姜怡邓. 糖皮质激素诱导成骨细胞线粒体损伤在激素性股骨头坏死中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(34): 8845-8851.

Ma Runqiu, Yang Huixia, Li Xuer, Bai Zhigang, Li Guizhong, Hao Yinju, Ma Shengchao, Jiang Yideng. Mechanism of glucocorticoid-induced mitochondrial dysfunction in osteoblasts in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(34): 8845-8851.

图/表（结果） 6

2.1 糖皮质激素导致MC3T3-E1细胞损伤茜素红S染色分析表明，与对照组相比，地塞米松组MC3T3-E1细胞矿化结节的形成受到显著抑制，表现为矿化结节数量减少，见图1A。这一结果与qRT-PCR检测结果一致：qRT-PCR检测显示，地塞米松处理显著下调了成骨分化相关标志基因Runx2、骨桥蛋白和骨钙素的mRNA表达水平，见图1B。这些数据共同表明，地塞米松通过抑制成骨分化关键基因的表达，进而阻碍了MC3T3-E1细胞的矿化能力。

2.2 糖皮质激素干预后MC3T3-E1细胞线粒体形态学发生变化透射电镜观察显示，正常MC3T3-E1细胞的线粒体多呈卵圆形或长椭圆形，内膜结构清晰，线粒体嵴排列紧密且形态规则。而经地塞米松处理24 h后，线粒体超微结构发生显著改变：可见线粒体肿胀、空泡化，部分线粒体膜结构破裂，嵴结构松散、断裂甚至溶解，见图2A。进一步采用MitoTracker Red染色评估线粒体膜电位变化，免疫荧光及流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，地塞米松干预后细胞内的红色荧光强度显著降低(图2B，C)，提示线粒体膜电位去极化。上述结果表明，地塞米松可诱导MC3T3-E1细胞线粒体结构破坏。

2.3 糖皮质激素干预导致MC3T3-E1细胞线粒体功能障碍线粒体功能检测结果表明，地塞米松处理显著损害了MC3T3-E1细胞的线粒体功能。JC-1荧光探针检测显示，与对照组相比，地塞米松组细胞线粒体膜电位显著下降，见图3A。同时，ATP含量检测结果显示地塞米松处理导致细胞内ATP水平降低，见图3B。这些结果提示，地塞米松可能通过破坏线粒体膜电位，影响电子传递链功能，进而干扰氧化磷酸化过程，最终导致MC3T3-E1细胞能量代谢障碍。
2.4 糖皮质激素干预MC3T3-E1细胞对线粒体活性氧的影响 MitoSOX Red荧光探针检测发现，与对照组相比，地塞米松组细胞中线粒体超氧化物荧光信号明显增强，见图4A。流式细胞术

定量分析进一步证实，地塞米松组MitoSOX Red的平均荧光强度显著增加，见图4B。这些结果表明，地塞米松处理可特异性诱导MC3T3-E1细胞线粒体内活性氧和超氧化物积累，提示糖皮质激素可能通过诱导线粒体氧化应激而导致细胞损伤。该发现为阐明糖皮质激素对成骨细胞的毒性作用提供了氧化应激层面的机制解释。

2.5 糖皮质激素对MC3T3-E1细胞氧化应激的影响 DCFH-DA荧光探针检测显示，与对照组相比，地塞米松组细胞内活性氧水平显著升高，见图5A；流式细胞术定量分析进一步证实了这一结果，见图5B。同时，谷胱甘肽含量检测表明地塞米松处理显著降低了细胞内谷胱甘肽水平，见图5C。这些结果共同表明，地塞米松处理不仅促进了活性氧的积累，还削弱了细胞的抗氧化防御能力，导致氧化/抗氧化系统失衡。

2.6 糖皮质激素对MC3T3-E1细胞自噬与凋亡的调控作用凋亡及自噬相关指标检测结果显示，地塞米松处理显著影响MC3T3-E1细胞程序性死亡途径。Western blot分析表明，地塞米松组抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达升高，该趋势在mRNA水平得到qRT-PCR验证，见图6A。流式细胞术检测显示地塞米松组细胞凋亡率显著增加，见图6B。自噬相关指标检测发现，地塞米松处理导致自噬底物p62表达降低，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值升高，见图6C；同时腺病毒示踪实验显示自噬溶酶体与自噬体增多，见图6D。这些结果表明，地塞米松通过协同调控凋亡和自噬途径破坏成骨细胞稳态，其机制可能与线粒体功能障碍相关，为阐明糖皮质激素性骨质疏松的分子机制提供了实验依据。

参考文献

[1] 朱正杰,彭昊.成骨细胞在激素性股骨头坏死发病机制中的作用研究进展[J].生物骨科材料与临床研究,2025,22(1):76-81.
[2] GUO S, MAO L, JI F, et al. Activating AMP-activated protein kinase by an α1 selective activator compound 13 attenuates dexamethasone-induced osteoblast cell death. Biochem Biophys Res Commun. 2016;471(4):545-552.
[3] CHEN K, LIU Y, HE J, et al. Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head reveals enhanced reactive oxygen species and hyperactive osteoclasts. Int J Biol Sci. 2020;16(11):1888-1900.
[4] 梁朝鑫,周安远,王伟,等.骨髓间充质干细胞治疗骨科疾病研究进展[J].陕西医学杂志,2022,51(1):121-124+129.
[5] LU C, QI H, XU H, et al. Global research trends of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: A 30-year bibliometric analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1027603.
[6] LIU Q, WU Y, LI S, et al. Ursolic acid alleviates steroid-induced avascular necrosis of the femoral head in mouse by inhibiting apoptosis and rescuing osteogenic differentiation. Toxicol Appl Pharmacol. 2023;475:116649.
[7] 康少平,刘淑艳,李永升,等.激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞体外增殖分化能力的研究[J].中国细胞生物学学报,2015,37(11):1490-1496.
[8] ZHANG X, YANG Z, XU Q, et al. Dexamethasone Induced Osteocyte Apoptosis in Steroid-Induced Femoral Head Osteonecrosis through ROS-Mediated Oxidative Stress. Orthop Surg. 2024;16(3):733-744.
[9] YANG N, SUN H, XUE Y, et al. Inhibition of MAGL activates the Keap1/Nrf2 pathway to attenuate glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Clin Transl Med. 2021;11(6):e447.
[10] TAHRIR F G, LANGFORD D, AMINI S, et al. Mitochondrial quality control in cardiac cells: mechanisms and role in cardiac cell injury and disease. J Cell Physiol. 2019; 234(6):8122-8133.
[11] YANG H, DING N, QING S, et al. Knockdown of lncRNA XR_877193.1 suppresses ferroptosis and promotes osteogenic differentiation via the PI3K/AKT signaling pathway in SONFH. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2025;57(8):1350-1362.
[12] 张杰,曹建泽,刘永飞,等.激素性股骨头坏死发病机制的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2024,32(7):620-624+630.
[13] KOKKINOPOULOU I, MOUTSATSOU P. Mitochondrial Glucocorticoid Receptors and Their Actions. Int J Mol Sci. 2021;22(11):6054.
[14] 胡康一,曹林忠,万超超,等.基于线粒体功能障碍探讨中药防治激素性股骨头坏死的基础研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2023,28(6):688-696.
[15] YANG D, OKAMURA H, QIU L. Upregulated osterix expression elicited by Runx2 and Dlx5 is required for the accelerated osteoblast differentiation in PP2A Cα-knockdown cells. Cell Biol Int. 2018;42(4):403-410.
[16] CHEN L, SHI X, WENG SJ, et al. Vitamin K2 can rescue the dexamethasoneinduced downregulation of osteoblast autophagy and mitophagy thereby restoring osteoblast function in vitro and in vivo. Front Pharmacol. 2020;11:1209.
[17] HUANG X, JIE S, LI W, et al. miR-122-5p targets GREM2 to protect against glucocorticoid-induced endothelial damage through the BMP signaling pathway. Mol Cell Endocrinol. 2022;544:111541.
[18] LIU BH, XU CZ, LIU Y, et al. Mitochondrial quality control in human health and disease. Mil Med Res. 2024;11(1):32.
[19] 申屠路媚,牟艳玲.线粒体功能障碍机制及其相关疾病研究进展[J].生命科学,2018,30(1):87-93.
[20] YISANG Y,HAKJOO L,MARILEN F,et al.Non-conventional mitochondrial permeability transition:its regulation by mitochondrial dynamics. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2022;1864(1):148914.
[21] WANG, YUAN, LIU, et al. The role of mitochondria in aging, cell death, and tumor immunity. Front Immunol. 2024;15:1520072.
[22] GUO R, ZONG S, WU M, et al. Architecture of Human Mitochondrial Respiratory Megacomplex I(2)III(2)IV(2). Cell. 2017;170:1247-57 e12.
[23] 赵阳,李嘉麟,吴箫,等.胆碱激酶α沉默诱导线粒体功能障碍影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡[J].中国组织工程研究,2026,30(1):130-138.
[24] REN GW, WEN SB, HAN J, et al. Network-Based Pharmacology and Bioinformatics Study on the Mechanism of Action of Gujiansan in the Treatment of Steroid-Induced Avascular Necrosis of the Femoral Head. Biomed Res Int. 2022;2022: 8080679.
[25] 唐建萍,毕泰瑜,魏士雄.心力衰竭中氧化应激的病理机制及治疗进展[J].广州医科大学学报,2025,53(1):54-60.
[26] ZHANG X, PANG R, ZHANG K, et al. Apocynin exerts cytoprotective effects on dexamethasone-induced osteoblasts by inhibiting oxidative stress through the Nrf2 signalling pathway. J Cell Mol Med. 2023;27(23):3911-3927.
[27] 毛筝,肖桂扬,梁淑芬,等.α-MSH调控Bcl-2线粒体途径在桃红四物汤防治激素性股骨头坏死中的作用机制[J].智慧健康,2023,9(34):40-45+49.
[28] YU L,CHEN Y,TOOZE SA.Autophagy pathway:Cellular and molecular mechanisms.Autophagy. 2018;14(2):207-215.
[29] TSUJIMOTO Y, SHIMIZU S. Another way to die: autophagic programmed cell death. Cell Death Differ. 2005;12 Suppl 2:1528-1534.
[30] ZHANG S, LIU Y, LIANG Q. Low-dose dexamethasone affects osteoblast viability by inducing autophagy via intracellular ROS. Mol Med Rep. 2018;17(3):4307-4316.
[31] 张勇杰,曹林忠,万超超,等.线粒体自噬在激素性股骨头坏死发病中的作用及研究进展[J].风湿病与关节炎,2023,12(10):66-70.
[32] LUO Z, XU X, SHO T, et al. ROS-induced autophagy regulates porcinetrophectoderm cell apoptosis, proliferation, and differentiation. Am J Physiol Cell Physiol. 2019;316(2):C198-C209.
[33] KISHIMOTO C, TOMIOKA N, NAKAYAMA Y, et al.Anti-oxidant effects of coenzyme Q10 on experimental viral myocarditis in mice. J Cardiovasc Pharmacol. 2003; 42(5):588-592.

引言

激素性股骨头坏死是长期大量使用糖皮质激素导致股骨头代谢异常、脂质代谢失衡、血液微循环紊乱、骨小梁骨折、骨组织坏死塌陷、髋关节功能障碍的非创伤性股骨头坏死[1]。随着糖皮质激素在风湿免疫性疾病、器官移植和血液系统疾病等领域的广泛应用，激素性股骨头坏死的发病率逐年升高[2]，已成为临床面临的重大挑战。研究发现，激素性股骨头坏死与糖皮质激素的剂量和用药时间呈正相关，每日糖皮质激素剂量40 mg且用药时长超过3个月，有5%-40%患者发生骨坏死，且每日剂量增加10 mg，会使激素性股骨头坏死发生率增加4%[3]。激素性股骨头坏死具有双侧对称型，坏死范围广，致残率高等特点，约80%的患者在确诊后两三年内出现股骨头塌陷，最终需行全髋关节置换术，给患者和社会带来沉重的医疗负担[4-5]。鉴于糖皮质激素在临床治疗中仍具有不可替代的重要地位，深入研究激素性股骨头坏死的发病机制，对于该疾病的防治具有重要的理论指导意义。
激素性股骨头坏死的发病机制复杂，目前尚未完全阐明。现有研究认为，糖皮质激素通过多重途径破坏股骨头微环境稳态，其中成骨细胞功能障碍和线粒体损伤被认为是激素性股骨头坏死发展的关键病理生物学机制之一[6]。糖皮质激素可显著抑制成骨细胞的增殖与分化能力[7]，其机制涉及多种信号通路的调控异常；并能通过下调Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)和Osterix等关键成骨转录因子的表达，阻碍成骨分化进程[8]。
线粒体作为细胞的能量代谢中心和凋亡调控枢纽，其功能障碍在激素性股骨头坏死的发病过程中扮演着关键角色。研究表明，糖皮质激素的过度使用常会导致氧化应激反应的发生，高剂量的糖皮质激素可损害成骨细胞的线粒体功能，导致成骨细胞内活性氧大量累积和抗氧化剂水平降低[9]，ATP合成减少，最终引发细胞凋亡[10]。然而，糖皮质激素如何通过调控线粒体功能影响成骨细胞活性的具体分子机制仍不清楚，这限制了对激素性股骨头坏死的深入认识和有效防治。因此，深入探究糖皮质激素影响成骨细胞功能及线粒体稳态的具体分子机制，寻找有效的干预靶点，对激素性股骨头坏死的早期防治具有重要意义。此项研究拟通过体外实验，系统研究糖皮质激素对成骨细胞线粒体功能的影响，重点关注线粒体形态学改变、氧化应激反应、能量代谢障碍以及细胞死亡通路激活等关键环节，为阐明激素性股骨头坏死的发病机制提供新的实验依据，并为开发靶向治疗策略奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2024年10月至2025年4月在宁夏医科大学代谢性心血管疾病研究重点实验室完成。
1.3 材料 MC3T3-E1小鼠成骨细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司；α-MEM基础培养基(中乔新舟，中国)；青霉素-链霉素和胰蛋白酶-EDTA消化液购自北京Solarbio公司；LipofectamineTM 2000 (Thermo Fisher Scientific，美国)；地塞米松购自上海MedChemExpress；Mito-Tracker Red CMXRos、ATP检测试剂盒(北京碧云天生物技术公司)；细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；线粒体超氧化物红色荧光探针(上海翌圣生物科技股份有限公司)；PE Annexin V Apoptosis检测试剂盒(BD Pharmingen™，美国)；Bax抗体、LC3(ab192890)、p62(ab240635)兔单克隆抗体购自英国Abcam公司；Bcl-2抗体购自江苏亲科生物Affinity公司；β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京金桥有限公司；总RNA提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；反转录和荧光定量PCR试剂盒购自爱博泰克生物科技有限公司；自噬双标慢病毒mRFP-GFP-LC3购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养将2.5×106个MC3T3-E1细胞接种于T25培养瓶中，每瓶加入4 mL完全培养基[含体积分数10%胎牛血清和含1%双抗(青霉素-链霉素)的MEM-α基础培养基]，于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养。当细胞融合度增长至60%-70%时，弃去原培养基在T25培养瓶中加入4 mL含体积分数7%胎牛血清和不含双抗的培养基分别以浓度为0 μmol/L和1 μmol/L的地塞米松干预[11]，其中0 μmol/L地塞米松为对照组，1 μmol/L地塞米松为地塞米松组，干预24 h后收集细胞进行后续实验。
1.4.2 茜素红S(Alizarin Red S)染色是一种用于检测细胞外基质钙盐沉积的常用方法，适用于评估MC3T3-E1细胞矿化能力及体外钙结节形成实验。具体操作步骤如下：首先用PBS漂洗对照组和地塞米松组MC3T3-E1细胞2次，用40 g/L多聚甲醛固定15-30 min，PBS再次洗涤后加入0.1%-1%茜素红S染液避光孵育10-30 min，随后PBS冲洗去除残留染料，倒置显微镜下观察橙红色至深红色的钙结节。
1.4.3 透射电镜检测MC3T3-E1细胞线粒体形态用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)配制的1%戊酸固定两组MC3T3-E1细胞2 h，用乙醇和丙酮脱水，然后用丙酮和包埋剂渗透。包埋后，将细胞切成60-80 nm的超薄切片，用2%醋酸铀饱和乙醇和2.6%柠檬酸铅染色。通过透射电镜(Hitachi，Tokyo，Japan)观察MC3T3-E1细胞的超微结构，并收集图像进行分析。
1.4.4 MitoTracker Red染色采用MitoTracker Red CMXRos探针检测两组MC3T3-E1细胞的线粒体形态及分布。细胞经相应处理后，使用预热的培养基稀释MitoTracker Red至工作浓度(200 nmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。孵育结束后，弃去染液，用预热的PBS轻柔洗涤3次以去除残余探针。40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS漂洗后DAPI复染细胞核5 min，抗荧光淬灭封片剂封固。激光共聚焦显微镜下观察，红色荧光信号代表活性线粒体分布。
1.4.5 JC-1染色采用JC-1荧光探针检测两组MC3T3-E1细胞线粒体膜电位变化。首先配制JC-1工作液，取2 μL JC-1(500×)母液加入898 μL灭菌去离子水中，剧烈Vortex震荡30-60 s使其充分溶解，再加入100 μL 10×Incubation Buffer混匀，配制成1 mL JC-1工作液(1×)。将细胞与工作液于37 ℃避光孵育20-30 min，孵育结束后弃去染液，用PBS轻柔洗涤两三次。激光共聚焦显微镜下观察，健康细胞因线粒体膜电位较高会形成JC-1聚合物(红色荧光)，而膜电位下降的细胞则以JC-1单体形式存在(绿色荧光)。通过计算红绿荧光强度比值可定量分析线粒体膜电位变化。
1.4.6 Mito SOX染色采用MitoSOX Red荧光探针检测两组MC3T3-E1细胞线粒体超氧化物水平。细胞处理后，使用无血清培养基稀释MitoSOX Red至工作浓度(500 nmol/L)，37 ℃避光孵育10-15 min。孵育结束后，弃去染液，用预热的PBS轻柔洗涤3次。40 g/L多聚甲醛室温固定15 min，PBS漂洗后DAPI复染细胞核5 min，抗荧光淬灭封片剂封固。激光共聚焦显微镜下观察，激发波长510 nm，发射波长580 nm，红色荧光强度反映线粒体超氧化物水平。
1.4.7 流式细胞术取两组体外培养的MC3T3-E1细胞以5×109 L-1细胞浓度接种于24孔板，加入预冷的PBS 1 mL，清洗2遍后，使用不含酚红、不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，待细胞消化完全后吸弃胰蛋白酶；加入1 mL预冷的PBS，轻柔地吹下细胞而后1 000 r/min离心5 min，离心后弃上清，重复2次；避光条件下按照说明书向各管中加入稀释后的MitoTracker Red、Mito SOX工作液，轻轻重悬细胞并分装于1.5 mL离心管中37 ℃培养箱孵育25-30 min。去除工作液再次清洗细胞后于2 h内流式上机，检测线粒体的形态变化和超氧化物水平及细胞凋亡率。
1.4.8 ATP检测取两组MC3T3-E1细胞，吸除培养液，加入500 μL裂解液。裂解细胞时使用移液器进行反复吹打或晃动培养瓶使裂解液充分接触并裂解细胞。裂解后4 ℃下12 000×g离心5 min，取上清，于化学发光仪进行测定。
1.4.9 mRFP-GFP-LC3腺病毒转染将MC3T3-E1细胞接种于共聚焦培养皿，待汇合度达50%时，加入mRFP-GFP-LC3腺病毒，转染6-8 h后换液，用地塞米松(1 μmol/L)干预24 h，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定，抗荧光淬灭剂封固。激光共聚焦显微镜下观察：黄色斑点(GFP+mRFP+)为自噬体，红色斑点(mRFP+GFP-)为自噬溶酶体。
1.4.10 qRT-PCR检测将2.5×106个MC3T3-E1细胞接种于T25培养瓶中，每瓶加入4 mL完全培养基，待细胞融合至70%时，分别设置：对照组(不做处理)、地塞米松组(地塞米松1 μmol/L干预24 h)。提取各组MC3T3-E1细胞的总RNA后反转录成cDNA后进行qRT-PCR的检测，扩增条件：预变性95 ℃ 3 min；变性：95 ℃ 5 s；退火及延伸：30 ℃ 30 s；循环数40；以GAPDH作为内参，按照公式2-ΔΔCt分析Runx2、骨桥蛋白、骨钙素、Bax、Bcl-2的表达水平。公式如下：ΔΔCt=[Ct(目的基因) (待测样本)-Ct(GAPDH)

(待测样本)]-[Ct(目的基因) (校正样本)-Ct(GAPDH)(校正样本)]。引物由上海生工有限公司合成，见表1。

1.4.11 Western blot检测细胞分组及处理同1.4.10。提取全蛋白后，BCA法进行蛋白浓度测定及定量，加入5×蛋白上样缓冲液于金属浴中99 ℃煮沸变性5 min，上样进行SDS-PAGE凝胶电泳后，0.3 A恒流电转2 h 至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，PBST洗涤3次，分别加入Bax、Bcl-2和LC3B、p62一抗(稀释比例1∶1 000)4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，使用辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释比例1∶5 000)37 ℃孵育2 h，PBST洗膜3次。最后在凝胶成像分析仪上成像分析，以β-actin(1∶5 000)为内参，采用Image J 软件进行灰度分析，计算目的蛋白Bax、Bcl-2、LC3B及p62蛋白的相对表达。
1.5 主要观察指标 ①MC3T3-E1细胞分化能力；②线粒体形态变化、线粒体膜电位及能量代谢、线粒体超氧化物水平；③细胞内总活性氧及谷胱甘肽水平；④细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及自噬标志物(LC3B、p62)的表达；⑤细胞凋亡率；⑥mRFP-GFP-LC3腺病毒转染观察自噬流变化。
1.6 统计学分析使用Prism 9.0统计软件对上述结果进行统计学分析和处理，符合正态分布的计量资料以x±s表示，两样本均数间比较采用Student′s t检验，多个样本均数间比较采用Oneway ANOVA检验，组间比较采用Student-Newan-Keuls检验，以P ≤ 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

临床治疗中，糖皮质激素作为风湿性疾病、自身免疫性疾病和脊髓休克等疾病的首选药物，其长期大剂量使用导致的激素性股骨头坏死发病率持续攀升，已成为非创伤性股骨头坏死的主要病因[12]。长期使用糖皮质激素会导致活性氧生成过度增加、对细胞死亡和端粒磨损的敏感性增加、线粒体动力学障碍等一系列线粒体功能障碍[13]，而这些均会导致骨细胞凋亡、骨代谢失衡、血流异常的发生，继而加重激素性股骨头坏死的发生发展[14]。此次研究通过系统的体外实验，首次从线粒体稳态的角度揭示了糖皮质激素损害成骨细胞功能的多层次机制。研究发现，地塞米松处理不仅通过下调Runx2、骨桥蛋白和骨钙素等关键成骨基因的表达抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化能力，更重要的是诱导线粒体超微结构损伤、膜电位下降和ATP合成障碍，最终导致氧化应激加剧、细胞凋亡增加和自噬异常。这些发现从分子水平完整阐释了激素性股骨头坏死中“成骨障碍-骨坏死”的病理级联反应，为开发靶向线粒体保护的防治策略提供了创新性的理论依据。
在成骨分化调控方面此次研究获得了重要发现，qRT-PCR检测结果显示，地塞米松处理显著抑制了Runx2、骨桥蛋白和骨钙素等关键成骨标志基因的表达[15]。Runx2作为成骨分化的核心转录因子[15]，其表达下调可能影响下游成骨相关基因的转录活性，进而干扰骨基质合成和矿化过程[16]。茜素红染色结果显示矿化结节形成减少，这一现象提示在激素性股骨头坏死的病理过程中，糖皮质激素可能通过复杂的时间剂量效应破坏骨形成与骨吸收的平衡[17]，为理解疾病的渐进性发展特征提供了实验依据。
此次研究系统阐明了糖皮质激素对成骨细胞线粒体的多重损伤机制。透射电镜观察显示地塞米松处理导致线粒体超微结构改变，包括肿胀、嵴断裂和空泡化等病理变化[18]。这些结构异常与线粒体膜电位下降、ATP合成减少等功能障碍密切相关[19]。
线粒体肿胀提示线粒体膜通透性增加，进一步降低能量供应从而引起成骨细胞能量危机[20]；线粒体嵴断裂直接损害氧化磷酸化效率，导致活性氧过量产生[21]；线粒体空泡化使得受损的线粒体不能被及时清除最终引起细胞发生凋亡。JC-1染色显示的膜电位下降提示电子传递链功能受损，可能由于糖皮质激素抑制复合物Ⅰ/Ⅲ活性，导致质子梯度无法维持，进一步减少ATP合成[22]。同时线粒体膜电位下降会激活凋亡通路[23]，与Bax上调/Bcl-2下调的结果一致。线粒体功能障碍可能直接影响成骨细胞的分化能力，提示线粒体是糖皮质激素作用的重要靶点。进一步研究发现糖皮质激素可能导致线粒体活性氧清除能力下降使得线粒体活性氧积累[24]，谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的内源性抗氧化剂，通过清除自由基和消除脂质过氧化产物，保护细胞免受氧化应激损伤[25]。地塞米松处理导致细胞内活性氧水平升高，谷胱甘肽水平降低，表明氧化应激在成骨细胞损伤中起关键作用。这些发现为开发靶向线粒体的治疗策略提供了理论支持。
在细胞死亡调控方面，研究证实地塞米松同时激活凋亡和自噬两条通路。Western blot显示地塞米松组Bcl-2/Bax比值降低，流式检测证实凋亡率升高[26]，这些变化与线粒体凋亡途径的激活相关[27]。同时，LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值升高和p62降解表明自噬被激活。mRFP-GFP-LC3腺病毒实验结果直观展示了自噬溶酶体的动态变化。自噬在骨代谢中具有双重作用，自噬早期发挥保护作用，通过清除受损线粒体有助于维持细胞稳态[28]，而晚期过度自噬可能导致自噬流阻滞，加重细胞损伤导致细胞死亡[29]。
线粒体损伤、凋亡和自噬三者的动态平衡决定细胞命运，损伤早期自噬激活尝试修复损伤[30]，而持续损伤会使凋亡通路占主导[31]，最终结局偏向凋亡主导。这种复杂的调控网络可能成为激素性股骨头坏死治疗的潜在靶点。首先，针对线粒体功能的保护策略具有重要前景，如使用线粒体靶向抗氧化剂(如MitoQ、SS-31)[32]，或能量代谢调节剂(如辅酶Q10[33]、α-硫辛酸)可能有助于维持成骨细胞活力；其次，精准调控细胞死亡通路的药物，如凋亡抑制剂(如Z-VAD-FMK)或自噬调节剂(如雷帕霉素、氯喹)，可能成为新的治疗选择。
此次研究揭示了地塞米松通过多重机制损害MC3T3-E1细胞功能：破坏线粒体稳态、诱发氧化应激、协同调控凋亡与自噬过程，从而干扰骨形成与修复。这些发现为深入理解激素性股骨头坏死的发病机制提供了重要理论依据。需要指出的是，此研究还存在以下局限性：实验采用的MC3T3-E1细胞系虽具代表性，但与原代成骨细胞存在差异；研究主要聚焦成骨细胞本身，揭示了糖皮质激素可能通过影响成骨细胞分化能力、线粒体形态变化、代谢水平、氧化应激状态以及调节细胞凋亡、自噬等途径损害成骨细胞功能，未能针对相应靶点进行验证；未来需要在原代细胞和动物模型中进一步验证，并深入探讨多细胞间的相互作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

糖皮质激素诱导成骨细胞线粒体损伤在激素性股骨头坏死中的作用机制

Mechanism of glucocorticoid-induced mitochondrial dysfunction in osteoblasts in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

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[2]	何家乐, 黄茜, 董鸿斐, 陈朗, 钟方宇, 李先慧. 脱细胞真皮基质联合脂肪干细胞外泌体促进烧伤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1699-1710.
[3]	刘安婷, 陆江涛, 张文杰, 贺玲, 唐宗生, 陈晓玲. 血小板裂解物调控腺苷酸活化蛋白激酶抑制镉诱导的神经细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1800-1807.
[4]	贾金文, 艾日法特·艾尼瓦尔, 张娟. EP300对过敏性鼻炎大鼠相关自噬和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1439-1449.
[5]	侯超文, 李兆进, 孔健达, 张树立. 骨骼肌衰老主要生理变化及运动的多机制调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1464-1475.
[6]	吕晓凡, 黄懿, 丁留成. 糖尿病膀胱病的线粒体机制与干预治疗[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1508-1515.
[7]	刘煜, 雷森林, 周锦涛, 刘辉, 李先辉. 有氧和抗阻运动改善肥胖相关认知障碍的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1171-1183.
[8]	王正业, 刘万林, 赵振群. miRNA在激素诱导股骨头坏死机制中的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1207-1214.
[9]	包卓玛, 侯孜明, 江露, 李玮怡, 张宗星, 刘道忠, 袁林. 枫杨总黄酮调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移及凋亡的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(4): 816-823.
[10]	穆秉桃, 郭敏芳, 胡芬琦, 刘淇源, 贾辉, 徐明源, 陈佳媛, 张慧宇, 孟涛, 尉杰忠. 雷公藤甲素缓解过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡的线粒体动力学机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(34): 8986-8993.
[11]	王正业, 刘万林, 赵振群. 血管内皮生长因子A 靶向调控血管化治疗激素性股骨头坏死的机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(3): 671-679.
[12]	夏天戈, 周毅, 李绍烁, 王建伟, 邵阳. 人参有效成分治疗骨骼肌肉退行性疾病的相关信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(29): 7639-7647.
[13]	成彦, 阳一丹, 李志鹏, 刘又文, 郭珈宜, 岳辰. 股骨头坏死愈胶囊缓解激素性股骨头坏死大鼠外周痛觉敏化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(29): 7512-7519.
[14]	张治龙, 王海英, 马风华, 侯彦杰. 调控髓核细胞线粒体动力学平衡抑制髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(29): 7520-7528.
[15]	汪陈莫及, 吴亚东, 高迪, 王浩, 李念虎. 山柰酚调控线粒体自噬抑制大鼠椎间盘退变的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(29): 7529-7538.